Disse studiene tar sikte på å gi robuste og reproduserbare modellsystemer for å utføre orienteringsspesifikke studier av tarmepitelet. Apikale organoider kan genereres i høye tall og holde løfte om høy gjennomstrømningsscreening. Monolayers er lettere å manipulere og gir tilgang til både apikale og basale tegn.
Pass på at størrelsen på organoidene er 150 til 250 mikrometer i diameter før du begynner inversjonsprotokollen. Fjern og kast forsiktig mediet fra hver brønn som inneholder organoider uten å forstyrre ECM-kuppelen. Tilsett en milliliter iskald dissosiasjonsløsning til hver brønn og inkuber platen ved romtemperatur i ett minutt.
Løsne forsiktig kuplene ved å pipetter sakte med en belagt spiss, pass på å ikke forstyrre og fragmentere organoidene. Overfør den organoide suspensjonen til en plate behandlet med anti-tilslutningsløsning og legg platen på en shaker ved fire grader Celsius i 30 minutter. Etter 30 minutter fjern platen og rør oppløsningen forsiktig opp og ned ved hjelp av en en milliliter pipettespiss belagt med anti-tilslutningsløsning.
Plasser platen på shakeren ved fire grader Celsius i ytterligere 30 minutter. Fjern platen og la organoidene slå seg ned med tyngdekraften i ett til to minutter ved romtemperatur. Etter at organoidene har lagt seg, fjern så mye av dissosiasjonsløsningen som mulig og vask dem ved å legge til 1,5 milliliter DMEM F-12.
La organoidene sedimentere og fjern supernatanten. Gjenta deretter vasken. Fjern så mye av DMEM F-12 som mulig og tilsett 0,5 milliliter intestinal organoid ekspansjonsmedium.
Inkuber over natten ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Neste dag utfører en delvis middels endring ved å vippe platen i en 25 til 30 graders vinkel og fjerne medium langs veggen av brønnen, og pass på at du ikke fjerner suspenderte organoider. Tilsett 0,4 milliliter intestinal organoid ekspansjonsmedium og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i tre dager.
Hvis aggregater har dannet seg, bruk en pipettespiss med én milliliter belagt med anti-tilhengerløsning for å skjære aggregatene ved å pipettere opp og ned 20 ganger mens du trykker enden av spissen til bunnen av platen. Tilsett en milliliter forvarmede 0,05% Trypsin-EDTA til resuspend organoider. Og bland grundig for å sikre en jevn suspensjon.
Legg opp til en ekstra milliliter Trypsin-EDTA for et stort antall celler, eller hvis en betydelig mengde ECM forblir. Inkuber ved 37 grader Celsius i fem til 10 minutter, bland deretter grundig med en milliliter pipette for å forstyrre organoidene slik at de er helt dissosiert i enkeltceller eller små fragmenter. For å fullstendig dissosiere fragmenter eller hele organoider fortsetter inkubasjonen med Trypsin-EDTA ved 37 grader Celsius i ytterligere tre til fem minutter.
Når organoidene er tilstrekkelig dissosiert, legg til et likt volum DMEM F-12 og pipette opp og ned for å blande grundig. Deaktiver Trypsin-EDTA ved å legge til 10 % FBS i cellene. Sentrifugefragmenter ved 200 ganger G i fem minutter ved to til åtte grader Celsius.
Hvis de dissosierte organoidene ikke klarte å pellet blande cellene grundig ved å pipettere opp og ned og sentrifugere dem igjen. Fjern forsiktig så mye supernatant som mulig. forlater bare cellepellet.
Resuspend cellene i 100 mikroliter av intestinal organoid differensiering medium for hver brønn som skal frøs. Justere volumet på riktig måte for større eller mindre brønnstørrelser. Fjern de belagte platene fra inkubatoren og fjern overflødig kjellermembranmatriseoppløsning fra hver brønn.
Tilsett 100 mikroliter av cellefjæringen til den øvre brønnen av hver cellekulturinnsats og 500 mikroliter intestinal organoid differensieringsmedium til den nedre brønnen. Deretter inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Bytt ut mediet i både øvre og nedre brønn annenhver til tredje dag.
For å etablere en ALI-kultur fjern medium fra de øvre og nedre brønnene, og tilsett fersk intestinal organoid differensieringsmedium til den nedre brønnen, slik at den øvre brønnen er tom. Intestinale organoider dyrket med intestinal organoid ekspansjonsmedium viste en cystisk morfologi. Når ECM fjernes, har noen organoider en tendens til å aggregere i løpet av de første tre dagene og må være ren på for å øke organoidtallet.
Intestinale organoider dyrket i ECM fortsatte å utvide og vise spontan dannelse av sekundære spirende strukturer. Organoider opprettholdt i fem dager i fravær av ekstracellulær matrise utstilt langstrakt, cystisk og uregelmessig form. Uttrykket av atypiske markører, som villin og ZO-1, ble oppdaget på yttersiden av epitelet som ble utsatt for mediet.
ECM innebygde organoider farget for kjerner, villin og ZO-1 demonstrerer en apikal basal polaritet der den apikale siden var vendt mot lumen av organoiden. Når monolayeren ble etablert, dannet cellene tette koblinger og et konfluentlag. Det flytende laget orienterer også sin villin som inneholder børstekant mot den apikale siden av epitelet, og danner ZO-1 multiproteinkomplekser mellom celler.
Overgang til en ALI-kultur induserte ytterligere differensiering med mer fremtredende begerceller som ble visualisert ved farging for det utskilte mucinproteinet MUC2 For å indusere polaritetsinversjon er det avgjørende å fjerne all ECM uten å forstyrre eller fragmentere organoidene. Medieendringer bør også gjøres med forsiktighet for å unngå å fjerne noen av de suspenderte organoidene. Å sikre at det er tilstrekkelige enkeltceller for etableringen av monolayerkulturen er en stor determinant av kvaliteten.
Apikale spesifikke funksjoner som næringsopptak eller vertskap for patogeninteraksjoner kan nå studeres i relevante systemer som passer forskernes behov.