Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bu video kriyo-elektron tomografisi için maya salmonella hazırlanmasına odaklanacak Hücre ekiminden kriyo-elektron tomografisine kadar iş akışından geçeceğiz Saccharomyces cerevisiae süspansiyonda iyon numunesi hazırlanması için yetiştirilir Hücre ekimi için orta seviyeye çıkarılan on mililitre steril mayanın laminar akış kutusunun içindeki steril koşullarda çalışması önerilir Yetiştirme şişesini sterilize etmek için sterilize etmek için yüzde yirmi glikoz eklenir ekim ortamına sahip şişe bir maya kolonisi ekim plakamızdan özenle toplanır ve ekimde hazırlanan büyüme ortamına aktarılır şişe ekimi şişesi daha sonra folyo ile kaplanır ve hücreleri dağıtmak için iyice karıştırılır hücre kültürü inkübatöre yerleştirilir ve üstel faza ulaşana kadar sürekli ajitasyon ile otuz derecede yetiştirilir maya hücre kültürü üstel faza kadar büyür ve hücre fiziksel yoğunluğu ile ölçülür Referans örnek hücre kültürü blanche donmadan önce gliserolün yüzde beşine ek olarak OD1 veya OD30'a karşı metre tutma Elektro-mikroskobik ızgaralar yüzeyi temizlenir ve plazma ızgaraları tarafından hücre süspansiyonu uygulanması için etkinleştirilir karbon tarafına bakan kızdırma boşaltma odasına yerleştirilir ve plazma temizleme prosedürü otuz ila kırk beş saniyeye ayarlanır EM ızgaraları şimdi ve hücre için hazır örnek uygulama EM ızgaralarında maya hücre süspansiyonunun vitrifikasyonu, Vitrobot makinesi kullanılarak sıvı etan içine blanche dondurulması ile yapılır Sıvı etan hazırlanması, hücre süspansiyonlu sıvı nitrojen EM ızgarası ile soğutulmuş bir metal bardakta etan gazının sıvılaştırılması ile gerçekleşir, arka taraftan filtre kağıdı ile şişirilir ve ön karbon taraftan bükülmüş yapışkan olmayan plastik ile Vitrobot odasının içindeki sıcaklık Vitrobot ekranında on sekiz derece ve nem yüzde yüz bekleme süresi, leke süresi ve leke kuvveti de ayarlanır Işıma deşarj ızgarası Vitrobot cımbızları tarafından toplanır ve cihaza monte edilir Üç nokta beş mikrolitre Saccharomyces cerevisiae süspansiyonu Vitrobot iklim odasının içindeki ızgaranın karbon tarafına uygulanır Süspansiyonun ızgara ızgarasının her uygulaması blanche dondurulmadan önce düzgün bir şekilde karıştırılması gerekir. vitrifiye hücreli sıvı etan elektro-mikroskopi ızgaraları sıvı nitrojen koşullarında saklanır veya kriyo SEM mikroskobuna yüklenmek üzere ızgara kartuşuna monte edilir Vitrifiye hücreli ızgara daha sonra hem SEM hem de TEM mikroskoplarına yüklenmeye uygun ızgara kartuşuna sabitlenir C-clip halkası kırpma aletine monte edilir ve sıvı nitrojen ızgarasında soğutulur, ızgara kartuşu karbonuna aşağı bakacak şekilde yerleştirilir ve C-klips halkası numunesi daha sonra özel ızgara kutusuna yerleştirilir Lamila hazırlama için numune çift ışın FIB / SEM mikroskobuna yüklenir ve kriyo-aşama hazırlama odası yükleme kabına sığar düzgün bir şekilde soğutulur ve mekik adı verilen sıvı azot numune tutucusu ile doldurulur ve numuneli ızgara kutusu depolama dewarından tencereye aktarılır ve ızgaralar iki yuvaya yerleştirilir. FIB ızgara kartuşlarının kullanılması durumunda hücreler yukarı bakacak şekilde mekik karbon tarafı, ızgara kartuşunun kesilmesi, mekik ızgaralarında saat on ikiye kadar dikkatlice hizalanmalıdır vida ile sıkılır ve mekik yükleme pozisyonuna aşağı doğru aşağı doğru çevrilir yükleme potu transfer istasyonuna yerleştirilir ve kapakla kaplanır Yükleme kabı ile transfer odası kapağın üstüne yerleştirilir ve ızgaralı düşük vakumlu mekik çubuk üzerine tutturulmuş ve hazırlık odasına toplanan küçük transfer odası odalarının içine kapatılmış ve yüksek vakumlu SEM oda aşamasında kriyo aşamasına mekik yerleştirilir kırk beş dereceye eğilir ve gaz enjeksiyon sistemi iğnesini yerleştiren ızgaranın merkez konumuna dört milimetre hareket ettirilir, odaklanmış sırasında radyasyon hasarına karşı biyolojik numune üzerinde koruyucu organik tabaka oluşturur İyon ışını freze ızgaraları daha sonra hücre kümesinde lamellerin biyolojik malzeme odaklı iyon kiriş frezelemesinde iletken tabaka oluşturmak için inorganik metalin ince örtüsü ile kaplanır veya monolayer birkaç adımda yapılır aşama frezeleme açısına taşınır ilgi alanı bulunur ve üst ve alt frezeleme desenleri oluşturulur kaba lamel fib akımının kademeli olarak azalması ve lamel kalınlığı ile öğütülür lamellerin son parlatılması lamel yüzey elektron kirişi üzerinde ön uç hasarını ve perdeleme etkisini önlemek için sadece üst desen ve düşük FIB akımı ile gerçekleştirilir, buradaki frezeleme işlemi sırasındaki ilerlemeyi gösterir Son cilalı lamel son kalınlığının, elektron ışınının iletilmesi için şeffaf olması için iki yüz elli nanometreden az olması gerekir Hücre kümesinde öğütülmüş lamel ve monolayer çizimi artıları ve eksileri ile lamali ile her iki numune tipi ızgaralar çok nazikçe hazırlık odasından yükleme potasına geri aktarılır ve öğütülmüş lamali ızgaralarının buz kirlenmesini önlemek için taze ve temiz sıvı azotla doldurulur ve değirmenli lamali ile ızgara kutusu örneğine geri döndürülür, son olarak TEM otomatik doldurucu kasetine takılmadan önce doksan derece döndürülmesi gerekir. LAMELLA'nın TEM eğim erişimine uygun şekilde yönlendirilmesini sağlamak için Lamili taranır ve kriyo-elektron tomografik verilerin eldei için ilgi alanı lokalize edilir Lamella ana ekseni mikroskobun eğim eksenine diktir doğru görüş alanını yüksek eğim açılarında görmek için dozimetrik yöntem kullanılır toplanan tomogram verileri toplamak için kullanılır daha sonra Etomo yazılımında işlenir ve Amira'da monolayer segmenter yazılım Bu protokolde kriyo odaklı iyon ışını frezeleme kullanarak bir lamel mikro makine için bir maya hücresi örneğinin verimli bir şekilde nasıl hazırlanacağını ve elektron tomografi verilerinin ve hücre lamalinin nasıl hazırlanacağını ve işlendiğini gösterdik.