Bu çalışmalar, bağırsak epitelinin oryantasyona özgü çalışmalarını gerçekleştirmek için sağlam ve tekrarlanabilir model sistemleri sağlamayı amaçlamaktadır. Apikal organoidler yüksek sayılarda üretilebilir ve yüksek verim taraması için söz verebilir. Monolayerlerin manipüle edilmesi daha kolaydır ve hem apikal hem de bazal işaretlere erişim sunar.
İnversiyon protokolüne başlamadan önce organoidlerin boyutunun 150 ila 250 mikrometre çapında olduğundan emin olun. ECM kubbesini bozmadan ortamı her bir kuyudan dikkatlice çıkarın ve atın. Her kuyuya bir mililitre buz gibi ayrışma çözeltisi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırın.
Organoidleri bozmamaya ve parçalamamaya özen ederek, kaplamalı bir uçla yavaşça pipetleyarak kubbeleri dikkatlice yerinden sökün. Organoid süspansiyonu yapışma önleyici çözelti ile tedavi edilen bir tabağa aktarın ve plakayı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede bir çalkalayıcıya yerleştirin. 30 dakika sonra plakayı çıkarın ve yapışma önleyici çözelti ile kaplanmış bir mililitre pipet ucu kullanarak çözeltiyi hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
Plakayı 30 dakika daha dört santigrat derecede çalkalayıcıya yerleştirin. Plakayı çıkarın ve organoidlerin oda sıcaklığında bir ila iki dakika yerçekimi ile yerleşmesine izin verin. Organoidler yerleştikten sonra, dissosiyelasyon çözeltisinin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve 1,5 mililitre DMEM F-12 ekleyerek yıkayın.
Organoidlerin çökeltilmesine ve süpernatantı çıkarmasına izin verin. Sonra yıkamayı tekrarlayın. DMEM F-12'nin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve 0,5 mililitre bağırsak organoid genleşme ortamı ekleyin.
Gece boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatır. Ertesi gün plakayı 25 ila 30 derecelik bir açıyla yatırarak ve askıya alınmış organoidleri çıkarmamaya özen göstererek kuyunun duvarı boyunca ortayı çıkararak kısmi bir orta değişiklik yapın. 0.4 mililitre bağırsak organoid genleşme ortamı ekleyin ve üç gün boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın.
Agregalar oluşmuşsa, ucun ucunu plakanın altına bastırırken 20 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak agregaları yammak için yapışmayan çözelti ile kaplanmış bir mililitre pipet ucu kullanın. Organoidleri yeniden hayata geçirmek için önceden ısıtılmış bir mililitre %0,05 Trypsin-EDTA ekleyin. Ve eşit bir süspansiyon sağlamak için iyice karıştırın.
Çok sayıda hücre için veya önemli miktarda ECM kalırsa, bir mililitreye kadar Trypsin-EDTA ekleyin. 37 santigrat derecede 5 ila 10 dakika kuluçkaya yaslanın, sonra organoidleri bozmak için bir mililitre pipetle iyice karıştırın, böylece tek hücrelere veya küçük parçalara tamamen dağılırlar. Parçaları veya tüm organoidleri tamamen ayırmak için Trypsin-EDTA ile inkübasyona 37 santigrat derecede üç ila beş dakika daha devam edin.
Organoidler yeterince ayrıştıktan sonra eşit miktarda DMEM F-12 ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Hücrelere %10 FBS ekleyerek Trypsin-EDTA'yı devre dışı bırak. 200 kez G'de 200 derece, iki ila sekiz santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj parçaları.
Eğer ayrışmış organoidler peletlemeyi başaramazlarsa, hücreleri yukarı ve aşağı borulayarak iyice karıştırın ve tekrar santrifüj edin. Mümkün olduğunca fazla süpernatant dikkatlice çıkarın. Sadece hücre peletini bırakıyor.
Hücreleri, tohumlanacak her kuyu için 100 mikrolitre bağırsak organoid farklılaşma ortamında yeniden depolar. Ses seviyesini daha büyük veya daha küçük kuyu boyutları için uygun şekilde ayarlama. Kaplamalı plakaları inkübatörden çıkarın ve her kuyudan fazla bodrum membran matris çözeltisini çıkarın.
Her hücre kültürü kesici ucunun üst kuyusuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ve alt kuyuya 500 mikrolitre bağırsak organoidi farklılaşma ortamı ekleyin. Daha sonra 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte kuluçkaya yatırın. Ortamı her iki ila üç günde bir hem üst hem de alt kuyularda değiştirin.
Bir ALI kültürü oluşturmak için ortayı üst ve alt kuyulardan çıkarın ve alt kuyuya taze bağırsak organoid farklılaşma ortamını ekleyin ve üst kuyuyu boş bırakın. Bağırsak organoid genleşme ortamı ile kültürlenen bağırsak organoidleri kistik morfoloji sergiledi. ECM çıkarıldığında, bazı organoidler ilk üç gün boyunca toplanma eğilimindedir ve organoid sayısını artırmak için saflaştırılması gerekir.
ECM'de kültüre edilen bağırsak organoidleri, ikincil tomurcuklanma yapılarının kendiliğinden oluşumunu genişletmeye ve sergilemeye devam etti. Hücre dışı matris yokluğunda beş gün boyunca tutulan organoidler uzun, kistik ve düzensiz formlar sergiledi. Villin ve ZO-1 gibi atipik belirteçlerin ekspresyumu, epitelin ortama maruz kalan dış tarafında tespit edildi.
Ecm gömülü organoidler çekirdek, villin ve ZO-1 için lekeli, apikal tarafın organoidin lümenine bakan apikal bazal polariteyi gösteriyor. Monolayer kurulduktan sonra hücreler sıkı kavşaklar ve birleştiği bir tabaka oluşturdu. Birleştiği tabaka ayrıca fırça kenarlığı içeren villinini epitelin apikal tarafına doğru yönlendirerek hücreler arasında ZO-1 çoklu protein kompleksleri oluşturur.
Bir ALI kültürüne geçiş, salgılanan musin proteini MUC2 için boyanarak görselleştirilen daha belirgin kadeh hücreleri ile daha fazla farklılaşmaya neden olur Polarite inversiyonunu teşvik etmek için organoidleri bozmadan veya parçalamadan tüm ECM'yi çıkarmak çok önemlidir. Askıya alınan organoidlerden herhangi birinin çıkarılmaması için medya değişiklikleri de özenle yapılmalıdır. Monolayer kültürünün kurulması için yeterli tek hücrenin olmasını sağlamak kalitesinin önemli bir belirleyicisidir.
Besin emilimi veya konak patojen etkileşimleri gibi apikal spesifik işlevler artık araştırmacıların ihtiyaçlarına uygun ilgili sistemlerde çalışabiliyor.
