これらの研究は、腸上皮の配向特異的研究を行うために堅牢で再現可能なモデルシステムを提供することを目的としています。アプリカルオルガノイドは、高い数で生成され、高スループットスクリーニングのための約束を保持することができます。モノレイヤーは操作が容易で、補助的な標識と基礎標識の両方へのアクセスを提供します。
オルガノイドのサイズは、反転プロトコルを開始する前に直径150〜250マイクロメートルであることを確認してください。ECMドームを破壊することなく、オルガノイドを含む各ウェルから慎重に培地を取り除き、廃棄します。各ウェルに氷冷解離液を1ミリリットル加え、室温でプレートを1分間インキュベートします。
コーティングされた先端でゆっくりとピペットを入れてドームを慎重に取り除き、オルガノイドを破壊して断片化しないように注意してください。オルガノイド懸濁液をアンチ付着液で処理したプレートに移し、プレートを摂氏4度のシェーカーの上に30分間置きます。30分後にプレートを取り出し、抗付着液でコーティングした1ミリリットルのピペットチップを使用して溶液を上下に軽くピペットします。
さらに30分間、シェーカーの上に4°Cのプレートを置きます。プレートを取り外し、オルガノイドを室温で1〜2分間重力で落ち着かせる。オルガノイドが落ち着いたら、解離液をできるだけ多く取り出し、1.5ミリリットルのDMEM F-12を加えて洗浄します。
オルガノイドを堆積させ、上清を取り除く。その後、洗浄を繰り返します。できるだけ多くのDMEM F-12を取り除き、腸オルガノイド拡張培地の0.5ミリリットルを追加します。
摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩インキュベート。翌日は、プレートを25〜30度の角度で傾け、懸濁したオルガノイドを除去しないように注意して、よく壁に沿って媒体を取り除くことによって、部分的な培地の変化を行う。0.4ミリリットルの腸器官拡張培地を加え、摂氏37度、炭酸ガス5%で3日間インキュベートします。
凝集体が形成された場合は、プレートの底部に先端の端部を押しながら20回上下にピペットをピペット化することによって凝集物を剪断するために、抗付着溶液でコーティングされた1ミリリットルのピペットチップを使用する。オルガノイドを再中断するために、事前に温めた0.05%トリプシン-EDTAの1ミリリットルを加えます。そして、均一な懸濁液を確保するために徹底的に混ぜます。
多数の細胞に対して、または大量のECMが残っている場合は、トリプシン-EDTAの追加1ミリリットルまで追加します。摂氏37度で5~10分間インキュベートし、1ミリリットルのピペットを十分に混ぜてオルガノイドを破壊し、単一の細胞または小さな断片に完全に解き分けます。断片またはオルガノイド全体を完全に解心するには、トリプシン-EDTAを摂氏37度でさらに3〜5分間インキュベーションを続ける。
オルガノイドが十分に解着したら、DMEM F-12とピペットの同じ体積を加え、十分に混合します。セルに 10%FBS を加えてトリプシン EDTA を無効にします。200倍Gの遠心分離機片を摂氏2~8度で5分間5分間。
解体されたオルガノイドがペレットに失敗した場合、細胞を上下にピペット化して完全に混合し、再び遠心分離します。できるだけ多くの上清を慎重に除去してください。細胞ペレットのみを残します。
播種される各ウェルのための腸オルガノイド分化培地の100マイクロリットルで細胞を再懸濁する。大きいか小さいウェルサイズに適した音量を調整します。インキュベーターからコーティングされたプレートを取り出し、各ウェルから余分な基質膜マトリックス溶液を取り除きます。
各細胞培養挿入物の上部ウェルに細胞懸濁液の100マイクロリットルを加え、腸内オルガノイド分化培地の500マイクロリットルを下ウェルに加える。その後、摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。上下の井戸の両方で媒体を2〜3日ごとに交換してください。
上側および下層のウェルから培地を除去するALI培養を確立し、上ウェルウェルを空のままにして下ウェルに新鮮な腸器官分化培地を加える。腸管オルガノイド培養培地で培養した腸内オルガノイドは嚢胞形態を呈した。ECMが除去されると、一部のオルガノイドは最初の3日間に凝集する傾向があり、オルガノイド数を増やすために給紙する必要があります。
ECMで培養された腸内オルガノイドは、二次的な出芽構造の自発的な形成を拡大し、示し続けた。細胞外マトリックスがない場合に5日間維持されたオルガノイドは、細長く、嚢胞性、および不規則な形態を示した。非定型マーカーの発現は、例えば、絨毛およびZO−1のような、培地に曝露された上皮の外側を検出した。
ECM埋め込まれたオルガノイドは、核、ビリン、およびZO-1のために染色され、アピカル側がオルガノイドの内腔に直面している有端基底極性を示す。一旦単層を確立した細胞は、密接合とコンフルエント層を形成した。コンフルエント層はまた、上皮の上端側にブラシ境界を含むその絨毛を配向し、細胞間にZO-1マルチタンパク質複合体を形成する。
分泌されたムチンタンパク質MUC2の染色によって可視化されたより顕著なゴブレット細胞でALI培養への移行は、オルガノイドを破壊または断片化することなく、すべてのECMを除去することが重要である。中断されたオルガノイドを取り除かないように、メディアの変更も注意して行う必要があります。単層培養を確立するのに十分な単一細胞があることを保証することは、その品質の主要な決定要因である。
栄養吸収や宿主病原体の相互作用などのアプリカル固有の機能は、研究者のニーズに合った関連システムで研究できるようになりました。
