Dessa studier syftar till att tillhandahålla robusta och reproducerbara modellsystem för att utföra orienteringsspecifika studier av tarmepiteleriet. Apatiska organoider kan genereras i högt antal och hålla löfte om screening med hög genomströmning. Monolayers är lättare att manipulera och erbjuder tillgång till både apatiska och basala tecken.
Se till att storleken på organoiderna är 150 till 250 mikrometer i diameter innan inversionsprotokollet påbörjas. Avlägsna försiktigt och kassera mediet från varje brunn som innehåller organoider utan att störa ECM-kupolen. Tillsätt en milliliter iskall dissociationslösning till varje brunn och inkubera plattan vid rumstemperatur i en minut.
Lossa försiktigt kupolerna genom att pipetting långsamt med en belagd spets, var noga med att inte störa och fragmentera organoiderna. Överför den organoida suspensionen till en platta som behandlats med anti-vidhäftningslösning och placera plattan på en skakapparat vid fyra grader Celsius i 30 minuter. Efter 30 minuter ta bort plattan och pipetten försiktigt lösningen upp och ner med en milliliter pipettspets belagd med anti vidhäftningslösning.
Placera plattan på skakapparaten vid fyra grader Celsius i ytterligare 30 minuter. Ta bort plattan och låt organoiderna sätta sig genom gravitationen i en till två minuter vid rumstemperatur. När organoiderna har lagt sig, ta bort så mycket av dissociationslösningen som möjligt och tvätta dem genom att tillsätta 1,5 milliliter DMEM F-12.
Låt organoiderna sedimentera och ta bort supernaten. Upprepa sedan tvätten. Ta bort så mycket av DMEM F-12 som möjligt och tillsätt 0,5 milliliter tarmorganoidexpansionsmedium.
Inkubera över natten vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Följande dag utför en partiell medium förändring genom att luta plattan i en 25 till 30 graders vinkel och ta bort medium längs brunnens vägg och var noga med att inte ta bort upphängda organoider. Tillsätt 0,4 milliliter tarmorganoidexpansionsmedium och inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i tre dagar.
Om aggregat har bildats, använd en en milliliter pipettspets belagd med anti vidhäftande lösning för att avsjuta aggregaten genom att leda upp och ner 20 gånger samtidigt som spetsens ände pressas till botten av plattan. Tillsätt en milliliter förvärmda 0,05%Trypsin-EDTA till återanvända organoider. Och blanda noggrant för att säkerställa en jämn suspension.
Lägg till ytterligare en milliliter Trypsin-EDTA för ett stort antal celler, eller om en betydande mängd ECM återstår. Inkubera vid 37 grader Celsius i fem till tio minuter och blanda sedan noggrant med en en milliliter pipett för att störa organoiderna så att de är helt dissocierade i enstaka celler eller små fragment. För att helt skilja fragment eller hela organoider fortsätter inkubationen med Trypsin-EDTA vid 37 grader Celsius i ytterligare tre till fem minuter.
När organoiderna är tillräckligt dissocierade tillsätt en lika stor volym DMEM F-12 och pipett upp och ner för att blandas noggrant. Inaktivera Trypsin-EDTA genom att lägga till 10%FBS i cellerna. Centrifugfragment vid 200 gånger G i fem minuter vid två till åtta grader Celsius.
Om de dissocierade organoiderna misslyckades med att pellets blanda cellerna noggrant genom att pipetting upp och ner och centrifugera dem igen. Ta försiktigt bort så mycket supernatant som möjligt. lämnar bara cellpelleten.
Återanvänd cellerna i 100 mikroliter av intestinala organoid differentiering medium för varje brunn som ska sås. Justera volymen på lämpligt sätt för större eller mindre brunnsstorlekar. Ta bort de belagda plattorna från inkubatorn och ta bort överskottet av källarmembranmatrislösningen från varje brunn.
Tillsätt 100 mikroliter av cellupphängningen till den övre brunnen i varje cellkulturinsats och 500 mikroliter intestinalt organoid differentieringsmedium till den nedre brunnen. Inkubera sedan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Byt ut mediet i både de övre och nedre brunnarna varannan till var tredje dag.
För att upprätta en ALI-kultur ta bort medium från de övre och nedre brunnarna och tillsätt färskt tarmorganoid differentieringsmedium till den nedre brunnen och lämna den övre brunnen tom. Intestinala organoider odlade med intestinala organoid expansion medium uppvisade en cystisk morfologi. När ECM avlägsnas tenderar vissa organoider att aggregera under de första tre dagarna och måste vara ren för att öka antalet organoider.
Intestinala organoider odlade i ECM fortsatte att expandera och uppvisar spontana bildandet av sekundära spirande strukturer. Organoider upprätthålls i fem dagar i avsaknad av extracellulär matris uppvisade långsträckta, cystic och oregelbundna former. Uttrycket av atypiska markörer, såsom villin och ZO-1 upptäcktes den yttre sidan av epitel som utsattes för mediet.
ECM inbäddade organoider färgade för atomkärnor, villin och ZO-1 visar en apical basal polaritet där den apatiska sidan var vänd mot lumen i organoiden. När monoskiktet var etablerade celler bildade snäva korsningar och ett sammanflöde skikt. Det sammanflödesskiktet orienterar också sin villin som innehåller penselkant mot epitelens apatiska sida och bildar ZO-1 multiproteinkomplex mellan celler.
Övergång till en ALI-kultur inducerad ytterligare differentiering med mer framträdande bägare celler som visualiserades genom färgning för det utsöndrade mucin proteinet MUC2 Att inducera polaritet inversion är det viktigt att ta bort all ECM utan att störa eller fragmentera organoiderna. Medieförändringar bör också göras med försiktighet för att undvika att någon av de suspenderade organoiderna avlägsnas. Att se till att det finns tillräckligt med enstaka celler för att etablera monoskiktskulturen är en viktig avgörande faktor för dess kvalitet.
Apatiska specifika funktioner som näringsabsorption eller värdpatogeninteraktioner kan han nu studera i relevanta system som passar forskarnas behov.