Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Denne videoen vil fokusere på forberedelse av gjær salmonella for kryo-elektrontomografi Vi vil gå gjennom arbeidsflyten fra cellekultivering til kryo-elektrontomografi Saccharomyces cerevisiae dyrkes for ionprøvepreparat i suspensjon Det anbefales å arbeide i sterile forhold inne i laminær strømningsboksen ti milliliter steril gjær ekstrahert til medium for celledyrking legges til for å sterilisere dyrking kolbe en milliliter steril tjue prosent glukose tilsettes til kolben med dyrking medium en gjærkoloni er nøye plukket fra vår dyrking plate og overført til forberedt vekst medium i dyrking kolbe dyrking kolbe er deretter dekket med folie og blandet godt for å spre celler cellekultur er plassert i inkubatoren og dyrket på tretti grader med konstant agitasjon til eksponentiell fase er nådd gjærcellekulturen er vokst opp til eksponentiell fase og celle fysisk tetthet måles ved holdemåler mot et rent medium som en referanse prøve cellekultur er konsentrert til OD1 eller OD30 i tillegg til fem prosent av glyserol før blanche frysing Elektro-mikroskopiske rutenett overflate er rengjort og aktivert for påføring av celle suspensjon av plasma grids er plassert i glødeutladning kammer vendt karbon side opp og prosedyren for plasma rengjøring er satt til tretti til førtifem sekunder EM-rutenett har nå og de er klare for celle prøveapplikasjon Vitrification av gjærcellefjæring på EM-gitter gjøres ved blanche frysing i flytende etan ved hjelp av Vitrobot-maskin Tilberedningen av flytende etan foregår ved å flytende etangass i en metallkopp avkjølt med flytende nitrogen EM-rutenett med celleoppheng er blottet av filterpapir fra baksiden og ved ikke-lim plast bøyd fra forsiden karbon side Temperatur inne i Vitrobot-kammeret er satt til å atten grader og fuktighet til hundre prosent ventetid, flekktid og flekkkraft er satt på Vitrobot-skjermen også Glødeutladningsgitteret plukkes av Vitrobot pinsett og monteres på instrumentet tre punkt fem mikrolitere av Saccharomyces cerevisiae suspensjon påføres karbonsiden av rutenettet inne i Vitrobot klimakammer Suspensjon må blandes riktig før hver påføring av rutenettet er blanche frossen inn i de flytende etane elektromikroskopgitteret med vitrifiserte celler lagres under flytende nitrogenforhold eller monteres i gitterkassetten for lasting i cryo SEM-mikroskopet Rutenettet med vitrifiserte celler festes deretter i gitterkassetten som er egnet for lasting til både SEM- og TEM-mikroskoper C-klipsring er montert på klippeverktøyet og avkjølt i flytende nitrogengitter er plassert på rutenettpatronen karbon vendt ned og klippet med klippeverktøyet og avkjølt i flytende nitrogengitter er plassert på rutenettet karbon vendt ned og klippet med klippeverktøyet. C-clip ringprøve plasseres deretter i den spesielle gitterboksen Prøven for lamila forberedelse lastes til dual beam FIB / SEM mikroskop og passer med kryo-trinns forberedelseskammer lastekanne er riktig avkjølt og fylt med flytende nitrogenprøveholder kalt shuttle er plassert i og avkjølt ned samt rutenettkasse med prøve overføres fra lagringsdewar til potten og gitter er plassert i to spor i shuttle karbon side med celler vendt opp i tilfelle bruk av FIB rutenett patroner kuttet ut av rutenettet patronen bør være nøye justert til tolv i shuttle grids er strammet av skruen og skyttelbussen er vendt ned til lasteposisjon lastekanne er plassert i overføringsstasjon og dekket med lokk Overføringskammer med lastepotte er plassert på toppen av lokket og pumpet gjennom lav vakuumferge med gitter er festet på stangen og lukket innsiden av de små overføringskammerkamrene samlet til forberedelseskammeret pumpes og skyttelbussen settes inn på kryo-scenen i høyvakuum SEM-kammerstadiet vippes til førti fem grader og flyttes fire millimeter på midtposisjonen til rutenettet som setter inn nålen av gassinjeksjonssystemet skaper beskyttende lag av organisk på biologisk prøve mot strålingsskader under fokus ionstråle fresegitter blir deretter sputter belagt med tynt slør av uorganisk metall for å skape ledende lag på biologisk materiale fokusert ionstråle fresing av lamell i celle klynge eller monolayer gjøres i få trinn scenen flyttes til frese vinkel regionen av interesse er funnet og topp og bunn fresing mønstre er opprettet grov lamell er malt med gradvis reduksjon av FIB strøm og lamella tykkelse den endelige polering av lamell er utført bare med øvre mønster og lav FIB strøm for å unngå front end skade og gardiner effekt på lamell overflate elektron stråle viser fremdriften under freseprosessen her kan vi se den endelige polert lamell Den endelige tykkelsen på lamell må være mindre enn to hundre og femti nanometer for å være gjennomsiktig for overføring av elektronstråle illustrasjonen av lamell malt i celleklynge og monolayer med fordeler og ulemper med begge prøvetypene rutenett med lamali overføres svært forsiktig gjennom forberedelseskammeret tilbake til lastepottepotten avkjøles og fylles med friskt og rent flytende nitrogen for å unngå isforurensning av fresede lamaligitter fjernes fra romfergen og returneres tilbake til gitterkasseprøven med malt lamali overføres til overføringselektron cryo mikroskopgitter må være nitti grader rotert før innsetting til TEM autoloader-kassetten for å sikre riktig orientering av lamellen med hensyn til TEM tilt tilgang Lamili er screenet og region av interesse for oppkjøp av kryo-elektron tomografiske data er lokalisert Lamella hovedakse er vinkelrett på tilt aksen av mikroskopet for å se riktig synsfelt ved høye tilt vinkler dosimetrisk metode brukes til å samle kryo elektron tomografi data samlet tomogram blir deretter behandlet i Etomo programvare og monolay segmentet inira programvare I denne protokollen viste vi deg hvordan du effektivt forbereder en gjærcelleprøve for en lamellmikromaskin ved hjelp av kryofokusert ionstrålefresing og hvordan du forbereder og behandler elektrontomografidata og cellelamali