4.6K Views
•
11:02 min
•
February 8th, 2022
DOI :
February 8th, 2022
•0:04
introduction
0:54
Natural Killer (NK) Cell Expansion from Liver Tissues: Day 0
3:14
Primary Natural Killer (NK) Cell Expansion from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs): Day 0
4:34
Attachment of 293T Cells (Day 2) and Retrovirus Transfection (Day 3)
5:58
Retronectin Plate-Coating (Day 3) and Transduction (Day 4)
8:18
CAR-NK Cells Collection (Day 6 or 7)
9:04
Results: Expansion of PBNK Cells and Flow Cytometric Analysis of CAR-NK Cells
10:22
Conclusion
Transcript
Denne protokollen kan forbedre utvidelsen av funksjonelle, ikke-uttømmende, minnelignende NK-celler ex vivo betydelig sammenlignet med andre materceller basert på ekspansjonssystem. Dette er en enklere metode sammenlignet med andre protokoller som bruker materceller der vi hopper over NK-celleisolasjonstrinnet før NK-celleutvidelse. Denne protokollen kan gi et tilstrekkelig antall av NK-cellen og CAR-NK for immunterapi.
Denne teknikken er svært reproduserbar. Det er imidlertid viktig å bruke ferske, nye utgangsmaterialer og passe på å ikke forstyrre NK-cellene i løpet av de første dagene av ekspansjonen. Begynn med å identifisere og seksjonere de levedyktige vevsområdene ved hjelp av sterilt kirurgisk utstyr for å oppnå lymfocytter.
Plasser deretter det seksjonerte vevet i 30 ml HBSS uten kalsium eller magnesium og hold vevet på is til det er klart for isolasjon. Arbeid inne i et biosikkerhetsskap, hakk vevet i mindre enn 0,5 centimeter terninger med sterile barberblad og tang. Plasser hakkede vevsstykker, ikke mer enn 4 gram, i vevsdissosiatorrørene og tilsett 10 milliliter kollagenase IV til vevsstykkene.
For å hakke vevet grundig, behandle vevsdissosiatorrørene i en vevsdissosiator ved 37 grader Celsius. Etter å ha fjernet rørene fra vevsdissosiatoren, triturerer det hakkede vevet gjennom en 40 mikron nyloncellesil ved hjelp av baksiden av en 5 milliliter sprøyte. Kast de store ufordøyd fragmentene.
Spinn ned den oppsamlede eluenten ved 400G i 5 minutter ved romtemperatur og aspirer supernatanten før du resuspenderer cellepellets i 30% polyvinylpyrrolidonbelagt silika for å fjerne fettcellene. Spinn ned cellene som beskrevet før du resuspenderer cellepelleten i 9 milliliter R-10-medier. For å skille lymfocytter fra røde blodlegemer og polymorfonukleære celler, lag forsiktig cellesuspensjonen over 4 milliliter Ficoll eller lymfocyttseparasjonsmedier.
Skill lagene ved sentrifuging ved 400G i 23 minutter ved romtemperatur med akselerasjon og bremser av. Deretter forsiktig dekantere det øvre mediumlaget og høste interfasen som inneholder vevsinfiltrerende lymfocytter. Skyll cellene med 10 milliliter media og fortsett for analyse eller primær naturlig morder, eller NK, celleutvidelsesprotokoll.
Vask mononukleære celler i perifert blod, eller PBMC, og 100 gammabestrålte 221 mIL-21-celler separat ved sentrifugering ved 400G i 5 minutter med 10 milliliter R-10-medier. Etter sentrifugering, lagre 1 x 10 til 6th PBMCs for flowcytometri og bland 5 x 10 til 6th PBMCs med 10 x 10 til 6th 100 gamma-bestrålt 221-mIL-21 celler i en spesiell 6-brønns plate. Tilsett 30 milliliter R-10-medier supplert med humant interleukin-2 og humant interleukin-15 til samme 6-brønnsplate og inkuber platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid, med å erstatte mediet hver 3. til 4. dag.
Mens du er i inkubasjon, registrer den totale perifere blod naturlige morderen, eller PBNK, cellenummer levedyktighet og utfør flowcytometri hver 3. til 4. dag for å beregne NK-celleutvidelseshastigheten. Tilsett 1,8 x 10 til de 6. 293T-cellene i 11 milliliter av D-10-mediet per behandlet 100 millimeterplate og inkuber 293T-celler ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. I et 1, 70 milliliter rør, bland 470 mikroliter av det reduserte serummediet med 30 mikroliter av transfeksjonsreagenset.
I et separat 1,70 milliliter rør, tilsett 2,5 mikrogram pRDF-plasmid, 3,75 mikrogram Pegpam3-plasmid og 2,5 mikrogram CAR-konstruksjon i SFG-vektor i det reduserte serummediet for å gjøre det endelige volumet på 500 mikroliter. Bland innholdet i røret med 1,70 milliliter rør fremstilt tidligere på en dråpevis måte. Etter 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur, tilsett 1 milliliter av blandingen fra røret til 293T-celleplaten på en dråpevis måte og legg platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 48 til 72 timer.
Fortynn retronectinproteinet med PBS til en endelig konsentrasjon på 50 til 100 mikrogram per milliliter. Tilsett 500 mikroliter av det fortynnede retronectin i hver brønn på en ubehandlet 24-brønns plate. Deretter forsegler du platen ved hjelp av parafilm og inkuberer platen ved 4 grader Celsius over natten.
Neste dag, sentrifuger retronectinplaten ved 2.103G i 30 minutter ved 4 grader Celsius og kast supernatanten. Etter å ha blokkert hver brønn på 24-brønnsplaten med 1 milliliter R-10-medium, inkuberer platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 1 time. Filtrer de tidligere transfiserte 293T-cellene ved hjelp av et 0,45 mikron filter for å samle retrovirus supernatant.
Aliquot 2 milliliter av den filtrerte retrovirus supernatanten i hver brønn på 24-brønns retronectinplaten. Sentrifuge 24-brønns retronectinplaten ved 2, 103G i 2 timer i en forvarmet sentrifuge ved 32 grader Celsius. Mens platene sentrifugeres, samler du de utvidede PBNK-cellene fra dag 0 og teller cellene ved hjelp av Trypan Blue.
Fortynn de utvidede PBNK-cellene med R-10-medier supplert med interleukin-2 og interleukin-15 til konsentrasjonen på 2,5 x 10 til 5. til 5 x 10 til 5. celler per milliliter. Etter sentrifugering av 24-brønns retronectinplaten, aspirerer delvis retrovirus supernatanten fra hver brønn. Deretter tilsettes 2 milliliter av de fortynnede utvidede PBNK-cellene til hver brønn.
Sentrifuger platen ved 600G i 10 minutter ved 32 grader Celsius før du inkuberer platen ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i 48 til 72 timer. Overfør cellene fra 24-brønnsplaten til et 50 milliliter sentrifugerør for å sentrifugere røret ved 400G i 5 minutter. Etter resuspendering av pelleten med 1 milliliter R-10-medier, overfør de resuspenderte cellene til en spesiell 6-brønnplate som inneholder 30 milliliter R-10-medier supplert med interleukin-2 og interleukin-15.
Inkuber den spesielle 6-brønnsplaten ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid med forfriskende medier og beregn NK-celleutvidelseshastigheten hver 3. til 4. dag. PBNK-cellene utvidet med 221 mIL-21 ble vist å utvide nesten 5 x 10 til 4. folder. Og NK-cellerenheten ble opprettholdt på rundt 85% gjennom hele 21-dagers utvidelsen.
Før utvidelsen ble robustheten til 221-mIL-21-ekspansjonssystemet undersøkt ved å farge PBMC-er for anti-CD56 og anti-CD3, som viste en cellerenhet på 7,09% for NK-celler og en høy prosentandel av T-celler. På dag 4 av PBMC og 221-mIL-21-kokultur ble NK-renheten kontrollert før CAR-NK-transduksjon. CAR-NK-cellene farget for anti-CD56, anti-CD3 og anti-human-IgG viste en høy NK-cellepopulasjon på dag 7, og en høy CAR-transduksjonseffektivitet på ca. 70% ble observert.
På den 18. dagen ble CAR-uttrykket i ulike undergrupper kontrollert med flowcytometri. Etter NK-celleutvidelse kan celler brukes til in vitro funksjonelle analyser eller til in vivo-eksperimenter. Forsker kan bruke denne protokollen til å utvide NK og CAR-NK for pasienter med funksjonell NK-mangel, så vel som andre arter, for eksempel hund.
Her presenterer vi en metode for å utvide perifert blod naturlig morder (PBNK), NK-celler fra levervev og kimær antigenreseptor (CAR) -NK-celler avledet fra perifere blodmononukleære celler (PBMC) eller ledningsblod (CB). Denne protokollen demonstrerer utvidelsen av NK- og CAR-NK-celler ved bruk av 221 mIL-21 materceller i tillegg til den optimaliserte renheten til utvidede NK-celler.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved