3.6K Views
•
09:06 min
•
November 20th, 2021
DOI :
November 20th, 2021
•Transcript
Denna video kommer att fokusera på beredning av jäst salmonella för kryoelektrontomografi Vi kommer att gå igenom arbetsflödet från cellodling till kryoelektrontomografi Saccharomyces cerevisiae odlas för jonprovberedning i suspension Det rekommenderas att arbeta under sterila förhållanden inuti laminarflödeslådan tio milliliter steril jäst extraherad till medium för cellodling tillsätts för att sterilisera odlingskolv en milliliter steril tjugo procent glukos tillsätts till Kolven med odlingsmedium en jästkoloni plockas försiktigt från vår odlingsplatta och överförs till det beredda tillväxtmediet i odlingskolvens odlingskolv är sedan täckt med folie och blandad brunn för att sprida celler cellkultur placeras i inkubatorn och odlas i trettio grader med konstant agitation tills den exponentiella fasen uppnås jästcellskulturen odlas upp till exponentiell fas och cellens fysiska densitet mäts med Håll mätare mot ett rent medium som referensprovcellskultur koncentreras till OD1 eller OD30, utöver fem procent glycerol innan blanche frysning Elektro-mikroskopiska galler yta rengörs och aktiveras för applicering av cell suspension av plasmanät placeras i glödavlossningskammare vänd kol sida upp och förfarandet för plasmarengöring är inställt på trettio till fyrtiofem sekunder EM-galler har nu och de är redo för cell provapplikation Vitrifiering av jästcellsupphängning på EM-galler görs genom blanchefrysning i flytande etan med hjälp av Vitrobot-maskinen Beredningen av flytande etan sker genom kondensering av etangas i en metallkopp som kyls med flytande kväve EM-galler med cellupphängning blottas av filterpapper från baksidan och av icke-självhäftande plast böjd från vitrobotkammarens främre kolsida är inställd på att arton grader och luftfuktighet till hundra procent väntetid, fläcktid och fläckkraft ställs också in på Vitrobot-skärmen Glödurladdningsgallret plockas av Vitrobot pincett och monteras på instrumentet tre punkt fem mikroliter saccharomyces cerevisiae suspension appliceras på kolsidan av gallret inuti Vitrobots klimatkammare Suspension måste blandas ordentligt innan varje applicering av gallret blanche fryses i de flytande etanelektroskopinäten med vitrifierade celler lagras under flytande kväveförhållanden eller monteras i nätpatronen för lastning i cryo SEM-mikroskopet Galler med för vitrifierade celler fästs sedan i nätpatronen som är lämplig för lastning till både SEM- och TEM-mikroskop C-klippringen monteras på urklippsverktyget och kyls ner i flytande kvävenät placeras på nätpatronkol nedåt och klipps med klämman C-klippringprov placeras sedan i den speciella gallerlådan Prov för lamilaberedning laddas till dubbelstråle FIB/SEM-mikroskop och passar med kryostegs förberedelsekammare lastkageln kyls ner ordentligt och fylls med flytande kväveprovhållare som kallas shuttle placeras i och kyls ner samt gallerlådan med prov överförs från lagringsdewar till potten och galler placeras i två slitsar i shuttle kolsida med celler vända uppåt vid användning av FIB-nätpatroner ska utskärningen av nätpatronen noggrant justeras till tolv klockan i skyttelnäten dras åt av skruven och skytteln vänds ner till lastningsposition lastkagel placeras i överföringsstation och täckt med lock Överföringskammare med lastkruka placeras på lockets ovansida och pumpas genom lågvakuumskytteln med galler fästs på stången och stängs inuti de små överföringskammare som samlas upp i beredningskammaren pumpas och skytteln sätts in på kryostadium i högvakuum SEM-kammarens steg lutas till fyrtiofem grader och flyttas fyra millimeter på mitten av gallret som sätter in nålen i gasinsprutningssystemet skapar skyddande skikt av organiskt på biologiskt prov mot strålningsskador under fokuserad jonstrålefräsgaller är sedan sputter belagda med tunn slöja av oorganisk metall för att skapa ledande skikt på biologiskt materialfokuserat jonstrålefräsning av lamell i cellkluster eller monoskikt görs i några steg steg steg flyttas till fräsvinkelområde av intresse hittas och topp och bottenfräsmönster skapas grovlamell mals med gradvis minskning av FIB-ström och lamelltjocklek den slutliga poleringen av lamell är endast utfört med övre mönster och låg FIB-ström för att undvika skador på fronten och gardineffekt på lamellytans elektronstråle visar framstegen under fräsningsprocessen här vi kan se den slutliga polerade lamellen Den slutliga tjockleken på lamell måste vara mindre än tvåhundrafemtio nanometer för att vara transparent för överföring av elektronstråle illustrationen av lameller frästa i cellkluster och monoskikt med för- och nackdelar med båda provtyperna galler med lamali överförs mycket försiktigt genom beredningskammaren tillbaka till lastkrukan torkrukan kyls ner och fylls med färskt och rent flytande kväve för att undvika iskontaminering av malda lamalinät avlägsnas från skytteln och returneras tillbaka till rutnätslådan prov med fräst lamali överförs slutligen till överföring elektron cryo mikroskop rutnät måste vara nittio grader roteras innan införing till TEM autoloader kassett för att säkerställa korrekt orientering av lamellen med avseende på TEM tilt access Lamili screenas och region av intresse för förvärv av kryoelektron tomografiska data är lokaliserad Lamella huvudaxel är vinkelrät mot mikroskopets lutningsaxel för att se rätt synfält vid hög lutningsvinklar dosimetrisk metod används för att samla in kryoelektrontomografidata som samlas in tomogram bearbetas sedan i Etomo programvara och monolayer segmenterad i Amira programvara I detta protokoll visade vi dig hur du effektivt förbereder ett jästcellsprov för en lamell mikromaskin med cryofokuserad jonstrålefräsning och hur man förbereder och bearbetar elektrontomografidata och cell lamali
Vi presenterar ett protokoll för lamella beredning av dopp frysta biologiska exemplar genom cryo-fokuserade jonstråle micromachining för högupplösta strukturella studier av makromolekyler på plats med cryo-elektron tomografi. Det presenterade protokollet innehåller riktlinjer för beredning av högkvalitativa lameller med hög reproducerbarhet för strukturell karakterisering av makromolekyler inuti Saccharomyces cerevisiae.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved