이 비디오는 극저온 전자 단층 촬영을위한 효모 살모넬라의 준비에 초점을 맞출 것이다 우리는 극저온 전자 단층 촬영 Saccharomyces cerevisiae에 세포 재배에서 워크 플로우를 통해 이동합니다 서스펜션에서 이온 표본 준비를 위해 재배 세포 재배를 위해 배지로 추출된 멸균 효모의 10밀리리터가 첨가되어 멸균 액티비티 20%의 포도당 내부에 멸균 조건에서 작업하는 것이 좋습니다. 재배 배지를 가진 플라스크는 재배플레이트로부터 신중하게 수확되어 재배플라스크 재배 플라스크에서 준비된 성장 배지로 옮겨져 호일로 덮여 세포를 분산시켜 세포 배양을 분산시키고 기하수학적 위상이 약해질 때까지 30도에서 지속적으로 재배되어 세포밀도에 도달할 때까지 세포밀도가 약해지고, 세포밀도에 의해 기하밀도로 측정되는 세포밀도로 기하밀도로 재배된다. 기준 시료 세포 배양으로 깨끗한 매체에 대한 계측기를 보유하는 것은 글리세롤의 5%를 더하여 글리세롤의 5%를 더하여 플라즈마 그리드에 의한 세포 현탁액의 적용을 위해 정화및 활성화되어 탄소측을 향한 광발 배출챔버에 배치되고 플라즈마 세척의 절차는 이제 30~45초 EM 그리드에 설정되어 있으며, 이제 는 30~45초 EM 그리드를 준비하고 있다. 샘플 응용 프로그램 EM 그리드에 효모 세포 현탁액의 바이트화는 Vitrobot 기계를 사용하여 액체 에탄으로 동결에 의해 수행 액체 에탄의 제조는 백사이드에서 필터 종이에 의해 블래스트및 앞탄소 측의 온도에서 구부러져 액체 질소 EM 그리드로 냉각 금속 컵에 에탄 가스를 액화하여 일어난다 18도 및 습도가 100% 대기 시간, 블롯 시간 및 블롯 힘이 Vitrobot 화면에 설정되며, 빛 배출 그리드는 비트로봇 핀셋에 의해 선택되고 Saccharomyces cerevisiae 서스펜션의 3점 5 마이크로리터가 Vitrobot 기후 챔버 의 내부 의 탄소 측에 적용되어 모든 그리드를 제대로 혼합할 필요가 있습니다. 유리화된 세포를 가진 액체 에탄 전기 현미경 그리드로 액체 질소 조건 하에서 저장되거나 그리드 카트리지에 장착되어 극저온 SEM 현미경 그리드에 적재한 다음 SEM 및 TEM 현미경 모두에 적재에 적합한 그리드 카트리지에 고정되어 SEM 및 TEM 현미경 모두에 적재하고 C-클립 링이 클리핑 도구에 장착되고 액체 질소 그리드에 냉각되어 카트리지에 장착되어 카트에 고정되어 C-클립 링 시편은 듀얼 빔 FIB/SEM 현미경으로 로드되어 냉동 단계 준비 챔버 로딩 냄비에 맞게 특수 그리드 박스 표본에 배치되어 셔틀이라고 불리는 액체 질소 샘플 홀더로 적절하게 냉각되고 냉각되어 저장 데워에서 냄비및 그리드로 이동하여 저장 드워에서 두 개의 슬롯에 배치됩니다. FIB 그리드 카트리지를 사용하는 경우 셀이 위면한 셔틀 카본 면은 그리드 카트리지에서 절단된 카트리지를 12시에 조심스럽게 정렬해야 하며, 셔틀그리드는 나사에 의해 조여지고, 셔틀은 로딩 위치 로딩 포트로 뒤집혀 변전소에 배치되고 뚜껑 을 덮고 뚜껑 상단을 통해 펌핑 그리드가 있는 저진공 셔틀은 로드에 고정되어 준비챔버로 수집된 소형 이송 챔버 의 내부를 밀착하고, 고진공 SEM 챔버 스테이지에서 극저온 스테이지에 셔틀이 삽입되어 45도로 기울어져 있으며, 가스 분사 시스템의 바늘을 삽입하는 그리드의 중심 위치에 4밀리미터 이동하여 집중된 동안 생물학적 시편에 대한 보호층을 생성한다. 이온 빔 밀링 그리드는 세포 클러스터 또는 단층에서 라멜라의 생물학적 물질 중심이되는 이온 빔 밀링에 전도성 층을 생성하기 위해 무기 금속의 얇은 베일로 코팅된 스퍼터로 코팅되어 몇 단계 단계로 진행되어 밀링 각도 영역으로 이동하여 관심 있는 각도 영역이 발견되고 상하 밀링 패턴이 발견되어 FIB 전류및 라멜라 두께의 점진적인 감소로 분쇄된다. 라멜라 표면 전자 빔에 프런트 엔드 손상 및 커튼 효과를 피하기 위해 상부 패턴및 낮은 FIB 전류로만 수행하였고, 여기서 우리는 최종 연마 된 라멜라의 최종 두께가 세포 클러스터및 모노 레이어에서 라멜라 밀링된 전자 빔의 전송을 위해 투명해야 250 나노미터 미만이어야합니다. 라말리와 두 샘플 유형 그리드는 매우 부드럽게 로딩 냄비 냄비에 다시 준비 챔버를 통해 전송되어 냉각 및 분쇄 라말리 그리드의 얼음 오염을 피하기 위해 신선하고 깨끗한 액체 질소로 채워져 셔틀에서 제거하고 밀라말리와 그리드 박스 표본으로 다시 반환결국 전송 전자 극저온 현미경 그리드는 TEM 자동 캐서에 90도 회전해야 TEM 틸트 액세스라미에 대하여 라멜라의 적절한 방향을 보장하기 위해 라멜라가 선별되고 극저온 전자 단조계 데이터의 획득에 대한 관심 영역은 국소화된 라멜라 주요 축은 현미경의 기울기 축에 수직으로 되어 높은 기울기 각도에서 올바른 시야를 볼 수 있도록 하는 데 사용되며, 그 후 모노모그램에서 수집된 극저온 전자 단층 데이터를 수집하기 위해 사용되는 다이모토 마이크로그래피 데이터 소프트웨어 이 프로토콜에서 우리는 크저온 빔 밀링을 사용하여 라멜라 마이크로 머신에 대한 효모 세포 샘플을 효율적으로 준비하고 전자 단층 촬영 데이터 및 셀 라말리를 준비하고 처리하는 방법을 보여 주었다.
