Name: sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

We willen Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha en Kevin Wilkinson bedanken voor hun steun bij de ontwikkeling van het Cryogenic Sample Transfer System (CTS). Dit werk werd gefinancierd door iNEXT-Discovery (Grant 871037) gefinancierd door het Horizon 2020-programma van de Europese Commissie.

1. Kristal oogsten
OPMERKING: Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen: brillen en handschoenen, waar mogelijk.
<ol><li>Nadat de SHs in combipucks bij het gebruikerslaboratorium zijn aangekomen (figuur 3C), scheidt u het deksel van de basis van de combipuck, zodat de SHs aan de basis blijven vastzitten en de injectieflacons in het deksel worden vastgehouden.</li>
	<li>Dompel het deksel met injectieflacons onder in vloeibare stikstof. Bevestig een SH + adapter (figuur 3B, rechts) aan een magnetische staaf en oogst kristallen zoals gewoonlijk.</li>
	<li>Flash-koel elk monster rechtstreeks in de combipuck, waarbij de monsterpositie wordt genoteerd. Om de puck te sluiten, gebruik je een puck-toverstaf om de basis aan het deksel te bevestigen.</li>
	<li>Breng de combipuck over van vloeibare stikstof naar de droge verzender of vloeibare stikstofopslag dewar. Verzend de droge verzender naar Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>2. Monsteroverdracht naar vacuüm
<ol><li>Laden van SH van combipuck naar het transferblok<ol>
<li>Plaats de basis van de blokpuck (figuur 3H) die al gevuld is met lege transferblokken (figuur 3D) op de steunbasis in de vloeibare stikstof in een schuimcontainer (figuur 3J-b). OPMERKING: De oriëntatie van de transferblokken is belangrijk voor de nauwkeurigheid van de monsteroverdracht in het vacuümvat. Als zodanig moeten de blokken op de puckbasis van het blok worden geplaatst en ervoor zorgen dat de pin gemarkeerd met een pijl in Figuur 3D zich aan de linkerkant van het blok bevindt.</li>
		<li>Plaats de puck van de injectieflacon in de schuimcontainer gevuld met vloeibare stikstof en zorg ervoor dat de basis van de puck is bevestigd aan de magnetische houder in de schuimcontainer (figuur 3J-a).</li>
		<li>Koel alle benodigde gereedschappen voor in vloeibare stikstof. Gebruik het puckscheidingsgereedschap in figuur 3G op de hoge instelling H om het deksel van de basis te scheiden, zodat de basis aan de magnetische houder blijft bevestigd en de SF's in de vloeibare stikstof worden blootgesteld.</li>
		<li>Om elke SH van zijn adapter te verwijderen, gebruikt u de scheidingsstaaf (figuur 3F) om de SH van de combipuckbasis op te pakken en in de juiste positie van het overdrachtsblok in de horizontale positie van de carrousel in figuur 3J-b te plaatsen.<ol>
<li>Plaats de scheidingsstaaf over de SH + adapter zo ver mogelijk naar beneden en zorg ervoor dat de toverstaf verticaal is, om te voorkomen dat het monster wordt aangeraakt.</li>
			<li>Beweeg de kleine hendel op de scheidingsstaaf naar beneden met de duim totdat deze klikt, om de SH binnenin vast te zetten en trek de SH uit de adapter.</li>
			<li>Laat de separator over de gewenste blokpositie zakken en zorg ervoor dat een van de drie tanden in het centrale gat van het blok past.</li>
			<li>Laat de SH los door de hendel weer omhoog te bewegen. Herhaal deze stappen voor elke SH.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Als u monsters in het volgende monsterblok wilt laden, gebruikt u het gereedschap carrouselsleutel (figuur 3E) om een leeg blok in de horizontale positie te draaien.</li>
		<li>Bevestig het puckscheidingsgereedschap in figuur 3G met behulp van de lage instelling L aan het deksel van de blokpuck door met de klok mee te schroeven.</li>
		<li>Zodra alle SHs zijn overgebracht, plaatst u het deksel in vloeibare stikstof om de blokpuck te sluiten en wacht u tot de temperatuur in evenwicht is en plaatst u het deksel over de basis zoals in figuur 3I. Til met het scheidingsgereedschap bevestigd voorzichtig op om los te komen van de carrousel.</li>
		<li>In dit stadium kan de blokpuck worden overgebracht naar de CTS (figuur 4B) of naar een opslag van vloeibare stikstof.</li>
	</ol></li>
	<li>Laden van transferblokken in het vacuümvat<ol><li>Zorg ervoor dat de shuttle veilig aan het station is bevestigd. Open de stikstofgas- en luchtkleppen en zorg ervoor dat de gassen stromen. Schakel de CTS in.</li>
		<li>Als er geen waarschuwingssignalen op het display verschijnen, koelt u zowel het bad als de shuttle af met vloeibare stikstof. Plaats de meegeleverde trechter in de vulpoort op de shuttle en giet langzaam vloeibare stikstof in de trechter terwijl u het niveau op het scherm bewaakt. Stop wanneer de indicator van rood naar blauw verandert. OPMERKING: De shuttle is klaar voor gebruik wanneer de temperatuur van de koude stoel op het touchscreen lager is dan 100 K. Het Sample Station-bad kan tegelijkertijd worden gevuld met behulp van de juiste trechter tot het niveau dat op de wand van het bad is aangegeven of 100% op het display met het vloeibare stikstofgehalte. Vloeibare stikstofniveaus en temperatuursensoren moeten tijdens het hele bedrijf constant worden bewaakt; er zijn meerdere herladingen nodig.</li>
		<li>Zodra de koude stoeltemperatuur van de shuttle lager is dan 100 K en de vloeibare stikstofniveaus op de shuttle en het bad stabiliseren, brengt u een blokpuck over van vloeibare stikstof naar het CTS-bad met behulp van het bijgevoegde puckscheidingsgereedschap. Verwijder het deksel van de blokpuck en sluit het deksel van het CTS-bad.</li>
		<li>Om een blok in de shuttle te introduceren, opent u de CTS-klep, indien nog niet geopend, door op de knop Open Shuttle Valve op het display te drukken. Ontgrendel de shuttle-handgreep door 90 ° met de klok mee te draaien en breng deze naar het bad, zodat de geleide baan op de hendel het juiste reispad naar het bad afdwingt. Zodra de blokafdekking zichtbaar is in het bad, laat u de hoes afkoelen. Nadat het borrelen van vloeibare stikstof rond de afdekking is gestopt, gaat u verder naar het overdrachtsblok.</li>
		<li>Om het transferblok op de shuttle te vergrendelen, draait u de hendel 180° met de klok mee.</li>
		<li>Trek de hendel terug naar de oorspronkelijke rugpositie en 'Vergrendel' hem vervolgens op zijn plaats door 90 ° tegen de klok in te draaien.</li>
		<li>Druk op Close Shuttle Valve & Pump op het display om de evacuatie van de shuttle te starten.</li>
		<li>Zodra het bericht Shuttle klaar om los te maken op het touchscreen wordt weergegeven, drukt u op de hendel onder de shuttle en tilt u deze voorzichtig op met behulp van het handvat aan de bovenkant.</li>
		<li>Draag de shuttle rechtop naar de luchtsluis op het vacuümeindstation.</li>
		<li>Bevestig de shuttle aan de luchtsluis op het vacuümeindstation. OPMERKING: Eenmaal stevig bevestigd, bevestigt het touchscreen op het eindstation de status van de shuttle en de vergrendeling.</li>
		<li>Selecteer een lege blokpositie in het vat door op de bijbehorende knop op het touchscreen te drukken en het monsterhotel naar de juiste laadpositie te verplaatsen.</li>
		<li>Zodra het voorbeeldhotel op zijn plaats is, wordt de knop Openen actief. Druk op deze knop om de vacuümvergrendelingsvolgorde te starten. OPMERKING: De pomp wordt gestart en de voortgang wordt weergegeven op de monitor. Dit kan tot twee minuten duren.</li>
		<li>Nadat de reeks is voltooid, verandert de status in Luchtsluis open, overdracht aan de gang. Draai het handvat 90° met de klok mee om de hengel te ontgrendelen en duw de hengel voorzichtig in het schip, zodat de geleide baan opnieuw het juiste reispad naar de positie van het monsterhotel afdwingt. Gebruik de videofeed die op het scherm wordt weergegeven voor begeleiding, plaats het blok langzaam in het hotel en zorg ervoor dat het blokpositielampje op het aanraakscherm wordt geactiveerd. Eenmaal geactiveerd, draait u de hendel 180 ° tegen de klok in om het blok los te laten en trekt u de staaf uit het vat. Eenmaal volledig ingetrokken, draai je de hendel 90° tegen de klok in om de stang te vergrendelen.</li>
		<li>Zodra de staaf is vergrendeld, wordt de knop Sluiten actief. Druk hierop om de vacuümklep van het eindstation te sluiten en de ruimte tussen de shuttle en het schip te ontluchten tot atmosferische druk, wachtend tot 20 s voor voltooiing.</li>
		<li>Wacht tot het display de status weergeeft die is goedgekeurd om de shuttle te verwijderen zodra de reeks is voltooid. Verwijder op dit punt de shuttle en keer terug naar de CTS om het proces voor het volgende blok te herhalen.</li>
		<li>Om het volgende blok voor te bereiden op overdracht, draait u de blokpuck in het bad. Duw de ingebouwde rotatiesleutel aan de bovenkant van het acryldeksel naar beneden in het slot in het midden van de blokpuck. Terwijl u het ingedrukt houdt, draait u de sleutel om het gewenste blok in de pick-uppositie te plaatsen.</li>
		<li>Zodra alle blokken zijn overgebracht, zorgt u ervoor dat de shuttleklep open is terwijl deze op de CTS is gemonteerd. Druk op de bakknop op het touchscreen en selecteer zowel bad als shuttle en druk vervolgens op bakken. OPMERKING: Dit warmt zowel de shuttle als het bad op om de vloeibare stikstof af te koken en vervolgens opgehoopt ijs / condensatie te verdampen voor het volgende gebruik. Zodra het bakken is begonnen, kunnen het gas en de lucht worden uitgeschakeld.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+haemoglobin+-+IV.+Sign+determination+by+the+isomorphous+replacement+method.">The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287 (1954).</li><li>Hendrickson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anomalous+diffraction+in+crystallographic+phase+evaluation.">Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).</li><li>Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+heavy-atom+derivatization+of+protein+crystals.">An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).</li><li>Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selenomethionyl+proteins+produced+for+analysis+by+multiwavelength+anomalous+diffraction+(MAD):+A+vehicle+for+direct+determination+of+three-dimensional+structure.">Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure.</a> The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).</li><li>Liu, Q., Hendrickson, W. A., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+use+of+anomalous+diffraction+in+biomolecular+structure+analysis.">Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis.</a> Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. 1607, 377-399 (2017).</li><li>Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+SAD+is+maturing.">Native SAD is maturing.</a> IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).</li><li>Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+potassium+ions+for+ribosome+structure+and+function+revealed+by+long-wavelength+X-ray+diffraction.">Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction.</a> Nature Communications. 10 (1), 2519 (2019).</li><li>Rocchio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+dynamic,+partially+occupied+residues+using+anomalous+scattering.">Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).</li><li>Langan, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anomalous+X-ray+diffraction+studies+of+ion+transport+in+K++channels.">Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4540 (2018).</li><li>Lolicato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K2p+channel+C-type+gating+involves+asymmetric+selectivity+filter+order-disorder+transitions.">K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions.</a> Science Advances. 6 (44), (2020).</li><li>Thorn, A., Sheldrick, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANODE:+anomalous+and+heavy-atom+density+calculation.">ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation.</a> Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).</li><li>Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+metal-binding+sites+in+proteins+with+X-ray+crystallography.">Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).</li><li>Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+amino+acid+transport+by+the+CAT+family+of+SLC7+transporters.">Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters.</a> Nature Communications. 9 (1), 550 (2018).</li><li>Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vacuum+long-wavelength+macromolecular+crystallography.">In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).</li><li>Wernecke, J., Gollwitzer, C., M&#252;ller, P., Krumrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in-vacuum+PILATUS+1M+detector.">Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+tomographic+reconstruction+of+macromolecular+samples.">X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples.</a> Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).</li><li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+membrane+protein+crystal+using+ultraviolet+laser+irradiation.">Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).</li><li>Mykhaylyk, V., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+long-wavelength+protein+crystallography:+Keeping+a+protein+crystal+frozen+in+vacuum.">Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum.</a> Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010 (2013).</li><li>Snell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+mounting+and+alignment+system+for+biological+crystallography+at+a+synchrotron+source.">Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source.</a> Structure. 12 (4), 537-545 (2004).</li><li>. The universal container project Available from: <a target="_blank" href="https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/">https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/</a> (2020)</li><li>Teng, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+freestanding+thin-film.">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).</li><li>Esposito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glycosyltransferase+activity+of+the+salmonella+effector+SseK3.">Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).</li><li>O'Donnell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+EMC+reveals+a+path+for+membrane+protein+insertion.">The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion.</a> eLife. 9, 57887 (2020).</li><li>Mishra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+characterization+of+crimean-congo+hemorrhagic+fever+virus+GP38.">Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38.</a> Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).</li><li>Rudolf, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+inhibits+its+receptor+patched+by+a+pincer+grasp+mechanism.">The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism.</a> Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).</li><li>El Omari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+sulfur+sad+phasing:+De+novo+structure+solution+of+the+n-terminal+domain+of+the+ectodomain+of+hcv+e1.">Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIA2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Buccaneer+software+for+automated+model+building.+1.+Tracing+protein+chains.">The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).</li><li>Skubak, P., Pannu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+protein+structure+solution+from+weak+X-ray+data.">Automatic protein structure solution from weak X-ray data.</a> Nature Communications. 4 (1), 2777 (2013).</li></ol>

Het huidige protocol is ontwikkeld om te voldoen aan de monstervoorbereidingsvereisten voor in-vacuüm MX-experimenten met lange golflengte op beamline I23. Het is het afgelopen jaar in gebruik geweest op de balklijn en heeft bijgedragen aan de succesvolle afronding van meerdere projecten. Zoals blijkt uit de hier gepresenteerde resultaten, maakt het protocol een veilige en betrouwbare overdracht van monsters naar het vacuümeindstation mogelijk met behoud van hun diffractiekwaliteit. Het is een belangrijk aspect voor de werking van de beamline en zal worden begeleid door persoonlijke gebruikerstraining door beamline-personeel. Sommige van de stappen zijn de moeite waard om te worden benadrukt als cruciaal voor de succesvolle en veilige voltooiing van de procedure: de overdracht van monsters van combipuck-bases naar monsterblokken vereist nauwkeurigheid en aandacht om schadelijke monsters te voorkomen (zie stap 2.1.4); monitoring van het gehalte aan vloeibare stikstof in alle stadia is belangrijk om te voorkomen dat monsters worden blootgesteld aan lucht of in nauw contact komen met delen die niet goed worden gekoeld (2.1.3 en 2.2.2); wachten tot de Close-reeks (2.2.14) volledig is voltooid, voordat de shuttle uit het eindstation (2.2.15) wordt verwijderd om degradatie van het eindstationvacuüm te voorkomen.
De conceptie van het protocol werd geïnitieerd samen met een technische inspanning gericht op het ontwikkelen van speciaal gebouwde apparatuur voor de overdracht van eiwitkristallen naar de vacuümomgeving. De eindproducten van dit project waren de CTS en de bijbehorende tools voor monsterbehandeling zoals hierboven beschreven. De CTS is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van zijn voorganger, de Leica EM VCT10014, en verwijdert meerdere beperkingen, zoals het ontbreken van monsterafscherming en vacuümomgeving tijdens overdracht, ijsophoping in het vloeibare stikstofbad en de afwezigheid van een intuïtieve gebruikersinterface en veiligheidsfuncties. Extra kenmerken van de CTS die de gebruikerservaring verbeteren, zijn temperatuur- en vloeistofstikstofniveaubewaking in de shuttle en het monsterstation, een bad met een grotere capaciteit dat vier blokken tegelijkertijd herbergt, in plaats van één, en een zelfgeleid mechanisme voor de shuttle-werking. De CTS is volledig geïntegreerd in het beamline-besturingssysteem met een gebruiksvriendelijke touchscreen-interface en verbeterde vacuüm- en mechanische veiligheid bij de koppeling met het eindstation.
Beamline I23 is het eerste MX-synchrotron-instrument met lange golflengte in zijn soort en als zodanig heeft het introduceren van eiwitkristallen in een hoogvacuümomgeving en het opslaan ervan bij cryogene temperaturen aanzienlijke inspanningen vereist. Verbeteringen aan de monstervoorbereidingstools en het protocol, evenals inspanningen om processen te stroomlijnen, zijn aan de gang. Als onderdeel van de gebruikersondersteuning zijn beamline-medewerkers altijd beschikbaar om te helpen bij het oplossen van problemen. Een voorbeeld van een dergelijk scenario zijn problemen die de integriteit van het vacuümsysteem in gevaar brengen, wat leidt tot problemen bij het bevestigen of verwijderen van de shuttle van / naar de CTS- of eindstationluchtsluis. Verschillende niveaus van tests worden wekelijks en dagelijks uitgevoerd en gebruikerstraining omvat extra controles om mogelijke storingen te voorkomen, zoals visuele inspectie van de O-ringen op de interfaces waaraan de shuttle is bevestigd. Hoewel de vacuümomgeving de mogelijkheid biedt om diffractie-experimenten uit te voeren in een golflengtebereik dat niet toegankelijk is bij andere bundellijnen, vermindert de extra overdrachtsstap de totale monsterdoorvoer.
De handmatige overdracht met slechts vier monsters per overdrachtsblok en maximaal vijf blokken in het vacuümvat beperkt de totale capaciteit tot 20 monsters. Daarom moeten voor projecten met een grote steekproef om variabiliteit te bemonsteren, monsters vooraf worden gescreend op de Diamond high-throughput beamlines, en dan moeten alleen de meest veelbelovende monsters worden overgedragen voor het daaropvolgende geoptimaliseerde langegolfexperiment. Hoewel de monsterhouders en de transferblokken ongewijzigd zijn ten opzichte van hun eerste introductie een paar jaar geleden, zijn de hier gepresenteerde handlingtools allemaal nieuwe ontwikkelingen. De speciale I23-monsterhouders zijn onveranderlijk vanwege hun rol in het koelconcept voor de beamline. Als zodanig was het ontwerp van de monsterverwerkingstools gericht op het creëren van een koppeling tussen dit nieuwe type houder en standaard commercieel beschikbare gereedschappen die de MX-gebruikersgemeenschap al lange tijd had aangenomen, zoals combipucks, kristaloogststaven en het transportsysteem voor droge verladers. Hun ontwerp omvatte aanzienlijk overleg met de gebruikersgemeenschap en vereiste verschillende iteraties om te voltooien. De apparatuur, gereedschappen en het protocol die hier worden gepresenteerd, vertegenwoordigen een eenvoudig en robuust systeem voor de overdracht van gebruikersmonsters voor experimenten op beamline I23 bij Diamond Light Source. Dit instrument voor in-vacuüm macromoleculaire kristallografie met lange golflengte opent nieuwe mogelijkheden voor de structurele biologie.

Röntgendiffractie met lange golflengte wordt gebruikt om de abnormale verstrooiingseigenschappen van specifieke lichtatomen die inheems aanwezig zijn in macromoleculen te benutten. Dit helpt om het kristallografische faseprobleem op te lossen en om de identiteit en locatie van dergelijke elementen binnen macromoleculen ondubbelzinnig te bevestigen. Terwijl in de begindagen van de macromoleculaire kristallografie de novo structuren werden opgelost door multipele isomorf substitutie1, met de komst van afstembare röntgenbundellijnen bij synchrotrons, zijn experimentele fasering op basis van multi-golflengte en single-golflengte (SAD) afwijkende diffractietechnieken de dominante methoden geworden2 . Beide methoden hebben historisch vertrouwd op het isomorf of abnormale signaal van zware metalen, die kunstmatig in de kristallen moeten worden ingebracht door co-kristallisatie of kristalweek3. De trial-and-error-aanpak en onvoorspelbare uitkomst kunnen deze experimenten frustrerend tijdrovend maken. De opname van seleno-methionine tijdens eiwitexpressie4 is een zeer elegante manier om deze beperkingen te overwinnen en abnormale diffractie op korte golflengten te benutten, hoewel het zeer uitdagend kan zijn in eukaryote eiwitexpressiesystemen.
MX met lange golflengte is zeer aantrekkelijk voor structuurbepaling door native SAD-experimenten5,6 vanwege het gemak van het gebruik van kristallen rechtstreeks uit een succesvolle kristallisatieproef zonder verdere behandeling. Bovendien opent de toegang tot de absorptieranden van elementen van hoog biologisch belang, zoals calcium, kalium, chloor, zwavel en fosfor, de mogelijkheid om de posities van deze elementen in macromoleculen direct te identificeren7,8,9,10. Bij gemiddelde en lage resolutie kan elementtoewijzing op basis van de 2Fo-Fc elektronendichtheid en chemische omgeving moeilijk zijn, vooral voor elementen met een vergelijkbaar aantal elektronen of zwak gebonden ionen met gedeeltelijke bezetting. Deze dubbelzinnigheden kunnen worden opgelost door gegevens te verzamelen onder en boven de absorptierand van het element van belang en interpretatie van het resulterende model-gefaseerde abnormale verschil Fourierkaarten11,12. Het lokaliseren van zwavelatoomposities in deze kaarten kan ook helpen bij het bouwen van modellen in kaarten met een lage resolutie elektronendichtheid13. De absorptieranden van deze lichtelementen worden waargenomen bij golflengten tussen λ = 3 en 6 Å (zie figuur 1, boven). Dit golflengtebereik is veel groter geweest dan de mogelijkheden van elke synchrotron MX-bundellijn, en efficiënte werking in dit bereik vereist het overwinnen van verschillende technische uitdagingen, zoals hieronder beschreven.
Beamline I23 bij Diamond Light Source, VK, is een uniek instrument, speciaal ontworpen om MX-experimenten met lange golflengten mogelijk te maken, afstembaar in een golflengtebereik tussen λ = 1,13 en 5,9 Å (energiebereik tussen E = 2,1 en 11 keV). Door te werken in een omgeving met een hoog vacuüm14 worden luchtabsorptie en verstrooiing geëlimineerd, waardoor de efficiëntie van diffractie-experimenten en de signaal-ruisverhouding worden verbeterd. Een groot vacuümeindstation omsluit alle componenten van de monsteromgeving, inclusief de semi-cilindrische Pilatus 12M-detector, een meerassige goniometer, de online kijk- en collimatiesystemen, evenals de op maat gemaakte apparatuur voor monsteroverdracht en opslag (figuur 2). Elk apparaat is geoptimaliseerd om ervoor te zorgen dat de beste kwaliteit lange golflengtegegevens kunnen worden verzameld. De gebogen Pilatus 12M detector kan diffractiehoeken van 2θ = ±100° verzamelen, wat resulteert in voldoende hoge resolutie diffractiegegevens, zelfs op de langste golflengten (figuur 1, onder). De 120 detectormodules zijn specifiek geselecteerd voor compatibiliteit met lage energie en er zijn kalibraties voor een extra ultrahoge versterkingsmodus geleverd.
De laagst mogelijke detectordrempel is 1,8 keV, wat leidt tot verhoogde hoek- en randeffecten voor energieën lager dan 3,6 keV en gecompromitteerde gegevenskwaliteit op de langste golflengten, met name voor kristallen met een lage mozaïekdichtheid, kan worden waargenomen. Dit effect in combinatie met de afname van de kwantumefficiëntie van de detector15 moet in aanmerking worden genomen bij het plannen van een experiment. De meerassige goniometer maakt heroriëntatie van kristallen mogelijk om strategieën voor gegevensverzameling mogelijk te maken die de kwaliteit en sterkte van het afwijkende signaal maximaliseren, evenals de volledigheid van de verzamelde abnormale gegevens. Monsterabsorptie is een beperkende factor voor de experimenten, vooral op de langste golflengten. Absorptiecorrecties, zoals geïmplementeerd in veelgebruikte MX-verwerkingssoftwarepakketten16,17, werken goed tot golflengten rond 3 Å. Langere golflengten vereisen analytische absorptiecorrecties op basis van tomografische reconstructies18 of laserablatie om niet-diffracterend materiaal te verwijderen en de kristallen in goed gedefinieerde vormen te snijden19. Dit laatste zal ook helpen bij het verkleinen van grotere kristallen, omdat röntgendiffractie-experimenten op langere golflengten efficiënter zijn voor kleinere kristallen14. De uitdaging om monsters tijdens het verzamelen van gegevens bij cryogene temperaturen te houden, wordt aangepakt door geleidende koeling, omdat het gebruik van open-flow koude gasstroomapparaten niet compatibel is met een vacuümomgeving. Daarom zijn thermisch geleidende materialen, zoals koper, nodig voor het aansluiten van het monster op een cryocooler met pulsbuis. De roestvrijstalen SPINE-standaardpennen die in mx worden gebruikt, evenals andere in de handel verkrijgbare monsterbevestigingen, zijn niet geschikt voor mx met lange golflengte in vacuüm vanwege hun slechte thermische geleidbaarheid.
De monsterhouders (SHs) voor mx in vacuüm moeten een essentieel onderdeel zijn van de thermische warmteafvoerroute (figuur 3A). Als zodanig bestaan ze uit een thermisch geleidend koperen lichaam en pin en bevatten ze twee belangrijke kenmerken: een sterke magneetbasis om een adequate thermische verbinding met de koude goniometerkop te garanderen, en een monsterbevestiging, gemaakt van polyimide, om röntgenabsorptie en verstrooiing te minimaliseren20. Er werden inspanningen geleverd om ervoor te zorgen dat de gebruikerservaring van kristaloogst en flash-koeling bijna identiek is aan die van standaard MX-praktijken. Omdat de speciale I23 SF's niet direct compatibel zijn met andere synchrotronbundellijnen, wordt een roestvrijstalen adapter gebruikt voor compatibiliteit met de kristaloogst magnetische staven en bestaande goniometerinterfaces op andere MX-beamlines (figuur 3B). De adapter is ook belangrijk voor het gebruik van de automatiseringsfaciliteiten op andere Diamond MX-beamlines, die zijn gebaseerd op ROBOTGRIJPERKOPPEN21 van het ALS-type en ongekuipingsachtige basislay-outs22, als monstervariatie een snelle voorscreening vereist voor selectie van de beste diffracterende kristallen. Het protocol voor monstervoorbereiding en -laden kan worden onderverdeeld in twee fasen:
Fase 1: Het oogsten van kristallen en het flashvriezen uitgevoerd door gebruikers in hun eigen laboratoria
Na beoordeling van de geschiktheid van het project voor I23-gegevensverzameling, worden monsterhouders met lussen die overeenkomen met de kristalgroottes (voorgemonteerd met adapters) naar gebruikerslaboratoria gestuurd voor kristaloogst. Om schade te voorkomen, mogen SF's en adapters niet worden gescheiden en moeten ze als één eenheid worden gebruikt voor het vissen op kristallen met lussen van de juiste grootte met behulp van standaard magnetische staven voor het oogsten van kristallen. Zoals gebruikelijk in MX, wordt deze taak handmatig uitgevoerd onder de microscoop en worden kristallen onmiddellijk geflitst in een schuimdewar met vloeibare stikstof23. Door een mismatch van magnetische krachten zijn de SF's momenteel niet compatibel met unipucks. Opslag en verzending worden gerealiseerd met behulp van combipucks (zie de tabel met materialen), die op verzoek beschikbaar zijn voor gebruikers, samen met de compatibele droge verzender inzetstukken (figuur 3C). Deze pucks delen dezelfde basisplaat met de veel gebruikte unipucks en maken een snelle voorscreening van monsters bij andere Diamond MX-beamlines mogelijk. Het uitlenen van deze apparatuur aan gebruikers is momenteel de beste regeling, totdat de op maat gemaakte monsterhouders commercieel beschikbaar zijn. Transport naar de beamline vereist de standaard droge verladers die in de MX-gemeenschap worden gebruikt.
Fase 2: Overdracht van cryogekoelde monsters naar het vacuümeindstation
Zodra de monsters op de bundellijn aankomen, worden ze voorbereid voor overdracht naar het vacuümeindstation. Dit omvat het verwijderen van SHs uit combipucks en scheiding van adapters. Het introduceren van biologische monsters om te vacuüm wordt routinematig uitgevoerd op het gebied van cryo-elektronenmicroscopie. Enkele van de gevestigde concepten werden aangepast voor de I23-monsteroverdracht. Kortom, SF's worden onder vloeibare stikstof overgebracht op transferblokken (figuur 3D). Deze blokken hebben een uitstekende thermische geleidbaarheid en een aanzienlijke thermische massa, waardoor de kristallen in vacuüm niet de glasovergangstemperatuur bereiken. Maximaal vier blokken, met elk een capaciteit van vier monsters, worden onder vloeibare stikstof in een blokpuck geladen (figuur 3H), die wordt gebruikt voor het overbrengen van monsters naar het cryogene overdrachtssysteem (CTS) of voor opslag in vloeibare stikstofdewars tussen experimenten.
Het cryogene overdrachtssysteem dat bij Diamond Light Source is ontwikkeld, bestaat uit twee subassemblages, het monsterstation en de shuttle (figuur 4A). Het Sample Station bestaat uit een bad met vloeibare stikstof voor tijdelijke opslag van eiwitkristallen en heeft specifieke kenmerken om de veiligheid te waarborgen en een gebruiksvriendelijke ervaring mogelijk te maken (figuur 5). De CTS wordt bestuurd door een programmeerbare logische controller via een gebruiksvriendelijke touchscreen-interface. Het sample station heeft ingebouwde lichtgevende diodes voor een betere visualisatie en een set kachels die in close-loop worden geregeld om het drogen van het vloeibare stikstofbad te automatiseren zodra de monsters zijn overgebracht. Het heeft ook een verscheidenheid aan sensoren om de veiligheid en efficiënte werking van het systeem te garanderen. Het sample station heeft op maat gemaakte hardware om een betrouwbare elektrische interface te bieden voor interactie met de shuttle voor bewerkingen, zoals pompen naar ruw vacuüm voor monsteroverdracht, evenals monitoring van vloeibare stikstofniveaus en de temperatuur in de shuttle.
De Shuttle (figuur 6) is een draagbaar apparaat dat wordt gebruikt om een overdrachtsblok van het vloeibare stikstofbad van het monsterstation op te pakken en over te brengen in een cryogene en vacuümomgeving naar het eindstation. Het omvat een vloeibare stikstof dewar om de monsters koud te houden tijdens de overdracht, vloeistofniveaubewaking in de dewar en een verscheidenheid aan sensoren voor werking en gebruikersveiligheid. De transferarm is uitgerust met een magnetische aandrijving en bevat bewerkte groeven om gebruikers te begeleiden bij het veilig laden en lossen van transferblokken in het eindstation. De overdracht van de shuttle naar het vacuümvat verloopt via een luchtsluis. De luchtsluis is een interface voor de shuttle op het eindstation die wordt gebruikt om de tussenruimte tussen de shuttle en het eindstation te evacueren, voordat de shuttle- en eindstationvacuümkleppen worden geopend. De pomp- en ontluchtingssequenties zijn volledig geautomatiseerd en kunnen worden bediend via een groot touchscreen met een gebruiksvriendelijke interface (figuur 4C). Het huidige protocol wordt gebruikt om een thaumatinekristal over te brengen naar het vacuümeindstation voor gegevensverzameling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12M detector</td>
			<td>Dectris, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>single-photon-counting X-ray detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CombiPuck</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-P1</td>
			<td>Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal-harvesting magnetic wand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td>Used for harvesting crystal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Shipper (CX100)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-21</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-PTC1</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton polyimide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sample mount made of Kapton polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perpsex lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>acrylic lid with built-in rotation key</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin powder</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source

Lange golflengte macromoleculaire kristallografie (MX) maakt gebruik van de abnormale verstrooiingseigenschappen van elementen, zoals zwavel, fosfor, kalium, chloor of calcium, die vaak inheems aanwezig zijn in macromoleculen. Dit maakt de directe structuuroplossing van eiwitten en nucleïnezuren mogelijk via experimentele fasering zonder dat aanvullende etikettering nodig is. Om de significante luchtabsorptie van röntgenstralen in dit golflengteregime te elimineren, worden deze experimenten uitgevoerd in een vacuümomgeving. Beamline I23 bij Diamond Light Source, VK, is het eerste synchrotroninstrument in zijn soort, ontworpen en geoptimaliseerd voor MX-experimenten in het lange golflengtebereik tot 5 Å. 
Om dit mogelijk te maken, omsluit een groot vacuümvat alle eindstationcomponenten van de monsteromgeving. De noodzaak om monsters bij cryogene temperaturen te houden tijdens opslag en gegevensverzameling in vacuüm vereist het gebruik van thermisch geleidende monsterhouders. Dit vergemakkelijkt een efficiënte warmteafvoer om monsterkoeling tot ongeveer 50 K te garanderen. Het huidige protocol beschrijft de procedures die worden gebruikt voor monstervoorbereiding en overdracht van monsters in vacuüm op beamline I23. Om uniformiteit te garanderen in praktijken en methoden die al zijn vastgesteld binnen de macromoleculaire kristallografiegemeenschap, kan monsterkoeling tot vloeibare stikstoftemperatuur worden uitgevoerd in elke laboratoriumomgeving die is uitgerust met standaard MX-gereedschappen. 
Cryogene opslag en transport van monsters vereisen alleen standaard commercieel beschikbare apparatuur. Gespecialiseerde apparatuur is vereist voor de overdracht van cryogenisch gekoelde kristallen van vloeibare stikstof naar het vacuümeindstation. Op maat gemaakte monsterverwerkingstools en een speciaal cryogene overdrachtssysteem (CTS) zijn in eigen huis ontwikkeld. Diffractiegegevens die zijn verzameld op monsters die met dit protocol zijn gemaakt, tonen uitstekende samenvoegstatistieken, wat aangeeft dat de kwaliteit van de monsters ongewijzigd blijft tijdens de procedure. Dit opent unieke mogelijkheden voor in-vacuum MX in een golflengtebereik dat verder gaat dan standaard synchrotronbundellijnen.

Een thaumatinekristal werd geïntroduceerd in het vacuümeindstation met behulp van het hierboven beschreven protocol. Diffractiegegevens werden verzameld bij een golflengte van 2,7552 Å (E = 4500 eV) als 3600 beelden met een rotatietoename van 0,1° en 0,1 s belichting per beeld. De bundelgrootte werd aangepast tot 150 μm x 150 μm en teruggebracht tot 10% transmissie, met een overeenkomstige fluxmeting van 7,1 x 109 fotonen/s. De keuze voor λ = 2,7552 Å is gebaseerd op een compromis tussen de toename van abnormale signaal- en monsterabsorptie-effecten en de afname van de resolutie tot langere golflengten. Hoewel niet dicht bij de theoretische absorptierand van zwavel (λ= 5,0095 Å), is de denkbeeldige bijdrage aan de verstrooiingsfactor van zwavel f" bij deze golflengte 1,57 e- , een factor van 1,6-2,1 groter in vergelijking met golflengten tussen 1,7 en 2 Å. De resulterende sterkere afwijkende signalen maken een succesvolle S-SAD-fasering mogelijk voor meer uitdagende projecten.
Op beamline I2324,25,26,27 zijn al verschillende moeilijke faseringsexperimenten uitgevoerd, waarbij gegevens op deze golflengte zijn verzameld. Hoewel fasering door S-SAD mogelijk is met behulp van veel kortere golflengten, vereist dit vaak het opbouwen van een afwijkend signaal door gegevens van veel isomorfkristallen samen te voegen om multipliciteitswaarden te bereiken over 10028. Vanwege het verbeterde afwijkende signaal op langere golflengten, hadden de meeste faseringsprojecten die op I23 werden opgelost slechts gegevens van één kristal nodig. Een representatief diffractiebeeld is weergegeven in figuur 7, links. Gegevensverwerking met behulp van Xia2-3dii29 leverde uitstekende samenvoegstatistieken op, zoals beschreven in tabel 1. Figuur 7, rechts, toont een deel van een representatief diffractiebeeld uit de thaumatinegegevensset en illustreert de lage achtergrond rond de Bragg-reflecties, wat bijdraagt aan de grote I / σ (I) -waarden die doorgaans worden waargenomen in de vacuümopstelling, zodat alleen röntgenstralen die door het monster worden verstrooid, de detector bereiken.
De maximaal haalbare resolutie van 1,8 Å is te danken aan de detectorgeometrie en de gekozen golflengte van de röntgenstraling. De dataset leverde een zeer sterk afwijkend signaal op, weerspiegeld in de mid-slope van abnormale normale waarschijnlijkheidsparameter van 2,677, waardoor de structuuroplossing door de automatische faseringspijplijn CRANK2 werd vergemakkelijkt. De hoge kwaliteit van de resulterende elektronendichtheidskaart maakte succesvolle automatische modelbouw door de Buccaneer30-module binnen CRANK231 mogelijk, met de juiste plaatsing voor 100% van de aminozuursequentie van thaumatine. De gefaseerde anomalieverschil Fourierkaart, berekend met ANODE11, onthult 16 zeer goed geordende zwavelatomen en één zwavelatoom van Cys159 met twee alternatieve conformaties, zoals bevestigd door de 18 significante hoogten van de pieken op de posities van de abnormale verstrooiers in tabel 2. De 16 cysteïneresiduen in thaumatine vormen 8 disulfidebruggen, die allemaal duidelijk zichtbaar zijn in de 2Fo-Fc-kaart (figuur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> Figuur 1: Diffractiegegevens met hoge resolutie van MX-experimenten met lange golflengte. (A) Plot van f"-waarden tegen energie, met vermelding van absorptieranden van lichtelementen die toegankelijk zijn op beamline I23. (B) Maximale resolutie haalbaar op de hoeken van de P12M-detector tegen energie. Afkorting: MX = macromoleculaire kristallografie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> Figuur 2: Horizontale doorsnede door het vacuümvat met alle componenten van het eindstation. Afkorting: OAV = on-axis viewing system. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> Figuur 3: Gereedschap voor het hanteren van monsters. (A) I23 Monsterhouder. (B) MX spine-standard pin (links) naast een I23 sample houder met adapter (rechts). (C) Combipuck deksel en basis met I23 monsterhouders (blauw). Blok puck deksel en basis met twee transfer blokken (goud). Een dry shipper stok, compatibel met zowel combipucks als blokpucks, is zichtbaar aan de achterkant. D) Overdrachtsblok met vier I23-monsterhouders. (E) Belangrijkste gereedschap dat wordt gebruikt voor het roteren van de blokpuckbasis. (F) Afscheidingsstok. (G) Puck separator tool met twee pijlen die de hoge en lage instellingen weergeven. (H) Blok puck basis met vier lege Cu blokken. (I) Deksel voor de blokpuck. (J) Schuimcontainer met alle benodigde gereedschappen voor het overbrengen van monsterhouders van combipuck-bases naar koperen blokken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> Figuur 4: Cryogenic Transfer System. (A) CTS-monsterstation met pendel bevestigd en de trechters die worden gebruikt voor het vullen. (B) Een blokpuck met twee overdrachtsblokken in de CTS. (C) CTS-besturingssoftware touchscreen. Afkorting: CTS = Cryogenic Transfer System. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> Figuur 5: Monsterstation cryogene transfersysteem. Afkortingen: LED's = light-emitting diodes; LN2 = vloeibare stikstof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> Figuur 6: Cryogenic Transfer System Shuttle. Afkortingen: LED's = light-emitting diodes; LN2 = vloeibare stikstof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> Figuur 7: Diffractiebeelden. Links een diffractiebeeld uit de dataset verzameld op het thaumatinekristal. Rechts, een diffractieplek omringd door low-count achtergrondpixels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> Figuur 8: Structuuroplossing van Thaumatine met automatische pijplijn-CRANK2 (standaardinstellingen, geen latere verfijning). (A) Overzicht van thaumatine met 2Fo-Fc-kaart bij 1,6σ (blauw) en gefaseerd afwijkend verschil Fourierkaart bij 5σ berekend in ANODE (groen). (B) Overzicht van thaumatine met alleen het gefaseerde afwijkende fourierbeeld bij 5σ. (C) Close-up van een disulfidebrug aanwezig in thaumatine met 2Fo-Fc kaart op 1,6σ (blauw) en gefaseerd afwijkend verschil Fourierkaart op 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Naam</td>
			<td>Thaumatine</td>
		</tr>
<tr>
<td>Golflengte van gegevensverzameling (Å) (energie (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aantal afbeeldingen x wiggrootte (°)</td>
			<td>3600 x 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ruimtegroep</td>
			<td>
T 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eenheidscelconstanten</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resolutie (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volledigheid</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Veelheid</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Middenhelling</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Gegevensverzameling en -verwerking van gegevens voor Thaumatine bij 2.755 Å golflengte bij beamline I23, DLS. Voor resolutie, volledigheid, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) en veelheid worden shells met een hoge resolutie tussen haakjes weergegeven. Afkorting: DLS = Diamond Light Source.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Dichtstbijzijnde atoom</td>
			<td>Piekhoogte (sigma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>Met112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cys71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Afwijkend verschil Fourierkaart piekhoogtes zoals berekend door ANODE met behulp van het gefaseerde en automatisch gebouwde model van CRANK2.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Hier presenteren we een protocol voor cryogene monstervoorbereiding en overdracht van kristallen naar het vacuümeindstation op beamline I23 bij Diamond Light Source, voor macromoleculaire röntgenkristallografie-experimenten met lange golflengte.

Monstervoorbereidings- en overdrachtsprotocol voor in-vacuüm kristallografie met lange golflengte op Beamline I23 bij Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Macromoleculaire kristallografie met lange golflengte maakt gebruik van het afwijkende signaal van lichtatomen die van nature aanwezig zijn in eiwitten en nucleïnezuren. Deze techniek wordt gebruikt om het kristallografische gezichtsprobleem experimenteel op te lossen en de identiteit en locatie van deze elementen te bepalen. Beamline I23 bij Diamond Light Source is een uniek synchrotroninstrument dat is geoptimaliseerd voor experimenten op lange golflengten tot vijf angstrom.Het biedt toegang tot de absorptieranden van elementen met een hoge biologische relevantie, zoals calcium, kalium, chloor, zwavel en fosfor. Vanwege de aanzienlijke absorptie van röntgenstralen door lucht in het langegolfregime, worden deze experimenten uitgevoerd in een vacuümomgeving. Om monsters bij cryogene temperaturen in de vacuümomgeving te houden, worden de kristallen gemonteerd op speciale, thermisch geleidende monsterhouders.De cryogene monsteroverdracht van vloeibare stikstof naar het vacuümeindstation lijkt sterk op de technieken die worden gebruikt in cryo-elektronenmicroscopie. Dit protocol presenteert de procedure voor het overbrengen van kristallen in de vacuümomgeving met behulp van de gereedschappen en apparatuur die zijn ontwikkeld bij Diamond Light Source. Begin met het scheiden van het deksel van de basis van de CombiPuck, zodat de monsterhouders aan de basis blijven vastzitten en de injectieflacons in het deksel worden vastgehouden.Dompel het deksel onder met injectieflacons in vloeibare stikstof, bevestig vervolgens een monsterhouder en adapter aan een magnetische staaf en oogst de kristallen. Spoel elk monster rechtstreeks in de CombiPuck en noteer de monsterpositie. Om de puck te sluiten, gebruik je een puck-toverstaf om de basis aan het deksel te bevestigen.Breng de CombiPuck over van vloeibare stikstof naar de droge verzender of opslag. Plaats de basis van de blokpuck die al gevuld is met lege transferblokken op de steunbasis in een schuimcontainer en vul vervolgens met vloeibare stikstof. Plaats vervolgens de CombiPuck in de schuimcontainer gevuld met vloeibare stikstof en zorg ervoor dat de basis van de puck is bevestigd aan de magnetische houder in de schuimcontainer.Koel alle benodigde gereedschappen voor in vloeibare stikstof. Scheid vervolgens het deksel van de basis met behulp van het puckscheidergereedschap op de hoge stand, zodat de basis aan de magnetische houder blijft bevestigd, waardoor de monsterhouders in vloeibare stikstof worden blootgesteld. Plaats de scheidingsstaaf over de monsterhouder en adapter zo ver mogelijk naar beneden en zorg ervoor dat de toverstaf verticaal is.Beweeg de kleine hendel op de scheidingsstang naar beneden met uw duim totdat deze klikt om de monsterhouder binnenin vast te zetten en trek de monsterhouder uit de adapter. Laat de separator over de gewenste positie van het overdrachtsblok zakken en zorg ervoor dat een van de drie tanden in het centrale gat van het overdrachtsblok past. Laat de monsterhouder los door de hendel weer omhoog te bewegen.Als u monsters in het volgende overdrachtsblok wilt laden, gebruikt u het gereedschap carrouselsleutel om een leeg overdrachtsblok in de horizontale positie te draaien. Zodra alle monsterhouders zijn overgebracht, sluit u de blokpuck door het deksel in vloeibare stikstof te plaatsen. Wacht tot de temperatuur in evenwicht is en plaats vervolgens het deksel over de basis en til voorzichtig op om uit de carrousel te komen.Bevestig de shuttle aan het station. Open de stikstofgas- en luchtkleppen en zorg ervoor dat er gassen stromen. Schakel vervolgens de CTS in.Koel zowel het bad als de shuttle met vloeibare stikstof. Plaats de meegeleverde trechter in de vulpoort op de shuttle en giet langzaam vloeibare stikstof in de trechter terwijl u het niveau op het scherm bewaakt. Stop wanneer de indicator van rood naar blauw verandert.Vul het bad met vloeibare stikstof met behulp van de trechter. Breng een blokpuck van vloeibare stikstof over naar het CTS-bad met behulp van het bijgevoegde puckscheidergereedschap. Verwijder het deksel van de blokpuck en sluit het deksel van het CTS-bad.Om een transferblok in de shuttle te introduceren, ontgrendelt u de shuttle-handgreep door 90 graden met de klok mee te draaien en deze naar het bad te verplaatsen, zodat de geleide baan op de hendel het juiste reispad afdwingt. Zodra de blokafdekking is afgekoeld, plaatst u de hendel om het blok in de shuttle te brengen. Om het transferblok op de shuttle te vergrendelen, draait u de hendel 180 graden met de klok mee.Trek de hendel terug naar de oorspronkelijke rugpositie en vergrendel deze op zijn plaats door 90 graden tegen de klok in te draaien. Druk op Close Shuttle Valve Pump op het display om de evacuatie van de shuttle te starten. Zodra de berichten Shuttle klaar om te bewegen en Niet bewegen staaf, klep gesloten worden weergegeven op het aanraakscherm, druk op de hendel onder de shuttle en til deze voorzichtig op met behulp van het handvat aan de bovenkant.Draag de shuttle rechtop naar de luchtsluis op het vacuümeindstation en bevestig deze. Selecteer een lege blokpositie in het vat door op de overeenkomstige knop op het aanraakscherm te drukken en het voorbeeldhotel naar de juiste laadpositie te verplaatsen. Zodra een voorbeeldhotel op zijn plaats is, drukt u op de knop Openen om de vacuümvergrendelingsvolgorde te starten.Nadat de reeks is voltooid en de status verandert in Airlock open, blok in shuttle, draai de hendel 90 graden met de klok mee om de stang te ontgrendelen. Duw de hengel voorzichtig in het schip, zodat de geleide baan het juiste pad naar het monsterhotel afdwingt. Plaats het transferblok langzaam in het hotel met behulp van de videofeed die op het scherm wordt weergegeven voor begeleiding, zodat het blokpositiepictogram op het aanraakscherm is geactiveerd.Eenmaal geactiveerd, draait u de hendel 180 graden tegen de klok in om het overdrachtsblok los te laten en de staaf uit het vat te trekken. Eenmaal volledig ingetrokken, draai je de hendel 90 graden tegen de klok in om de stang te vergrendelen. Druk op de knop Sluiten om de vacuümklep van het eindstation te sluiten en de ruimte tussen de shuttle en het vat te ontluchten tot atmosferische druk.Verwijder de shuttle wanneer het luchtsluisdisplay de status OK weergeeft om los te maken. Breng de shuttle terug naar het CTS-bad en druk op Open Shuttle Valve om de shuttle te evacueren voordat het volgende monsterblok wordt geladen. Zodra het stoplicht groen is en het bericht OK to move rod verschijnt, kan het volgende transferblok aan de shuttle worden geïntroduceerd.Om het volgende overdrachtsblok voor te bereiden, draait u de blokpuck in het bad. Duw de ingebouwde rotatiesleutel aan de bovenkant van het acryldeksel naar beneden in het slot in het midden van de blokpuck. Terwijl u het ingedrukt houdt, draait u de sleutel om het gewenste overdrachtsblok in de ophaalpositie te plaatsen.Zodra alle blokken zijn overgedragen, controleert u of de shuttleklep open is, drukt u op de Bake-knop op het aanraakscherm, selecteert u zowel Bath als Shuttle en drukt u vervolgens op Start Bake. De lange golflengte macromoleculaire kristallografiebundellijn I23 bij Diamond Light Source heeft toegang tot de absorptieranden van elementen van hoog biologisch belang, zoals calcium, kalium, chloor, zwavel en fosfor, waardoor een verbeterd afwijkend signaal ontstaat dat kan worden gebruikt voor het faseren of lokaliseren van deze elementen in macromoleculen. Diffractiegegevens werden verzameld van een enkel thaumatinekristal met golflengte 2,75 angstrom, gekozen als een compromis tussen verhoogde abnormale signaal- en monsterabsorptie-effecten op langere golflengten.De vacuümopstelling zorgt ervoor dat alleen röntgenstralen die door het monster worden verstrooid de detector bereiken, waardoor een lage achtergrond rond de Bragg-reflecties wordt geboden. De dataset leverde een zeer sterk afwijkend signaal op, waardoor de structuuroplossing door de automatische faseringspijplijn CRANK2 werd vergemakkelijkt. De hoge kwaliteit van de resulterende elektronendichtheidskaart maakte succesvolle automatische modelbouw mogelijk, met de juiste plaatsing voor 100% van de aminozuursequentie van thaumatine.De 16 cysteïneresiduen in thaumatine vormen acht disulfidebruggen, die allemaal duidelijk zichtbaar zijn in de elektronendichtheidskaart. Omdat in-vacuüm lange golflengte eiwitkristallografie een nieuw veld is, hebben we nieuwe hulpmiddelen en apparatuur voor monsterbehandeling ontwikkeld. Dit protocol begeleidt gebruikers bij het veilig overbrengen van monsters naar het vacuümeindstation op beamline I23 bij Diamond Light Source.De vacuümomgeving biedt unieke mogelijkheden om diffractie-experimenten uit te voeren in een golflengtebereik dat niet toegankelijk is bij andere bundellijnen. Röntgenkristallografie met lange golflengte maakt experimentele fasering van macromoleculen rechtstreeks uit inheemse kristallen mogelijk. Het maakt ook een ondubbelzinnige identificatie mogelijk van ionen die aan de moleculen zijn gebonden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische en structurele karakterisatie van de koolhydraten vervoer substraat-bindend-proteïne SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Een alles-in-een monsterhouder voor macromoleculaire X-Ray kristallografie met minimale achtergrond verstrooiing

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analyse van SEC-SAXS-gegevens via EFA-deconvolution en Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Lamellen bereiden van glasvochtbiologische monsters met behulp van een dual-beam scanning elektronenmicroscoop voor cryo-elektronentomografie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...