Denne budsjettvennlige magnetiske perlebaserte DNA-ekstraksjonsprotokollen gjør høy gjennomstrømningssekvensering tilgjengelig for ressursbegrensede laboratorier og studier. Denne protokollen krever ikke dyrt utstyr for DNA-ekstraksjon av høy kvalitet, og det kan være nyttig i visse diagnostiske eller forskningssituasjoner der det er utfordrende å skaffe tilstrekkelig mengde DNA med en kvalitet for høy gjennomstrømningssekvensering. Denne protokollen er enkel å replikere med en engangsdemonstrasjon.
Det bør prøves med et lite antall eksempler først for å bli kjent med arbeidsflyten. For å begynne med, hydrer myggvevsprøvene som er lagret i mer enn 70% alkohol ved å legge til 100 mikroliter PCR-klasse vann og inkubere i en time ved fire grader Celsius for å myke vevet. Etter inkubasjonen, kast vannet og tilsett 100 mikroliter Proteinase K bufferenzymblanding.
Bruk deretter en mikrocentrifuge tube pestle for å homogenisere vevet. Etter homogenisering, sentrifuger vevet lysat og inkubere i to til tre timer ved 56 grader Celsius. For å trekke ut DNA lyser pipette 100 mikrolitere av vevet inn i et nytt rent mikrosenterrør.
Tilsett deretter 215 mikroliter av den magnetiske perlemasterblandingen. Bruk en pipette, bland lysatet og den magnetiske perleblandingen i 10 til 20 sekunder, og la den stå i 10 minutter ved romtemperatur. Under inkubasjonen rister du forsiktig røret av og til for å maksimere bindingen av DNA til de magnetiske perlene.
Deretter plasserer du røret på den magnetiske perleseparatoren til løsningen blir klar. Deretter aspirerer du væsken forsiktig fra røret uten å forstyrre de magnetiske perlene som holder DNA-et. Flytt røret bort fra den magnetiske perleseparatoren og vask perlene ved å tilsette 325 mikroliter vaskebuffer en.
Bland grundig ved pipettering og inkuber i ett minutt ved romtemperatur. Etter inkubasjonen plasserer du røret på den magnetiske perleseparatoren og fjerner supernatanten som tidligere demonstrert, flytt deretter røret bort fra den magnetiske perleseparatoren og vask perlene en gang med vaskebuffer en. Etter den andre vasken med buffer en, vask perlene to ganger med 250 mikroliter vaskebuffer to på samme måte.
Etter den siste vasken, flytt røret bort fra den magnetiske perleseparatoren og tilsett 100 mikroliter elutionbuffer. Bland grundig ved pipettering og inkuber deretter røret i to minutter ved romtemperatur før du setter det tilbake på magnetseparatoren. Når løsningen blir klar, overfør supernatanten til et nytt, rent mikrosenterrør på 0,5 milliliter og oppbevar det på riktig måte.
Vist her som en typisk mikrovolum fluorometeravlesning av mygg-DNA i en elutionbuffer som inneholder 0,5 millimolar EDTA. Gjennomsnittlig 260 til 280 nanometerabsorberingsforhold er 2,3. Denne tabellen viser kostnadene og antall prøver som behandles i én arbeidsdag for ulike utvinningsmetoder.
Den typiske reagens- og forbrukskostnaden for en utvinning av denne protokollen er rundt 9,50 per prøve. Denne kostnaden tilsvarer enhver typisk magnetisk perlebasert ekstraksjonsmetode. Den største kostnadsfordelen ved denne protokollen kommer fra å ikke kreve det automatiserte DNA-ekstraksjonsinstrumentet.
Sørg for å endre pipettespisser mellom prøver for å forhindre krysskontaminering av DNA når du arbeider med flere prøver. Vi bruker DNA av høy kvalitet ekstrahert ved hjelp av denne metoden for hele genomsekvensering. Vi bruker for tiden sekvenseringsdataene til å identifisere nye mutasjoner i insektmiddelresistens eller immungener av bekymring i folkehelse- og sykdomskontroll.
Å ha rimelige løsninger for sekvensering med høy gjennomstrømning åpner spennende dører for populasjonsgenomikk og landskapsgenomikk med sikte på å forstå myggspredning og genflyt som påvirker suksessen til mange nye genetiske kontrollstrategier.
