4.6K Views
•
11:02 min
•
February 8th, 2022
DOI :
February 8th, 2022
•0:04
introduction
0:54
Natural Killer (NK) Cell Expansion from Liver Tissues: Day 0
3:14
Primary Natural Killer (NK) Cell Expansion from Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs): Day 0
4:34
Attachment of 293T Cells (Day 2) and Retrovirus Transfection (Day 3)
5:58
Retronectin Plate-Coating (Day 3) and Transduction (Day 4)
8:18
CAR-NK Cells Collection (Day 6 or 7)
9:04
Results: Expansion of PBNK Cells and Flow Cytometric Analysis of CAR-NK Cells
10:22
Conclusion
Transcript
Detta protokoll kan avsevärt förbättra expansionen av funktionella, icke-uttömmande, minnesliknande NK-celler ex vivo jämfört med andra matarceller baserade på expansionssystem. Detta är en enklare metod jämfört med andra protokoll som använder matarceller där vi hoppar över NK-cellisoleringssteget före NK-cellutvidgning. Detta protokoll kan ge ett tillräckligt antal av NK-cellen och CAR-NK för immunterapi.
Denna teknik är mycket reproducerbar. Att använda färska, nya utgångsmaterial och se till att inte störa NK-cellerna under de första dagarna av expansionen är dock avgörande. Börja med att identifiera och sektionera de livskraftiga vävnadsområdena med steril kirurgisk utrustning för att erhålla lymfocyter.
Placera sedan de snittade vävnaderna i 30 ml HBSS utan kalcium eller magnesium och håll vävnaden på is tills den är klar för isolering. Arbeta inuti ett biosäkerhetsskåp, hacka vävnaden i mindre än 0,5 centimeter kuber med sterila rakblad och pincett. Placera de malet vävnadsbitarna, högst 4 gram, i vävnadsdissociatorrören och tillsätt 10 ml kollagenas IV till vävnadsbitarna.
För att haka vävnaden noggrant, behandla vävnadsdissociatorrören i en vävnadsdissociator vid 37 grader Celsius. Efter att ha tagit bort rören från vävnadsdissociatorn, triturera den malet vävnaden genom en 40-mikron nyloncellsil med hjälp av baksidan av en 5 ml spruta. Kassera de stora osmälta fragmenten.
Snurra ner det uppsamlade elueringsmedlet vid 400 G i 5 minuter vid rumstemperatur och aspirera supernatanten innan du återuppfinner cellpelletsen i 30% polyvinylpyrrolidonbelagd kiseldioxid för att ta bort fettcellerna. Snurra ner cellerna enligt beskrivningen innan du återsuspenderar cellpelleten i 9 ml R-10-media. För att separera lymfocyter från röda blodkroppar och polymorfonukleära celler, skikta försiktigt cellsuspensionen över 4 ml Ficoll- eller lymfocytseparationsmedier.
Separera skikten genom att centrifugera vid 400 G i 23 minuter vid rumstemperatur med accelerationen och bromsarna avstängda. Dekantera sedan försiktigt det övre medelskiktet och skörda de interfas som innehåller vävnadsinfiltrerande lymfocyter. Skölj cellerna med 10 ml media och fortsätt för analys eller primär naturlig mördare, eller NK, cellutvidgningsprotokoll.
Tvätta de perifera blodmononukleära cellerna, eller PBMC, och 100 gammabestrålade 221-mIL-21-celler separat genom centrifugering vid 400G i 5 minuter med 10 ml R-10-media. Efter centrifugering, spara 1 x 10 till 6: e PBMC för flödescytometri och blanda 5 x 10 till 6: e PBMC med 10 x 10 till 6: e 100 gammabestrålade 221-mIL-21-celler i en speciell 6-brunnsplatta. Tillsätt 30 ml R-10-media kompletterat med humant interleukin-2 och humant interleukin-15 till samma 6-brunnsplatta och inkubera plattan vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid, med byte av media var 3: e till 4: e dag.
Under inkubation, registrera den totala naturliga mördaren för perifert blod, eller PBNK, cellnummerviabilitet och utför flödescytometri var 3: e till 4: e dag för att beräkna NK-cellutvidgningshastigheten. Tillsätt 1,8 x 10 till de 6: e 293T-cellerna i 11 ml av D-10-mediet per behandlad 100 millimeter platta och inkubera 293T-celler vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Blanda 470 mikroliter av det reducerade serummediet i ett 1,70 ml rör med 30 mikroliter transfektionsreagens.
I ett separat 1,70 ml rör, tillsätt 2,5 mikrogram pRDF-plasmid, 3,75 mikrogram Pegpam3-plasmid och 2,5 mikrogram CAR-konstruktion i SFG-vektor i det reducerade serummediet för att göra den slutliga volymen på 500 mikroliter. Blanda innehållet i röret med 1,70 ml röret som framställts tidigare på ett droppvis sätt. Efter 15 minuters inkubation vid rumstemperatur tillsätt 1 ml av blandningen från röret till 293T-cellplattan på ett droppvis sätt och placera plattan vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 48 till 72 timmar.
Späd retronektinproteinet med PBS till en slutlig koncentration av 50 till 100 mikrogram per milliliter. Tillsätt 500 mikroliter av det utspädda retronektinet i varje brunn på en obehandlad 24-brunnsplatta. Försegla sedan plattan med parafilm och inkubera plattan vid 4 grader Celsius över natten.
Nästa dag, centrifugera retrelektinplattan vid 2, 103G i 30 minuter vid 4 grader Celsius och kassera supernatanten. Efter att ha blockerat varje brunn på 24-brunnsplattan med 1 ml R-10-medium, inkubera plattan vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 1 timme. Filtrera de tidigare transfekterade 293T-cellerna med ett 0,45 mikronfilter för att samla retrovirussupernatanten.
Alikvotera 2 ml av den filtrerade retrovirussupernatanten i varje brunn på 24-brunns retretektinplattan. Centrifugera 24-brunns retrelektinplattan vid 2, 103G i 2 timmar i en förvärmd centrifug vid 32 grader Celsius. Medan plattorna centrifugeras, samla de expanderade PBNK-cellerna från dag 0 och räkna cellerna med Trypan Blue.
Späd de expanderade PBNK-cellerna med R-10-media kompletterat med interleukin-2 och interleukin-15 till koncentrationen av 2,5 x 10 till 5: e till 5 x 10 till 5: e cellerna per milliliter. Efter centrifugering av 24-brunns retreektinplattan, aspirera delvis retrovirus supernatanten från varje brunn. Tillsätt sedan 2 ml av de utspädda expanderade PBNK-cellerna till varje brunn.
Centrifugera plattan vid 600 G i 10 minuter vid 32 grader Celsius innan du inkuberar plattan vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i 48 till 72 timmar. Överför cellerna från 24-brunnsplattan till ett 50 ml centrifugrör för att centrifugera röret vid 400 G i 5 minuter. Efter att ha återsuspenderat pelleten med 1 ml R-10-media, överför de återsuspenderade cellerna till en speciell 6-brunnsplatta innehållande 30 ml R-10-media kompletterat med interleukin-2 och interleukin-15.
Inkubera den speciella 6-brunnsplattan vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid med uppfriskande media och beräkna NK-cellutvidgningshastigheten var 3: e till 4: e dag. PBNK-cellerna expanderade med 221-mIL-21 visade sig expandera nästan 5 x 10 till 4: e vecken. Och NK-cellrenheten bibehölls på cirka 85% under hela 21-dagars expansionen.
Före expansionen undersöktes robustheten hos expansionssystemet 221-mIL-21 genom färgning av PBMC för anti-CD56 och anti-CD3, vilket visade en cellrenhet på 7,09% för NK-celler och en hög andel T-celler. På dag 4 av PBMC och 221-mIL-21 coculture kontrollerades NK-renheten före CAR-NK-transduktion. CAR-NK-cellerna färgade för anti-CD56, anti-CD3 och anti-human-IgG visade en hög NK-cellpopulation på dag 7 och en hög CAR-transduktionseffektivitet på cirka 70% observerades.
Den 18: e dagen kontrollerades CAR-uttrycket i olika delmängder med flödescytometri. Efter NK-cellutvidgning kan celler användas för in vitro-funktionella analyser eller för in vivo-experiment. Forskare kan använda detta protokoll för att expandera NK och CAR-NK för patienter med funktionell NK-brist såväl som andra arter, såsom hund.
Här presenterar vi en metod för att expandera perifert blod naturligt dödare (PBNK), NK-celler från levervävnader och chimär antigenreceptor (CAR) -NK-celler härledda från mononukleära celler i perifert blod (PBMC) eller navelsträngsblod (CB). Detta protokoll visar expansionen av NK- och CAR-NK-celler med användning av 221-mIL-21-matarceller utöver den optimerade renheten hos expanderade NK-celler.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved