이 프로토콜은 확장 시스템을 기반으로 하는 다른 영양세포에 비해 생체 외 기능적이고 완전하지 않은 기억과 유사한 NK 세포의 확장을 크게 개선할 수 있습니다. 이는 NK세포 확장 전에 NK세포 분리 단계를 건너뛰는 영양세포를 사용하는 다른 프로토콜에 비해 간단한 방법입니다. 이 프로토콜은 면역요법을 위한 충분한 수의 NK 세포 및 CAR-NK를 제공할 수 있다.
이 기술은 재현성이 높습니다. 그러나 신선하고 새로운 출발 물질을 사용하고 확장 첫 며칠 동안 NK 세포를 방해하지 않도록주의하는 것이 중요합니다. 림프구를 얻기 위해 멸균 수술 장비를 사용하여 생존 가능한 조직 영역을 식별하고 절단하는 것으로 시작하십시오.
그런 다음 절편된 조직을 칼슘이나 마그네슘이 없는 HBSS 30ml에 넣고 분리할 준비가 될 때까지 조직을 얼음 위에 두십시오. 생물 안전 캐비닛 내부에서 작업하면서 멸균 면도날과 집게로 조직을 0.5cm 미만의 입방체로 만듭니다. 다진 조직 조각(4g 이하)을 조직 해리기 튜브에 넣고 10ml의 콜라게나제 IV를 조직 조각에 추가합니다.
조직을 완전히 다지려면 조직 해리 튜브를 섭씨 37도의 조직 해리기로 처리하십시오. 조직 해리기에서 튜브를 제거한 후 5밀리리터 주사기의 백엔드를 사용하여 40미크론 나일론 세포 스트레이너를 통해 다진 조직을 분쇄합니다. 소화되지 않은 큰 조각은 버립니다.
수집된 용리액을 실온에서 400G에서 5분 동안 스핀다운하고 상층액을 흡인한 후 세포 펠릿을 30%폴리비닐피롤리돈 코팅 실리카에 재현탁하여 지방 세포를 제거합니다. 9 밀리리터의 R-10 배지에 세포 펠릿을 재현탁하기 전에 설명된 대로 세포를 스핀다운합니다. 적혈구 및 다형 핵 세포에서 림프구를 분리하려면 4 밀리리터의 Ficoll 또는 림프구 분리 배지 위에 세포 현탁액을 조심스럽게 층화하십시오.
가속과 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 23분 동안 400G에서 원심분리하여 층을 분리합니다. 그런 다음 상부 중간층을 조심스럽게 따라 내고 조직 침윤 림프구를 포함하는 간기를 수확합니다. 세포를 10 밀리리터의 배지로 헹구고 분석 또는 1차 자연 살해 또는 NK, 세포 확장 프로토콜을 진행합니다.
말초 혈액 단핵 세포 또는 PBMC, 및 100 감마선 조사 된 221-mIL-21 세포를 10 밀리리터의 R-10 배지로 5 분 동안 400G에서 원심 분리하여 별도로 세척하십시오. 원심분리 후, 유세포분석을 위해 6번째 PBMC에 1 x 10을 저장하고 특수 6웰 플레이트에서 6번째 100번째 감마선 조사된 221-mIL-21 세포에 10 x 10과 6번째 PBMC에 5 x 10을 혼합합니다. 인간 인터루킨-2 및 인간 인터루킨-15가 보충된 R-10 배지 30밀리리터를 동일한 6웰 플레이트에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양하고 3-4일마다 배지를 교체합니다.
배양 중에, 총 말초혈액 자연살해 또는 PBNK, 세포수 생존율을 기록하고 3 내지 4일 간격으로 유세포 분석을 수행하여 NK 세포 확장율을 계산하였다. 처리된 100mm 플레이트당 D-10 배지 11밀리리터의 6번째 293T 세포에 1.8 x 10을 추가하고 섭씨 37도에서 293T 세포를 5%이산화탄소와 함께 배양합니다. 1.70 밀리리터 튜브에서, 470 마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 30 마이크로리터의 형질주입 시약과 혼합한다.
별도의 1.70 밀리리터 튜브에 2.5 마이크로 그램의 pRDF 플라스미드, 3.75 마이크로 그램의 Pegpam3 플라스미드 및 2.5 마이크로 그램의 CAR 구조물을 SFG 벡터에 첨가하여 500 마이크로 리터의 최종 부피를 만듭니다. 튜브의 내용물을 이전에 준비된 1.70 밀리리터 튜브와 적가하여 혼합하십시오. 실온에서 15분 배양한 후, 튜브로부터 혼합물 1밀리리터를 293T 세포 플레이트에 적가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 5%이산화탄소와 함께 48 내지 72시간 동안 둔다.
레트로넥틴 단백질을 PBS로 희석하여 밀리리터당 50 내지 100 마이크로그램의 최종 농도로 한다. 희석된 레트로넥틴 500마이크로리터를 미처리 24웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 그런 다음 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하고 플레이트를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
다음날, 레트로넥틴 플레이트를 섭씨 4도에서 30분 동안 2, 103G에서 원심분리하고 상층액을 버린다. 24-웰 플레이트의 각 웰을 1 밀리리터의 R-10 배지로 막은 후, 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 1시간 동안 배양한다. 0.45 마이크론 필터를 사용하여 이전에 형질감염된 293T 세포를 여과하여 레트로바이러스 상청액을 수집한다.
여과된 레트로바이러스 상청액 2 밀리리터를 24-웰 레트로넥틴 플레이트의 각 웰에 분취한다. 24웰 레트로넥틴 플레이트를 2, 103G에서 섭씨 32도에서 예열된 원심분리기로 2시간 동안 원심분리합니다. 플레이트가 원심분리되는 동안 0일째부터 확장된 PBNK 세포를 수집하고 Trypan Blue를 사용하여 세포를 계수합니다.
확장된 PBNK 세포를 밀리리터당 2.5 x 10 내지 5번째 내지 5번째 세포 5 x 10의 농도로 인터루킨-2 및 인터루킨-15가 보충된 R-10 배지로 희석한다. 24-웰 레트로넥틴 플레이트를 원심분리한 후, 각 웰로부터 레트로바이러스 상청액을 부분적으로 흡인한다. 그런 다음 희석된 확장 PBNK 세포 2밀리리터를 각 웰에 추가합니다.
플레이트를 섭씨 32도에서 10분 동안 600G에서 원심분리한 후 섭씨 37도에서 5%이산화탄소와 함께 48-72시간 동안 배양합니다. 24웰 플레이트의 셀을 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮겨 400G에서 5분 동안 원심분리합니다. 1 밀리리터의 R-10 배지로 펠릿을 재현탁 한 후, 재현 된 세포를 인터루킨 -2 및 인터루킨 -15가 보충 된 R-10 배지 30 밀리리터를 포함하는 특수 6 웰 플레이트로 옮깁니다.
특수 6웰 플레이트를 상쾌한 배지로 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양하고 3-4일 간격으로 NK 세포 팽창률을 계산합니다. 221-mIL-21에 의해 확장된 PBNK 세포는 4배까지 거의 5 x 10 확장되는 것으로 나타났다. 그리고 NK 세포 순도는 21일 확장 기간 동안 약 85%로 유지되었다.
확장에 앞서, 221-mIL-21 확장 시스템의 견고성은 항-CD56 및 항-CD3에 대한 PBMCs를 염색하여 조사되었으며, 이는 NK 세포에 대해 7.09%의 세포 순도 및 높은 비율의 T 세포를 나타냈다. PBMCs 및 221-mIL-21 공동배양의 4일째에, CAR-NK 형질도입 전에 NK 순도를 확인하였다. 항-CD56, 항-CD3 및 항-인간-IgG로 염색된 CAR-NK 세포는 7일째에 높은 NK 세포 집단을 보였으며 약 70%의 높은 CAR 형질도입 효율을 관찰하였다.
18일째에, 다양한 하위세트에서의 CAR 발현을 유동 세포분석기로 확인하였다. NK 세포 확장 후 세포를 시험관 내 기능 분석 또는 생체 내 실험에 사용할 수 있습니다. 연구원은 이 프로토콜을 사용하여 기능적 NK 결핍 환자뿐만 아니라 개와 같은 다른 종에 대한 NK 및 CAR-NK를 확장할 수 있습니다.
