이러한 연구는 장 상피의 방향 특정 연구를 수행하기 위해 강력하고 재현 가능한 모델 시스템을 제공하는 것을 목표로합니다. Apical organoids는 높은 숫자로 생성되고 높은 처리량 검열을 위한 약속을 보유할 수 있습니다. 단층은 조작하기 쉽고 정문 및 기저 표지판 모두에 대한 액세스를 제공합니다.
오노이드의 크기가 반전 프로토콜을 시작하기 전에 직경이 150 내지 250 마이크로미터인지 확인하십시오. ECM 돔을 방해하지 않고 유기체를 함유한 각 우물에서 배지를 조심스럽게 제거하고 폐기하십시오. 각 우물에 얼음 차가운 해리 용액 1 밀리리터를 추가하고 1 분 동안 실온에서 접시를 배양하십시오.
코팅 된 팁으로 천천히 파이프를 사용하여 조심스럽게 돔을 빠져 나오며 오르가노이드를 방해하고 조각화하지 않도록주의하십시오. 오르가노이드 서스펜션을 안티 준수 용액으로 처리한 플레이트로 옮기고 플레이트를 섭씨 4도에서 30분 동안 쉐이커에 놓습니다. 30분 후 플레이트를 제거하고 용액을 위아래로 부드럽게 피펫하여 안티 준수 용액으로 코팅된 1밀리리터 파이펫 팁을 사용합니다.
셰이커에 접시를 섭씨 4도에서 30분간 더 놓습니다. 접시를 제거하고 오르가노이드가 실온에서 1~2분 동안 중력에 의해 정착하게 하십시오. 오르가노이드가 정착한 후 가능한 한 많은 해리 용액을 제거하고 DMEM F-12의 1.5 밀리리터를 추가하여 세척하십시오.
유기체가 퇴적물을 허용하고 상체를 제거합니다. 그런 다음 세척을 반복합니다. DMEM F-12를 최대한 많이 제거하고 장 장기 확장 배지0.5 밀리리터를 추가합니다.
하룻밤 사이에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다. 다음 날 플레이트를 25 내지 30도 각도로 기울이고 웰의 벽을 따라 배지를 제거하여 부분적인 중간 변화를 수행하여 일시 중단된 오르가노이드를 제거하지 않도록 주의한다. 장 가구 확장 매체의 0.4 밀리리터를 추가하고 3 일 동안 섭씨 37도및 5 %의 이산화탄소에서 배양하십시오.
골재가 형성된 경우 안티 부착 용액으로 코팅된 1밀리리터 파이펫 팁을 사용하여 팁의 끝을 플레이트 의 바닥으로 누르면서 20배 위아래로 피펫을 피펫하여 응집체를 전단합니다. 사전 따뜻하게 된 0.05 %의 트립신-EDTA의 밀리리터 1 밀리리터를 추가하여 오르가노이드를 다시 일시 중단합니다. 그리고 균일 한 서스펜션을 보장하기 위해 철저하게 혼합.
많은 수의 세포에 대해 트립신-EDTA의 추가 1 밀리리터를 추가하거나 상당한 양의 ECM이 남아 있는 경우. 섭씨 37도에서 5~10분 동안 배양한 다음, 1밀리리터 파이펫과 철저히 섞어 오르가노이드를 방해하여 단일 세포 나 작은 조각으로 완전히 해리됩니다. 파편이나 전체 오르가노이드를 완전히 분리하기 위해 트립신-EDTA를 37°C에서 3~5분 동안 배양을 계속합니다.
오르가노이드가 충분히 해리되면 DMEM F-12의 동일한 볼륨을 추가하고 파이펫을 위아래로 사용하여 완전히 섞습니다. 세포에 10%의 FBS를 추가하여 트립신-EDTA를 비활성화합니다. 원심분리기는 섭씨 2~8도에서 5분간 200배 G로 조각됩니다.
해리된 오르가노이드가 펠릿을 혼합하지 못하면 위아래로 파이프를 섞어 세포를 다시 원심분리합니다. 가능한 한 많은 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 셀 펠릿만 남깁니다.
각 웰을 위해 장 기관성 분화 배지의 100 마이크로리터에서 세포를 재중단하여 종자를 한다. 더 크거나 작은 웰 크기에 맞게 볼륨을 적절하게 조정합니다. 인큐베이터에서 코팅 된 플레이트를 제거하고 각 우물에서 과도한 지하 막 매트릭스 용액을 제거합니다.
각 세포 배양 삽입물의 상부 웰에 세포 현탁액 100마이크로리터와 장 기관성 분화 배지 500마이크로리터를 하부 우물에 첨가한다. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 2~3일마다 상하웰모두에서 배지를 교체한다.
ALI 배양을 확립하기 위해 상하우물에서 배지를 제거하고, 상하부에 신선한 장 가가노이드 분화 배지를 추가하여 상부웰이 비어 있다. 장 기관가성 확장 매체로 배양된 장 기관가노이드는 낭포성 형태를 나타냈다. ECM이 제거되면 일부 오르가노이드는 처음 3 일 동안 집계하는 경향이 있으며 오르가노이드 수를 증가시키기 위해 깎아해야합니다.
ECM에서 배양된 장 내 오르가노이드는 이차 신진 구조물의 자발적인 형성을 지속적으로 확장하고 전시하였다. 유기체는 세포외 매트릭스가 없는 상태에서 5일 동안 유지되어 길쭉한 낭포성 및 불규칙한 형태를 나타냈다. 빌린 및 ZO-1과 같은 비정형 마커의 발현은 배지에 노출된 상피의 외부면을 검출하였다.
핵, 빌린 및 ZO-1에 얼룩진 ECM 임베디드 내장 된 오르가노이드는 정액 측이 오르가노이드의 루멘을 향하고 있는 정색기 극성을 보여줍니다. 단층이 확립되면 세포가 단단한 접합과 컨할수 있는 층을 형성하였다. 컨물류 층은 또한 붓 테두리를 함유한 빌린을 상피의 정색 면쪽으로 방향을 지정하여 세포 사이에 ZO-1 다중 단백질 복합체를 형성합니다.
분비된 뮤신 단백질 MUC2에 얼룩지게 하여 시각화된 보다 눈에 띄는 잔 세포로의 ALI 배양으로의 전환은 오르가노이드를 방해하거나 단편화하지 않고 모든 ECM을 제거하는 것이 중요하다. 미디어 변경은 또한 중단된 오르가노이드를 제거하는 것을 피하기 위하여 주의해서 행해져야 합니다. 단층 배양의 확립을 위한 충분한 단일 세포가 있는지 확인하는 것은 그것의 질의 중요한 결정요인입니다.
영양 흡수 또는 호스트 병원체 상호 작용과 같은 Apical 특정 기능은 이제 연구원의 요구에 맞는 관련 시스템에서 공부할 수 있습니다.
