क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की तैयारी और क्रायो-एफआईबी माइक्रोमशीनिंग

इस वीडियो क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए खमीर साल्मोनेला की तैयारी पर ध्यान केंद्रित करेंगे हम कोशिका की खेती से वर्कफ्लो के माध्यम से क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी सैचरोमाइसेस सेर्विसियाई निलंबन में आयन नमूना तैयारी के लिए खेती कर रहे हैं यह सिफारिश की सिफारिश है लेमिनार फ्लो बॉक्स के अंदर बाँझ परिस्थितियों में काम करने के लिए सेल की खेती के लिए मध्यम करने के लिए निकाले गए बाँझ खमीर के दस मिलीलीटर को बाँझ बीस प्रतिशत ग्लूकोज के एक मिलीलीटर की खेती करने के लिए जोड़ा जाता है खेती के साथ फ्लास्क माध्यम एक खमीर कॉलोनी ध्यान से हमारी खेती की थाली से उठाया जाता है और खेती में तैयार विकास माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है फ्लास्क खेती फ्लास्क को तब पन्नी के साथ कवर किया जाता है और कोशिकाओं को फैलाने के लिए अच्छी तरह से मिश्रित किया जाता है कोशिका संस्कृति को इनक्यूबेटर में रखा जाता है और लगातार आंदोलन के साथ तीस डिग्री पर खेती की जाती है जब तक कि घातीय चरण तक पहुंच नहीं जाता खमीर सेल संस्कृति घातीय चरण तक बढ़ी है और सेल घनत्व भौतिक मापा जाता है एक संदर्भ नमूना सेल संस्कृति के रूप में एक स्वच्छ माध्यम के खिलाफ मीटर होल्डिंग OD1 या OD30 के लिए केंद्रित है ग्लिस्रोल के पांच प्रतिशत के अलावा इससे पहले कि ब्लैंके ठंड इलेक्ट्रो माइक्रोस्कोपिक ग्रिड सतह साफ है और प्लाज्मा ग्रिड द्वारा सेल निलंबन के आवेदन के लिए सक्रिय चमक निर्वहन कक्ष में रखा जाता है कार्बन की ओर का सामना करना पड़ रहा है और प्लाज्मा सफाई की प्रक्रिया तीस से ४५ सेकंड ईएमएस ग्रिड के लिए सेट है अब और वे सेल के लिए तैयार है ईएम ग्रिड पर खमीर सेल निलंबन का नमूना आवेदन विट्रीफिकेशन विट्रोबोट मशीन का उपयोग करके तरल इथेन में ब्लैंच फ्रीजिंग द्वारा किया जाता है तरल इथेन की तैयारी तरल नाइट्रोजन ईएम ग्रिड के साथ एक धातु कप में एथेन गैस को तरल कप में तरल कप में तरल द्रवित करके होती है, जिसमें सेल निलंबन के साथ पीछे की ओर से फिल्टर पेपर द्वारा दाग दिया जाता है और विट्रोबोट चैंबर के अंदर सामने कार्बन साइड तापमान से गैर चिपकने वाला प्लास्टिक तुला होता है। अठारह डिग्री और आर्द्रता के लिए एक सौ प्रतिशत प्रतीक्षा समय, दाग समय और दाग बल विट्रोबोट स्क्रीन पर सेट कर रहे है के रूप में अच्छी तरह से चमक निर्वहन ग्रिड विट्रोबोट चिमटी द्वारा उठाया जाता है और साधन के लिए घुड़सवार तीन बिंदु सैकरोमाइसेस सेरेविसियाई निलंबन के पांच माइक्रोलीटर Vitrobot जलवायु कक्ष निलंबन के अंदर ग्रिड के कार्बन पक्ष के लिए लागू किया जाता है ठीक से ग्रिड के हर आवेदन से पहले मिश्रित किया जाना चाहिए विट्रीफाइड कोशिकाओं के साथ तरल इथेन इलेक्ट्रो-माइक्रोस्कोपी ग्रिड में तरल नाइट्रोजन की स्थिति के तहत संग्रहीत किया जाता है या विट्रीफाइड कोशिकाओं के साथ क्रायो एसईएम माइक्रोस्कोप ग्रिड में लोड करने के लिए ग्रिड कारतूस में रखा जाता है, फिर ग्रिड कारतूस में सुरक्षित किया जाता है जो एसईएम और टेम माइक्रोस्कोप सी-क्लिप रिंग दोनों को लोड करने के लिए उपयुक्त है और तरल नाइट्रोजन ग्रिड में ठंडा किया जाता है ग्रिड कारतूस पर रखा जाता है। सी क्लिप अंगूठी नमूना तो lamila तैयारी के लिए विशेष ग्रिड बॉक्स नमूना में रखा जाता है दोहरी बीम FIB/SEM माइक्रोस्कोप के लिए लोड किया जाता है और क्रायो के साथ फिट चरण तैयारी कक्ष लोड पॉट ठीक से ठंडा है और तरल नाइट्रोजन नमूना धारक से भरा शटल में रखा जाता है और नीचे ठंडा के रूप में अच्छी तरह से नमूना के साथ ग्रिड बॉक्स भंडारण देवर से बर्तन में स्थानांतरित कर दिया जाता है और ग्रिड दो स्लॉट में रखा जाता है FIB ग्रिड कारतूस के उपयोग के मामले में ऊपर का सामना करना पड़ कोशिकाओं के साथ शटल कार्बन पक्ष ग्रिड कारतूस के बाहर कटौती ध्यान से शटल ग्रिड में बारह बजे के लिए गठबंधन किया जाना चाहिए पेंच से कड़ा कर रहे है और शटल लोडिंग स्थिति के लिए नीचे फ़्लिप किया जाता है लोडिंग पॉट हस्तांतरण स्टेशन में रखा जाता है और लोडिंग पॉट के साथ ढक्कन हस्तांतरण कक्ष के साथ कवर ढक्कन के शीर्ष पर रखा जाता है और के माध्यम से पंप ग्रिड के साथ कम वैक्यूम शटल रॉड पर बांधा जाता है और तैयारी कक्ष में एकत्र छोटे हस्तांतरण कक्ष कक्षों के अंदर बंद कर दिया जाता है पंप किया जाता है और उच्च वैक्यूम एसईएम चैंबर चरण में क्रायो-स्टेज पर शटल डाला जाता है ४५ डिग्री तक झुका हुआ है और ग्रिड की केंद्र स्थिति पर चार मिलीमीटर स्थानांतरित कर दिया जाता है गैस इंजेक्शन प्रणाली की सुई डालने से ध्यान केंद्रित के दौरान विकिरण क्षति के खिलाफ जैविक नमूने पर कार्बनिक नमूने की सुरक्षात्मक परत बनती है आयन बीम मिलिंग ग्रिड तो अकार्बनिक धातु के पतले घूंघट के साथ लेपित करने के लिए जैविक सामग्री पर प्रवाहकीय परत बनाने के लिए सेल क्लस्टर या मोनोलेयर में lamella के आयन बीम मिलिंग कुछ कदम चरण में किया जाता है मिलिंग कोण क्षेत्र में ले जाया जाता है ब्याज की मिलिंग कोण क्षेत्र में ले जाया जाता है पाया जाता है और ऊपर और नीचे मिलिंग पैटर्न बनाया जाता है एफआईबी वर्तमान और लंगड़ा मोटाई की अंतिम अंतिम केवल ऊपरी पैटर्न और कम FIB वर्तमान के साथ प्रदर्शन के सामने अंत क्षति से बचने के लिए और lamella सतह इलेक्ट्रॉन बीम पर पर्दा प्रभाव मिलिंग प्रक्रिया के दौरान प्रगति से पता चलता है यहां हम अंतिम पॉलिश lamella देख सकते है lamella की अंतिम मोटाई के लिए कम से २०० और ५० नैनोमीटर की जरूरत है इलेक्ट्रॉन बीम के संचरण के लिए पारदर्शी होने के लिए सेल क्लस्टर और मोनोलेयर में प्रो और शंकु के साथ मिल्ड lamella के चित्रण लामाली के साथ दोनों नमूना प्रकार ग्रिड बहुत धीरे से तैयारी कक्ष के माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं लोडिंग पॉट पॉट को ठंडा किया जाता है और मिल्ड लामाली ग्रिड के बर्फ संदूषण से बचने के लिए ताजा और साफ तरल नाइट्रोजन से भरा जाता है शटल से हटा दिया जाता है और मिल्ड लामाली के साथ ग्रिड बॉक्स नमूना को वापस लौटा दिया जाता है अंततः ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन क्रायो माइक्रोस्कोप ग्रिड को स्थानांतरित कर दिया जाता है टेम टिल्ट एक्सेस लामिली के संबंध में लामेला के उचित अभिविन्यास को सुनिश्चित करने के लिए जांच की जाती है और क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफिक डेटा के अधिग्रहण के लिए ब्याज के क्षेत्र स्थानीयकृत लामेला मुख्य अक्ष माइक्रोस्कोप की झुकाव धुरी के लंबवत होते हैं ताकि उच्च झुकाव कोणों पर देखने का सही क्षेत्र देखने के लिए डोसिमेट्रिक विधि का उपयोग टोमोग्राम एकत्र किए गए क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी डेटा एकत्र करने के लिए किया जाता है। सॉफ्टवेयर इस प्रोटोकॉल में हमने आपको दिखाया कि क्रायो केंद्रित आयन बीम मिलिंग का उपयोग करके एक लामेला माइक्रो मशीन के लिए खमीर सेल नमूना कुशलतापूर्वक कैसे तैयार किया जाए और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी डेटा और सेल लामाली को कैसे तैयार किया जाए