यह प्रोटोकॉल विस्तार प्रणाली पर आधारित अन्य फीडर कोशिकाओं की तुलना में कार्यात्मक, गैर-संपूर्ण, मेमोरी जैसी एनके कोशिकाओं के विस्तार में काफी सुधार कर सकता है। फीडर कोशिकाओं का उपयोग करने वाले अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में यह एक सरल तरीका है जिसमें हम एनके सेल विस्तार से पहले एनके सेल अलगाव चरण को छोड़ देते हैं। यह प्रोटोकॉल इम्यूनोथेरेपी के लिए एनके सेल और सीएआर-एनके की पर्याप्त संख्या प्रदान कर सकता है।

यह तकनीक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। हालांकि, ताजा, नई शुरुआती सामग्री का उपयोग करना और विस्तार के पहले कुछ दिनों के दौरान एनके कोशिकाओं को परेशान नहीं करने का ध्यान रखना महत्वपूर्ण है। लिम्फोसाइटों को प्राप्त करने के लिए बाँझ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करके व्यवहार्य ऊतक क्षेत्रों की पहचान और विभाजन करके शुरू करें।

फिर, कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना 30 मिलीलीटर एचबीएसएस में विभाजित ऊतकों को रखें और अलगाव के लिए तैयार होने तक ऊतक को बर्फ पर रखें। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर काम करते हुए, ऊतक को बाँझ रेजर ब्लेड और फोर्सप्स के साथ 0.5 सेंटीमीटर से कम क्यूब्स में मिला लें। ऊतक विघटनकारी ट्यूबों में 4 ग्राम से अधिक नहीं, कीमा ऊतक के टुकड़े रखें और ऊतक के टुकड़ों में 10 मिलीलीटर कोलेजनेज IV जोड़ें।

ऊतक को अच्छी तरह से कीमा करने के लिए, ऊतक विघटनकारी ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक विघटनकर्ता में इलाज करें। ऊतक विघटनकर्ता से ट्यूबों को हटाने के बाद, 5 मिलीलीटर सिरिंज के बैकएंड का उपयोग करके 40-माइक्रोन नायलॉन सेल स्ट्रेनर के माध्यम से कीमा ऊतक को ट्राइट्यूरेट करें। बड़े बिना पचे हुए टुकड़ों को फेंक दें।

कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 जी पर एकत्र किए गए एलुएंट को घुमाएं और वसा कोशिकाओं को हटाने के लिए 30% पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन-लेपित सिलिका में सेल छर्रों को पुन: निलंबित करने से पहले सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें। 9 मिलीलीटर आर -10 मीडिया में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करने से पहले वर्णित कोशिकाओं को स्पिन करें। लाल रक्त कोशिकाओं और पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर कोशिकाओं से लिम्फोसाइटों को अलग करने के लिए, फिकॉल या लिम्फोसाइट पृथक्करण मीडिया के 4 मिलीलीटर पर सेल निलंबन को सावधानीपूर्वक परत करें।

त्वरण और ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 23 मिनट के लिए 400 जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग करके परतों को अलग करें। फिर, ऊपरी-मध्यम परत को सावधानीपूर्वक मोड़ें और ऊतक-घुसपैठ लिम्फोसाइटों वाले इंटरफेज़ की कटाई करें। कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर मीडिया के साथ कुल्ला करें और विश्लेषण या प्राथमिक प्राकृतिक हत्यारा, या एनके, कोशिका विस्तार प्रोटोकॉल के लिए आगे बढ़ें।

परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं, या पीबीएमसी, और 100 गामा-विकिरणित 221-एमआईएल -21 कोशिकाओं को 10 मिलीलीटर आर -10 मीडिया के साथ 5 मिनट के लिए 400 जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग से धोएं। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, फ्लो साइटोमेट्री के लिए 6 वें पीबीएमसी में 1 x 10 को सहेजें और 5 x 10 को 6 वें पीबीएमसी में 10 x 10 से 6 वें 100 गामा-विकिरणित 221-एमआईएल -21 कोशिकाओं के साथ एक विशेष 6-वेल प्लेट में मिलाएं। मानव इंटरल्यूकिन -2 और मानव इंटरल्यूकिन -15 के साथ पूरक आर -10 मीडिया के 30 मिलीलीटर को उसी 6-वेल प्लेट में जोड़ें और प्लेट को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, जिसमें हर 3 से 4 दिनों में मीडिया को प्रतिस्थापित किया जाए।

जबकि इनक्यूबेशन में, कुल परिधीय रक्त प्राकृतिक हत्यारा, या पीबीएनके, सेल नंबर व्यवहार्यता रिकॉर्ड करें और एनके सेल विस्तार दर की गणना करने के लिए हर 3 से 4 दिनों में फ्लो साइटोमेट्री करें। प्रति उपचारित 100 मिलीमीटर प्लेट पर डी -10 मीडिया के 11 मिलीलीटर में 6 वीं 293 टी कोशिकाओं में 1.8 x 10 जोड़ें और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 293 टी कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। 1.70 मिलीलीटर ट्यूब में, अभिकर्मक अभिकर्मक के 30 माइक्रोलीटर के साथ कम सीरम मीडिया के 470 माइक्रोलीटर मिलाएं।

एक अलग 1.70 मिलीलीटर ट्यूब में, 2.5 माइक्रोग्राम पीआरडीएफ प्लास्मिड, 3.75 माइक्रोग्राम पेगपाम 3 प्लास्मिड, और एसएफजी वेक्टर में 2.5 माइक्रोग्राम सीएआर निर्माण को कम सीरम मीडिया में जोड़ें ताकि 500 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा बनाई जा सके। ट्यूब की सामग्री को पहले तैयार किए गए 1.70 मिलीलीटर ट्यूब के साथ ड्रॉपवाइज तरीके से मिलाएं। कमरे के तापमान पर इनक्यूबेशन के 15 मिनट बाद, ट्यूब से 1 मिलीलीटर मिश्रण को 293 टी सेल प्लेट में ड्रॉपवाइज तरीके से जोड़ें और प्लेट को 48 से 72 घंटों के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

पीबीएस के साथ रेट्रोनेक्टिन प्रोटीन को 50 से 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। एक अनुपचारित 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला रेट्रोनेक्टिन के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर, पैराफिल्म का उपयोग करके प्लेट को सील करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।

अगले दिन, 2,103 जी पर रेट्रोनेक्टिन प्लेट को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें। 1 मिलीलीटर आर -10 माध्यम के साथ 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को अवरुद्ध करने के बाद, प्लेट को 1 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट एकत्र करने के लिए 0.45 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके पहले से स्थानांतरित 293 टी कोशिकाओं को फ़िल्टर करें।

24-वेल रेट्रोनेक्टिन प्लेट के प्रत्येक कुएं में फ़िल्टर किए गए रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट के 2 मिलीलीटर एलिकोट। 24-वेल रेट्रोनेक्टिन प्लेट को 2 घंटे के लिए 2,103 जी पर 32 डिग्री सेल्सियस पर प्री-वार्मेड सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज करें। जबकि प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज किया जा रहा है, दिन 0 से विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं को इकट्ठा करें और ट्रिपैन ब्लू का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।

इंटरल्यूकिन -2 और इंटरल्यूकिन -15 के साथ पूरक आर -10 मीडिया के साथ विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं को 2.5 x 10 से 5 वें से 5 वें कोशिकाओं प्रति मिलीलीटर तक पतला करें। 24-वेल रेट्रोनेक्टिन प्लेट के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्रत्येक कुएं से रेट्रोवायरस सुपरनैटेंट को आंशिक रूप से एस्पिरेटेड करें। फिर, प्रत्येक कुएं में पतला विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं के 2 मिलीलीटर जोड़ें।

प्लेट को 32 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 600 जी पर सेंट्रीफ्यूज करें और फिर 48 से 72 घंटों के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को इनक्यूबेट करें। 24-वेल प्लेट से कोशिकाओं को 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें ताकि ट्यूब को 5 मिनट के लिए 400 जी पर सेंट्रीफ्यूज किया जा सके। 1 मिलीलीटर आर -10 मीडिया के साथ गोली को पुन: निलंबित करने के बाद, पुन: निलंबित कोशिकाओं को एक विशेष 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें इंटरल्यूकिन -2 और इंटरल्यूकिन -15 के साथ पूरक 30 मिलीलीटर आर -10 मीडिया होता है।

ताज़ा मीडिया के साथ 37 डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर विशेष 6-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें और हर 3 से 4 दिनों में एनके सेल विस्तार दर की गणना करें। 221-एमआईएल -21 द्वारा विस्तारित पीबीएनके कोशिकाओं को लगभग 5 x 10 से 4 वीं सिलवटों तक विस्तारित करने के लिए दिखाया गया था। और एनके सेल शुद्धता को 21 दिनों के विस्तार के दौरान लगभग 85% पर बनाए रखा गया था।

विस्तार से पहले, एंटी-सीडी 56 और एंटी-सीडी 3 के लिए पीबीएमसी को धुंधला करके 221-एमआईएल -21 विस्तार प्रणाली की मजबूती की जांच की गई थी, जिसने एनके कोशिकाओं के लिए 7.09% की सेल शुद्धता और टी कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत को दिखाया था। पीबीएमसी और 221-एमआईएल -21 कोकल्चर के दिन, सीएआर-एनके ट्रांसडक्शन से पहले एनके शुद्धता की जांच की गई थी। एंटी-सीडी 56, एंटी-सीडी 3 और एंटी-ह्यूमन-आईजीजी के लिए सना हुआ सीएआर-एनके कोशिकाओं ने 7 वें दिन एक उच्च एनके सेल आबादी दिखाई और लगभग 70% की उच्च सीएआर ट्रांसडक्शन दक्षता देखी गई।

18 वें दिन, विभिन्न उपसमुच्चय में सीएआर अभिव्यक्ति को फ्लो साइटोमेट्री के साथ जांचा गया था। एनके सेल विस्तार के बाद, कोशिकाओं का उपयोग इन-विट्रो कार्यात्मक परख या इन-विवो प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल का उपयोग कार्यात्मक एनके की कमी वाले रोगियों के साथ-साथ कुत्ते जैसे अन्य प्रजातियों के लिए एनके और सीएआर-एनके का विस्तार करने के लिए कर सकते हैं।

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