4.6K Views
•
11:02 min
•
February 8th, 2022
DOI :
February 8th, 2022
•0:04
introduction
0:54
Natural Killer (NK) Cell Expansion from Liver Tissues: Day 0
3:14
Primary Natural Killer (NK) Cell Expansion from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs): Day 0
4:34
Attachment of 293T Cells (Day 2) and Retrovirus Transfection (Day 3)
5:58
Retronectin Plate-Coating (Day 3) and Transduction (Day 4)
8:18
CAR-NK Cells Collection (Day 6 or 7)
9:04
Results: Expansion of PBNK Cells and Flow Cytometric Analysis of CAR-NK Cells
10:22
Conclusion
Transcript
Denne protokol kan betydeligt forbedre udvidelsen af funktionelle, ikke-udtømmende, hukommelseslignende NK-celler ex vivo sammenlignet med andre feederceller baseret på ekspansionssystem. Dette er en enklere metode sammenlignet med andre protokoller, der bruger feederceller, hvor vi springer NK-celleisoleringstrinnet over før NK-celleudvidelse. Denne protokol kan give et tilstrækkeligt antal NK-celler og CAR-NK til immunterapi.
Denne teknik er meget reproducerbar. Det er imidlertid afgørende at bruge friske, nye udgangsmaterialer og passe på ikke at forstyrre NK-cellerne i de første par dage af ekspansionen. Begynd med at identificere og sektionere de levedygtige vævsområder ved hjælp af sterilt kirurgisk udstyr til at opnå lymfocytter.
Placer derefter det sektionerede væv i 30 ml HBSS uden calcium eller magnesium og hold vævet på is, indtil det er klar til isolering. Arbejd inde i et biosikkerhedsskab, hak vævet i mindre end 0,5 centimeter terninger med sterile barberblade og tang. Anbring de hakkede vævsstykker, ikke mere end 4 gram, i vævsdissociatorrørene og tilsæt 10 ml collagenase IV til vævsstykkerne.
For at hakke vævet grundigt skal du behandle vævsdissociatorrørene til en vævsdissociator ved 37 grader Celsius. Efter fjernelse af rørene fra vævsdissociatoren tritureres hakket væv gennem en 40 mikron nyloncellesi ved hjælp af backend på en 5 milliliter sprøjte. Kassér de store ufordøjede fragmenter.
Drej den opsamlede eluent ned ved 400G i 5 minutter ved stuetemperatur, og opsug supernatanten, før du genbruger cellepillerne i 30% polyvinylpyrrolidonbelagt silica for at fjerne fedtcellerne. Drej cellerne ned som beskrevet, før du genbruger cellepelleten i 9 ml R-10-medier. For at adskille lymfocytter fra røde blodlegemer og polymorfonukleære celler skal du omhyggeligt lægge cellesuspensionen over 4 ml Ficoll eller lymfocytseparationsmedie.
Adskil lagene ved centrifugering ved 400 G i 23 minutter ved stuetemperatur med accelerationen og bremserne slukket. Derefter dekanteres forsigtigt det øverste mellemlag og høstes interfasen indeholdende vævsinfiltrerende lymfocytter. Skyl cellerne med 10 ml medier og fortsæt til analyse eller primær naturlig dræber eller NK, celleudvidelsesprotokol.
De mononukleære celler i perifert blod eller PBMC'er og 100 gammabestrålede 221-mIL-21-celler vaskes separat ved centrifugering ved 400 G i 5 minutter med 10 ml R-10-medier. Efter centrifugering gemmes 1 x 10 til 6. PBMC'er til flowcytometri og blandes 5 x 10 til de 6. PBMC'er med 10 x 10 til 6. 100 gammabestrålede 221-mIL-21-celler i en speciel 6-brøndsplade. Tilsæt 30 ml R-10-medier suppleret med human interleukin-2 og human interleukin-15 til den samme 6-brønds plade og inkuber pladen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid, med udskiftning af mediet hver 3. til 4. dag.
Mens du er i inkubation, skal du registrere den samlede perifere blod naturlige dræber eller PBNK, cellenummer levedygtighed og udføre flowcytometri hver 3. til 4. dag for at beregne NK-celleudvidelseshastigheden. Tilsæt 1,8 x 10 til de 6. 293T-celler i 11 ml D-10-mediet pr. behandlet 100 millimeter plade og inkuber 293T-celler ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. I et 1,70 ml rør blandes 470 mikroliter af det reducerede serummedie med 30 mikroliter transfektionsreagens.
I et separat 1,70 milliliter rør tilsættes 2,5 mikrogram pRDF-plasmid, 3,75 mikrogram Pegpam3-plasmid og 2,5 mikrogram CAR-konstruktion i SFG-vektor i det reducerede serummedie for at gøre det endelige volumen på 500 mikroliter. Bland indholdet af røret med 1,70 ml røret fremstillet tidligere på en dråbevis måde. Efter 15 minutters inkubation ved stuetemperatur tilsættes 1 ml af blandingen fra røret til 293T-cellepladen dråbevis og pladen anbringes ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 48 til 72 timer.
Fortynd retronectinproteinet med PBS til en endelig koncentration på 50 til 100 mikrogram pr. milliliter. Der tilsættes 500 mikroliter fortyndet retronectin i hver brønd på en ubehandlet 24-brøndsplade. Forsegl derefter pladen ved hjælp af parafilm og inkuber pladen ved 4 grader Celsius natten over.
Den næste dag centrifugeres retronectinpladen ved 2, 103G i 30 minutter ved 4 grader Celsius og kasseres supernatanten. Efter blokering af hver brønd i 24-brøndpladen med 1 milliliter R-10-medium, inkuberes pladen ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 1 time. Filtrer de tidligere transficerede 293T-celler ved hjælp af et 0,45 mikron filter til opsamling af retrovirussupernatanten.
Aliquot 2 ml af den filtrerede retrovirus supernatant i hver brønd af 24-brønd retronectin pladen. Centrifuge den 24-brønds retronectinplade ved 2, 103G i 2 timer i en forvarmet centrifuge ved 32 grader Celsius. Mens pladerne centrifugeres, samles de udvidede PBNK-celler fra dag 0 og tæller cellerne ved hjælp af Trypan Blue.
Fortynd de ekspanderede PBNK-celler med R-10-medier suppleret med interleukin-2 og interleukin-15 til koncentrationen 2,5 x 10 til 5. til 5 x 10 til 5. celler pr. milliliter. Efter centrifugering af 24-brønds retronectinpladen aspireres retrovirussupernatanten delvist fra hver brønd. Derefter tilsættes 2 ml af de fortyndede ekspanderede PBNK-celler til hver brønd.
Centrifuger pladen ved 600 G i 10 minutter ved 32 grader Celsius, før pladen inkuberes ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i 48 til 72 timer. Overfør cellerne fra 24-brøndspladen til et 50 milliliter centrifugerør for at centrifuge røret ved 400G i 5 minutter. Efter genanvendelse af pelleten med 1 milliliter R-10-medier, overføres de resuspenderede celler til en speciel 6-brøndsplade indeholdende 30 ml R-10-medier suppleret med interleukin-2 og interleukin-15.
Inkuber den specielle 6-brøndsplade ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid med forfriskende medier og beregn NK-celleudvidelseshastigheden hver 3. til 4. dag. PBNK-cellerne udvidet med 221-mIL-21 viste sig at udvide næsten 5 x 10 til 4. fold. Og NK-cellens renhed blev opretholdt på omkring 85% gennem hele 21-dages ekspansion.
Før udvidelsen blev robustheden af 221-mIL-21-ekspansionssystemet undersøgt ved farvning af PBMC'er til anti-CD56 og anti-CD3, som viste en cellerenhed på 7,09% for NK-celler og en høj procentdel af T-celler. På dag 4 af PBMC'er og 221-mIL-21 coculture blev NK-renheden kontrolleret før CAR-NK-transduktion. CAR-NK-cellerne farvet til anti-CD56, anti-CD3 og anti-human-IgG viste en høj NK-cellepopulation på dag 7, og der blev observeret en høj CAR-transduktionseffektivitet på ca. 70%.
På den 18. dag blev CAR-ekspressionen i forskellige delmængder kontrolleret med flowcytometri. Efter NK-celleudvidelse kan celler bruges til in vitro funktionelle assays eller til in vivo-eksperimenter. Forsker kan bruge denne protokol til at udvide NK og CAR-NK til patienter med funktionel NK-mangel samt andre arter, såsom hund.
Her præsenterer vi en metode til at udvide perifert blod naturlig dræber (PBNK), NK-celler fra levervæv og kimære antigenreceptor (CAR) -NK-celler afledt af perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) eller navlestrengsblod (CB). Denne protokol demonstrerer udvidelsen af NK- og CAR-NK-celler ved hjælp af 221-mIL-21 feederceller ud over den optimerede renhed af ekspanderede NK-celler.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved