Name: sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

우리는 극저온 샘플 전송 시스템 (CTS)의 개발에 대한 지원을 아담 테일러, 아담 프레스콧, 켄 존스, 아빈더 팔라하, 케빈 윌킨슨에게 감사드립니다. 이 작품은 iNEXT-Discovery (그랜트 871037)가 유럽 위원회의 Horizon 2020 프로그램에 의해 지원되었습니다.

1. 크리스탈 수확
참고: 적절한 개인 보호 장비사용: 가능한 경우 고글과 장갑.
<ol><li>SHs가 콤비퍽(그림 3C)으로 사용자 실험실에 도착한 후, 덮개를 빗비퍽의 베이스로부터 분리하여 SHs가 베이스에 부착된 상태로 유지되고 유리병은 뚜껑에 유지된다.</li>
	<li>액체 질소에 바이알로 뚜껑을 담그. SH + 어댑터(그림 3B, 오른쪽)를 자기 지팡이에 부착하고 평소와 같이 크리스탈을 수확합니다.</li>
	<li>각 샘플을 빗비퍽에 직접 플래시 냉각하여 샘플 위치를 기록합니다. 퍽을 닫기 위해 퍽 지팡이를 사용하여 베이스를 뚜껑에 부착합니다.</li>
	<li>빗찌푸를 액체 질소에서 건조 발송인 또는 액체 질소 저장 데워로 옮기. 마른 화선을 다이아몬드(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html)로 발송합니다.</li>
</ol>2. 진공으로의 샘플 전송
<ol><li>콤비퍽에서 전송 블록으로 SH로드<ol>
<li>블록 퍽의 베이스(도 3H)를 이미 빈 이송 블록(도 3D)으로 채워진 폼 용기에 액체 질소 내부의 지지 베이스에 놓습니다(그림 3J-b). 참고: 진공 용기 내부의 시료 전달의 정확성에 대해 이송 블록의 방향이 중요합니다. 따라서 블록은 블록 퍽 베이스에 배치하여 도 3D 에 화살표로 표시된 핀이 블록의 왼쪽에 있는지 확인해야 합니다.</li>
		<li>유리알 퍽을 액체 질소로 채워진 거품 용기에 놓고 퍽의 베이스가 거품 용기 내부의 자기 홀더에 고정되어 있는지 확인합니다(그림 3J-a).</li>
		<li>액체 질소에 필요한 모든 도구를 미리 냉각. 높은 설정 H에 도 3G에 표시된 퍽 분리기 도구를 사용하여 뚜껑을 베이스로부터 분리하여 베이스가 마그네틱 홀더에 부착된 상태로 유지되고 SHs가 액체 질소 내부에 노출된다.</li>
		<li>각 SH를 어댑터에서 제거하려면 분리기 지팡이(도 3F)를 사용하여 콤비퍽 베이스에서 SH를 선택하고 도 3J-b의 회전 목마의 수평 위치에 있는 이송 블록의 적절한 위치에 배치한다.<ol>
<li>견본을 만지지 않기 위하여, 지팡이가 수직인지 확인하기 위하여, SH + 어댑터 위에 분리기 지팡이를 아래로 놓습니다.</li>
			<li>분리기 지팡이의 작은 레버를 엄지손가락으로 아래로 이동하여 클릭할 때까지 SH를 내부로 고정하고 어댑터에서 SH를 가져옵니다.</li>
			<li>원하는 블록 위치에 분리제를 낮추어 세 갈구 중 하나가 블록의 중앙 구멍 내부에 맞는지 확인합니다.</li>
			<li>레버를 다시 위로 이동하여 SH를 해제합니다. 각 SH에 대해 다음 단계를 반복합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>샘플을 다음 샘플 블록에 로드하려면 회전 목마 키 도구(그림 3E)를 사용하여 빈 블록을 수평 위치로 회전시합니다.</li>
		<li>시계 방향으로 나사로 블록 퍽의 뚜껑에 낮은 설정 L을 사용하여 도 3G에 표시된 퍽 분리기 도구를 부착합니다.</li>
		<li>모든 SHs가 전송되면 블록 퍽을 닫고 뚜껑을 액체 질소에 넣고 온도가 평형될 때까지 기다린 다음 그림 3I와 같이 뚜껑을 베이스 위에 맞춥시게 합니다. 분리기 도구가 부착되어 회전 목마에서 부드럽게 들어 올립니다.</li>
		<li>이 단계에서 블록 퍽은 CTS(도 4B) 또는 액체 질소 저장 분해로 전송될 수 있다.</li>
	</ol></li>
	<li>진공 용기에 이송 블록의 하중<ol><li>셔틀이 역에 안전하게 부착되어 있는지 확인하십시오. 질소 가스 및 공기 밸브를 열고 가스가 흐르는지 확인합니다. CTS를 켭다.</li>
		<li>디스플레이에 경고 메시지가 표시되지 않으면 욕조와 셔틀을 액체 질소로 모두 냉각시하십시오. 제공된 깔때기를 셔틀의 충전 포트에 놓고 화면의 수준을 모니터링하는 동안 액체 질소를 깔때기에 천천히 붓습니다. 표시등이 빨간색에서 파란색으로 바뀌면 중지합니다. 참고: 터치스크린에 표시된 차가운 좌석의 온도가 100K 미만일 때 셔틀을 사용할 수 있습니다. 샘플 스테이션 목욕은 목욕의 벽에 표시된 수준또는 액체 질소 수준 디스플레이에 100 % 표시된 수준으로 올바른 깔때기를 사용하여 동시에 채울 수 있습니다. 액체 질소 수준 및 온도 센서는 작동 내내 지속적으로 모니터링되어야 합니다. 몇 가지 탑업이 필요합니다.</li>
		<li>셔틀 콜드 시트 온도가 100 K 이하이고 셔틀 및 목욕의 액체 질소 수준이 안정화되면 부착 된 퍽 분리기 도구를 사용하여 액체 질소에서 CTS 욕조로 블록 퍽을 전송하십시오. 블록 퍽의 뚜껑을 제거하고 CTS 욕조의 뚜껑을 닫습니다.</li>
		<li>셔틀에 블록을 도입하려면 디스플레이의 열린 셔틀 밸브 버튼을 눌러 CTS 밸브를 엽니다. 셔틀 핸들을 시계 방향으로 회전하여 잠금 해제하고 욕조쪽으로 진행하여 핸들의 가이드 트랙이 목욕을 향한 올바른 이동 경로를 적용합니다. 욕조 내부에 블록 커버가 보이면 덮개가 식힙니다. 커버 주위의 액체 질소의 거품이 멈춘 후, 이송 블록으로 전진한다.</li>
		<li>전송 블록을 셔틀에 고정하려면 핸들 180° 시계를 시계 방향으로 회전합니다.</li>
		<li>핸들을 원래 백 위치로 다시 한 다음 시계 반대 방향으로 90° 회전하여 '잠그기'합니다.</li>
		<li>디스플레이 화면에서 셔틀 밸브 닫기 및 펌프 를 눌러 셔틀 대피를 시작합니다.</li>
		<li>터치스크린에 분리할 준비가 된 메시지 셔틀 이 표시되면 셔틀 아래 레버를 누르고 상단의 핸들을 사용하여 조심스럽게 들어 올립니다.</li>
		<li>수직 위치에 진공 엔드 스테이션에 에어 록에 셔틀을 수행.</li>
		<li>진공 엔드스테이션의 에어록에 셔틀을 부착합니다. 참고: 단단히 부착되면 엔드스테이션의 터치스크린이 셔틀 및 인터록상태를 확인합니다.</li>
		<li>터치스크린의 해당 버튼을 누르고 샘플 호텔을 올바른 로딩 위치로 이동하여 선박 내의 빈 블록 위치를 선택합니다.</li>
		<li>샘플 호텔이 자리를 비워지면 오픈 버튼이 활성화됩니다. 이 버튼을 눌러 진공 연동 시퀀스를 시작합니다. 참고: 펌프가 시작되고 진행 률이 모니터에 표시됩니다. 완료하는 데 최대 2분이 걸릴 수 있습니다.</li>
		<li>시퀀스가 완료되면 상태가 Airlock 열기로 변경되어 전송이 진행됩니다. 핸들을 시계 방향으로 90° 비틀어 막대의 잠금을 해제하고 로드를 용기에 부드럽게 밀어 넣어 가이드 트랙이 다시 샘플 호텔 위치를 향한 올바른 이동 경로를 적용합니다. 화면에 표시된 비디오 피드를 사용하여 지침을 위해 천천히 블록을 호텔에 삽입하여 터치 디스플레이의 블록 위치 표시 등이 활성화되도록 합니다. 일단 활성화되면, 핸들을 180° 반 시계 방향으로 회전하여 블록을 해제하고 용기에서 막대를 당깁니다. 완전히 철회되면 핸들을 시계 반대 방향으로 회전하여 막대를 잠급니다.</li>
		<li>막대가 잠기면 닫 기 버튼이 활성화됩니다. 이를 눌러 최종 스테이션 진공 밸브를 닫고 셔틀과 선박 사이의 공간을 대기압으로 배출하여 최대 20초까지 완료할 때까지 대기압으로 배출합니다.</li>
		<li>시퀀스가 완료되면 디스플레이가 셔틀을 제거해도 괜찮은 상태를 표시할 때까지 기다립니다. 이 시점에서 셔틀을 제거하고 CTS로 돌아가 다음 블록에 대한 프로세스를 반복합니다.</li>
		<li>다음 블록을 준비하여 이송을 위해 욕조 내부의 블록 퍽을 회전시하십시오. 아크릴 뚜껑 상단의 기본 제공 회전 키 를 블록 퍽의 중앙에 있는 잠금 장치로 밀어 넣습니다. 그것을 누르는 동안, 픽업 위치에 원하는 블록을 배치키를 켭니다.</li>
		<li>모든 블록이 전송되면 CTS에 장착된 동안 셔틀 밸브가 열려 있는지 확인합니다. 참고: 셔틀과 목욕을 모두 따뜻하게 하여 액체 질소를 끓이고 다음 사용 전에 축적된 얼음/응축을 증발시합니다. 베이크가 시작되면 가스와 공기를 끌 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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현재 프로토콜은 빔라인 I23에 대한 진공 장기 파장 MX 실험에 대한 샘플 준비 요구 사항을 준수하기 위해 개발되었습니다. 지난 한 해 동안 빔라인에서 사용되어 왔으며 여러 프로젝트를 성공적으로 완료하는 데 기여했습니다. 여기에 제시된 결과에 의해 표시된 바와 같이, 프로토콜은 회절 품질을 유지하면서 진공 엔드 스테이션에 시료를 안전하고 신뢰할 수 있게 전달할 수 있게 합니다. 빔라인 작동에 중요한 측면이며 빔라인 직원의 대면 사용자 교육을 동반합니다. 일부 단계는 절차의 성공적이고 안전한 완료에 중요한 것으로 강조 될 가치가있다 : 샘플 블록을 샘플 블록에 combipuck 기지에서 샘플의 전송은 정확성과 주의를 필요로 (단계 2.1.4 참조); 모든 단계에서 액체 질소 수준을 모니터링하는 것은 시료가 공기에 노출되거나 제대로 냉각되지 않은 부품에 근접접촉하는 것을 방지하는 것이 중요합니다(2.1.3 및 2.2.2); 종전소 진공의 저하를 방지하기 위해 종전소(2.2.15)에서 셔틀을 제거하기 전에 닫기 시퀀스(2.2.14)가 완전히 완료될 때까지 기다린다.
프로토콜의 개념은 진공 환경에 단백질 결정의 전송을 위한 특수 제작 장비를 개발하기 위한 엔지니어링 노력과 함께 시작되었습니다. 이 프로젝트의 최종 제품은 CTS와 위에서 설명한 관련 샘플 처리 도구였습니다. CTS는 이전 모델인 라이카 EM VCT10014에 상당한 개선을 이루며, 전송 중 시료 차폐 및 진공 환경 의 부족, 액체 질소 욕조 내부의 얼음 축적, 직관적인 사용자 인터페이스 및 안전 기능 의 부재 와 같은 여러 가지 제한을 제거합니다. 사용자 경험을 향상시키는 CTS의 추가 기능은 셔틀 및 샘플 스테이션 내부의 온도 및 액체 질소 수준 모니터링, 1개가 아닌 4개의 블록을 동시에 수용하는 더 큰 용량 의 목욕, 셔틀 작동을 위한 자체 가이드 메커니즘입니다. CTS는 사용자 친화적인 터치스크린 인터페이스와 엔드스테이션과의 인터페이싱 시 향상된 진공 및 기계적 안전으로 빔라인 제어 시스템에 완벽하게 통합되어 있습니다.
Beamline I23은 동종 최초의 장거리 MX 싱크로트론 기기로, 고진공 환경에 단백질 결정을 도입하고 극저온 온도에서 저장하는 등 상당한 노력이 필요했습니다. 샘플 준비 도구 및 프로토콜의 개선과 프로세스 간소화를 위한 노력이 진행 중입니다. 사용자 지원의 일환으로 빔라인 직원은 항상 문제 해결을 지원할 수 있습니다. 이러한 시나리오 중 하나의 예로는 진공 시스템의 무결성을 손상시키는 문제가 되어 CTS 또는 엔드스테이션 에어록에서 셔틀을 연결하거나 제거하는 데 어려움이 있습니다. 테스트의 다른 수준은 매주 매일 수행되며, 사용자 교육은 셔틀이 부착하는 인터페이스의 O 링의 육안 검사와 같은 잠재적인 오류를 방지하기 위해 추가 검사를 포함합니다. 진공 환경은 다른 빔라인에서 접근할 수 없는 파장 범위에서 회절 실험을 수행할 수 있는 기회를 열어주지만, 추가 이송 단계는 전체 샘플 처리량을 감소시킵니다.
이송 블록당 4개의 샘플과 진공 용기 내부의 최대 5블록의 수동 이송은 총 용량을 20개의 샘플로 제한합니다. 따라서 가변성을 샘플링하는 큰 샘플을 가진 프로젝트의 경우 다이아몬드 고처리량 빔라인에서 샘플을 사전 검사해야 하며, 후속 최적화된 긴 파장 실험을 위해 가장 유망한 샘플만 이송해야 합니다. 샘플 홀더와 전송 블록은 몇 년 전 초기 도입과 는 달라지지 않지만 여기에 제시된 처리 도구는 모두 새로운 개발입니다. I23 전용 샘플 홀더는 빔라인의 냉각 개념에서의 역할 때문에 변경할 수 없습니다. 따라서, 샘플 처리 도구의 디자인은 MX 사용자 커뮤니티가 오랫동안 채택한 새로운 유형의 홀더와 빗비퍽, 크리스탈 수확 지팡이 및 건식 발송물 운송 시스템과 같은 표준 상용 도구 사이의 링크를 만드는 것을 목표로했습니다. 그들의 디자인은 사용자 커뮤니티와 상당한 협의를 포함하고 완료하기 위해 몇 가지 반복이 필요했습니다. 여기에 제시된 장비, 도구 및 프로토콜은 다이아몬드 광원에서 빔라인 I23에서 실험을 위한 사용자 샘플을 전송하기 위한 간단하고 견고한 시스템을 나타냅니다. 진공 장기 파장 대식세포 학적 결정예 촬영을위한이 악기는 구조 생물학을위한 새로운 기회를 엽니 다.

긴 파장 X 선 회절은 거시 분자에 기본적으로 존재하는 특정 광 원자의 비정상적인 산란 특성을 활용하는 데 사용됩니다. 이것은 결정적 위상 문제를 해결하고 거대 분자 내의 이러한 요소의 정체성과 위치를 명확하게 확인하는 데 도움이됩니다. 거시분자 결정학 초기에 , 드 노보 구조는 여러 개의 동종 대체에 의해 해결되었지만, 싱크로트론에서 튜탈 가능한 X선 빔라인의 출현과 함께 다파장 및 단일 파장(SAD)을 기반으로 한 실험적 단계적 편곡 기술이 지배적인 방법이 되었습니다2 . 두 방법 모두 역사적으로 중금속의 동종 또는 비정상적인 신호에 의존해 왔으며, 이는 조정 또는 결정적 흡수에 의해 인위적으로 결정에 도입되어야 합니다3. 시행 착오 방식과 예측할 수 없는 결과로 이러한 실험은 실망스럽게 도포할 수 있습니다. 단백질 발현 동안 셀레노 메티오닌의 통합4 는 진핵 단백질 발현 시스템에서 매우 어려울 수 있지만 이러한 한계를 극복하고 짧은 파장에서 비정상적인 회절을 악용하는 매우 우아한 방법입니다.
장거리 MX는 추가 치료 없이 성공적인 결정화 시험에서 직접 결정을 사용하는 편리성 때문에 네이티브 SAD 실험에 의한 구조 결정에 매우 매력적이다5,6. 또한 칼슘, 칼륨, 염소, 황 및 인과 같은 생물학적 중요성이 높은 요소의 흡수 가장자리에 대한 접근은 거대 분자7,8,9,10에서 이러한 원소의 위치를 직접 식별 할 수있는 기회를 열어줍니다. 중간 및 저해상도에서, 2Fo-Fc 전자 밀도 및 화학 환경에 기초한 원소 할당은 특히 비슷한 수의 전자 또는 부분 점유율을 가진 약한 바운드 이온을 가진 원소에 대해 어려울 수 있습니다. 이러한 모호성은 결과 모델 단계적 차이 Fourier maps11,12의 관심 요소및 해석 요소의 흡수 가장자리 아래 및 위의 데이터를 수집하여 해결할 수 있습니다. 이 지도에서 유황 원자 위치를 찾는 것은 또한 저해상도 전자 밀도지도에 모델 구축을 도움이 될 수 있습니다13. 이러한 광 원소의 흡수 가장자리는 λ = 3 및 6 Å 사이의 파장에서 관찰됩니다(그림 1, 상단 참조). 이 파장 범위는 모든 싱크로트론 MX 빔라인의 기능을 훨씬 뛰어넘었으며, 이 범위의 효율적인 작동은 아래에 설명된 바와 같이 몇 가지 기술적 과제를 극복해야 합니다.
영국 다이아몬드 광원의 Beamline I23은 λ = 1.13 및 5.9 Å 사이의 파장 범위에서 조정 가능한 장거리 MX 실험을 용이하게 하기 위해 특별히 설계된 독특한 기기입니다(E = 2.1 및 11 keV 사이의 에너지 범위). 고진공 환경에서 작동함으로써 14, 공기 흡수 및 산란이 제거되어 회절 실험의 효율성과 신호 대 잡음 비율을 향상시킵니다. 대형 진공 축전소는 반원통형 필라투스 12M 검출기, 다축 고니오미터, 온라인 보기 및 콜리메이션 시스템, 시료 이송 및 저장을 위한 맞춤형 장비 등 시료 환경의 모든 구성 요소를 둘러싸고 있다(그림 2). 각 장비는 최상의 품질의 긴 파장 데이터를 수집할 수 있도록 최적화되었습니다. 곡선 필라투스 12M 검출기는 2θ = ±100°의 회절 각도로 수집할 수 있으며, 이로 인해 가장 긴 파장에서도 충분히 고해상도 회절 데이터가 생성됩니다(그림 1, 아래쪽). 120개의 검출기 모듈은 저에너지 호환성을 위해 특별히 선택되었으며, 추가적인 초고게인 모드에 대한 교정이 제공되었습니다.
가장 낮은 검출기 임계값은 1.8 keV이며, 3.6 keV보다 낮은 에너지에 대한 코너 및 에지 효과가 증가하고, 특히 낮은 모자이시티 결정의 경우 가장 긴 파장에서 데이터 품질이 손상되는 것을 관찰할 수 있다. 이러한 효과는 검출기 양자 효율의 감소와 함께 실험계획시 고려해야 한다. 다축 고니오미터를 사용하면 결정의 방향을 전환하여 비정상적인 신호의 품질과 강도를 극대화하는 데이터 수집 전략과 수집된 비정상적인 데이터의 완전성을 극대화할 수 있습니다. 시료 흡수는 특히 가장 긴 파장에서 실험을 제한하는 요소입니다. 흡수 보정은 일반적으로 사용되는 MX 처리 소프트웨어 패키지16,17에서 구현된 바와 같이, 약 3Å의 파장에 잘 작동하고 있다. 더 긴 파장은 지형 재구성에 기초한 분석 흡수 보정이 필요합니다18 또는 레이저 절제비비 비 확산 물질을 제거하고 잘 정의 된 모양으로 결정을 잘라19. 또한 더 긴 파장에서의 X선 회절 실험이 더 작은 결정14에 더 효율적이기 때문에 후자는 더 큰 결정의 크기를 줄이는 데 도움이 됩니다. 개방형 냉기 가스 스트림 장치를 사용하는 것은 진공 환경과 호환되지 않기 때문에 데이터 수집 중에 극저온 온도에서 샘플을 유지하는 과제는 전도성 냉각에 의해 해결됩니다. 따라서 구리와 같은 열 전도성 물질은 샘플을 펄스 튜브 저온쿨러에 연결하기 위해 필요합니다. MX 전반에 걸쳐 사용되는 스테인리스 스틸 SPINE 표준 핀과 상업적으로 이용 가능한 기타 시료 마운트는 열 전도도가 좋지 않아 진공 내 장파장 MX에 적합하지 않습니다.
진공 MX용 샘플 홀더(SHs)는 열 제거 열 경로의 필수적인 부분이어야 합니다(그림 3A). 따라서 열전도성 구리 본체와 핀으로 구성되며, 차가운 고니오미터 헤드에 대한 적절한 열 링크를 보장하기 위한 강력한 자석 베이스와 폴리이미드로 만든 샘플 마운트의 두 가지 중요한 특징을 포함시켜 X선 흡수 및 산란20을 최소화합니다. 수정 수확 및 플래시 냉각의 사용자 경험이 표준 MX 관행과 관련된 것과 거의 동일하도록 하기 위한 노력이 이루어졌습니다. 전용 I23 SHs는 다른 싱크로트론 빔라인과 직접 호환되지 않기 때문에 스테인리스 스틸 어댑터는 다른 MX 빔라인의 수정 수확 마그네틱 지팡이 및 기존 고니오미터 인터페이스와의 호환성을 위해 사용됩니다(그림 3B). 어댑터는 ALS 형 로봇 그리퍼 헤드21 및 unipuck 스타일의 기본 레이아웃222를 기반으로 하는 다른 다이아몬드 MX 빔라인의 자동화 시설을 사용하는 데에도 중요합니다. 샘플 준비 및 로딩 프로토콜은 다음 두 단계로 세분화할 수 있습니다.
1단계: 자신의 실험실에서 사용자가 수행한 크리스탈 수확 및 플래시 동결
I23 데이터 수집에 대한 프로젝트 적합성 평가에 따라 결정 크기와 일치하는 루프가 있는 샘플 홀더(어댑터로 미리 조립)가 수정 수확을 위해 사용자 실험실로 전송됩니다. 손상을 방지하기 위해 SHs와 어댑터는 분리되어서는 안되며 표준 크리스탈 수확 자기 지팡이를 사용하여 적절한 크기의 루프를 사용하여 낚시 크리스탈을 목적으로 한 단위로 사용되어야 합니다. MX에서 흔히 볼 수 있듯이, 이 작업은 현미경하에서 수동으로 수행되며, 결정은 액체 질소23을 가진 거품 분해에서 즉시 플래시 냉각된다. 자기력의 불일치로 인해 SHs는 현재 유니퍽과 호환되지 않습니다. 보관 및 배송은 요청 시 사용자가 사용할 수 있는 콤비퍽( 재료 표 참조)과 호환되는 건식 발송인 인서서츠(그림 3C)를 사용하여 실현됩니다. 이 퍽은 널리 사용되는 유니퍽과 동일한 베이스 플레이트를 공유하고 다른 다이아몬드 MX 빔라인에서 시료를 빠르게 사전 검사할 수 있습니다. 맞춤형 샘플 홀더가 시판될 때까지 사용자에게 이 장비를 대여하는 것이 현재 가장 적합합니다. 빔라인으로 운송하려면 MX 커뮤니티에 사용되는 표준 건식 발송인이 필요합니다.
2단계: 저온 냉각시 샘플을 진공 종전소로 옮기
샘플이 빔라인에 도착하면 진공 종전소로 옮길 준비가 됩니다. 이것은 콤비퍽에서 SHs를 제거하고 어댑터에서 분리하는 것을 포함합니다. 진공에 생물학적 샘플을 도입하는 것은 냉동 전자 현미경 검사장에서 일상적으로 수행됩니다. 잘 확립 된 개념 중 일부는 I23 샘플 전송에 맞게 조정되었습니다. 요컨대, SHs는 액체 질소로 이송되어 이송 블록으로 전달된다(도 3D). 이 블록은 우수한 열 전도도와 상당한 열 질량을 가지고 있으며, 진공 상태에서 결정이 유리 전이 온도에 도달하지 못하게합니다. 각각 4개의 시료의 용량을 가진 최대 4개의 블록은 액체 질소 아래에 블록 퍽(그림 3H)으로 적재되며, 이는 극저온 전달 시스템(CTS)으로 샘플을 전송하거나 실험 사이의 액체 질소 디워즈에 저장하는 데 사용됩니다.
다이아몬드 광원에서 개발된 극저온 전송 시스템은 두 개의 하위 어셈블리인 샘플 스테이션과 셔틀(그림 4A)으로 구성됩니다. 샘플 스테이션은 단백질 결정의 임시 저장을 위한 액체 질소 목욕으로 구성되어 있으며 안전을 보장하고 사용자 친화적 인 경험을 할 수있는 특정 기능을 갖추고 있습니다 (그림 5). CTS는 사용자 친화적인 터치스크린 인터페이스를 통해 프로그래밍 가능한 논리 컨트롤러에 의해 제어됩니다. 샘플 스테이션에는 더 나은 시각화를 위해 내장된 발광 다이오드와 샘플이 전송된 후 액체 질소 목욕의 건조를 자동화하기 위해 근접 루프로 제어되는 히터 세트가 내장되어 있습니다. 또한 시스템의 안전과 효율적인 기능을 보장하기 위해 다양한 센서를 보유하고 있습니다. 샘플 스테이션은 시료 전송을 위해 거친 진공으로 펌핑하는 것과 같이 작업을 위해 셔틀과 상호 작용할 수있는 신뢰할 수있는 전기 인터페이스를 제공하고 액체 질소 수준 및 셔틀 내부 온도를 모니터링할 수있는 맞춤형 하드웨어를 갖추고 있습니다.
셔틀(그림 6)은 샘플 스테이션 액체 질소 욕조에서 이송 블록을 픽업하고 극저온 및 진공 환경 내부로 엔드스테이션으로 전송하는 데 사용되는 휴대용 장치입니다. 전송 중에 시료를 차갑게 유지하는 액체 질소 제war, 분해 내의 액체 수준 모니터링, 작동 및 사용자 안전을 위한 다양한 센서가 포함됩니다. 전송 팔에는 마그네틱 드라이브가 장착되어 있으며 사용자가 안전하게 하역 및 언로딩 전송 블록을 엔드스테이션으로 안내하는 가공 홈이 포함되어 있습니다. 셔틀에서 진공 용기로 의 전송은 에어록을 통해 수행됩니다. 에어록은 셔틀과 엔드스테이션 사이의 간 공간을 대피하는 데 사용되는 엔드스테이션의 셔틀 용 인터페이스로 셔틀및 엔드스테이션 진공 밸브를 엽니다. 펌핑 및 환기 시퀀스는 완전히 자동화되어 있으며 사용자 친화적인 인터페이스(그림 4C)가 있는 대형 터치스크린을 통해 작동할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 데이터 수집을 위해 타우마티드 결정을 진공 엔드스테이션으로 전송하는 데 사용됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12M detector</td>
			<td>Dectris, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>single-photon-counting X-ray detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CombiPuck</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-P1</td>
			<td>Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal-harvesting magnetic wand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td>Used for harvesting crystal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Shipper (CX100)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-21</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-PTC1</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton polyimide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sample mount made of Kapton polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perpsex lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>acrylic lid with built-in rotation key</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin powder</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source

긴 파장 대식체 분자 결정학 (MX)은 종종 대시분자에 기본적으로 존재하는 황, 인, 칼륨, 염소 또는 칼슘과 같은 원소의 비정상적인 산란 특성을 이용합니다. 이를 통해 추가 라벨링 없이 실험적 단계에서 단백질과 핵산의 직접적인 구조 용액을 가능하게 한다. 이 파장 정권에서 X선의 상당한 공기 흡수를 제거하기 위해 이러한 실험은 진공 환경에서 수행됩니다. 영국 다이아몬드 라이트 소스의 Beamline I23은 5Å를 향한 긴 파장 범위에서 MX 실험에 설계 및 최적화된 최초의 싱크로트론 계측기입니다. 
이를 가능하게 하기 위해 대형 진공 용기는 샘플 환경의 모든 엔드스테이션 구성 요소를 둘러싸습니다. 진공의 저장 및 데이터 수집 중에 극저온 온도에서 샘플을 유지해야 하므로 열전도성 샘플 홀더를 사용해야 합니다. 이를 통해 효율적인 열 제거를 통해 시료 냉각을 약 50K로 보장합니다. 현재 프로토콜은 샘플 준비 및 빔 라인 I23의 진공으로 샘플을 전송하는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 거대 분자 결정학 커뮤니티 내에 이미 확립된 관행과 방법의 균일성을 보장하고, 표준 MX 도구가 장착된 모든 실험실 환경에서 액체 질소 온도에 대한 샘플 냉각을 수행할 수 있습니다. 
극저온 저장 및 샘플 운송에는 표준 상용 장비만 필요합니다. 액체 질소에서 진공 종전소로 극저온 냉각 결정의 전송을 위해 특수 장비가 필요합니다. 맞춤형 샘플 처리 도구와 전용 극저온 전송 시스템(CTS)이 자체 개발되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 샘플에서 수집된 회절 데이터는 우수한 병합 통계를 보여 주며, 이는 시술 중에 샘플의 품질이 변경되지 않았다는 것을 나타냅니다. 이는 표준 싱크로트론 빔라인을 넘어 파장 범위에서 진공 내 MX에 대한 독특한 기회를 열어줍니다.

상기에 설명된 프로토콜을 사용하여 타우마티드 결정이 진공 종전소에 도입되었다. 회절 데이터는 2.7552 Å(E = 4500 eV)의 파장에서 수집되었으며, 3600개의 이미지로, 이미지당 0.1°및 0.1의 노출을 회전증가시켰다. 빔 크기는 150 μm x 150 μm로 조정되고 7.1 x 109 광자/s의 해당 플럭스 측정과 함께 10%로 변속기로 감소했습니다. λ = 2.7552 Å의 선택은 비정상적인 신호 및 샘플 흡수 효과의 증가와 더 긴 파장에 대한 해상도 의 감소 사이의 타협을 기반으로합니다. 유황(λ= 5.0095 Å)의 이론적 흡수 에지에 가깝지는 않지만, 이 파장에서, 유황 f의 산란계에 대한 가상기여도는 1.57 e- , 1.7과 2Å 사이의 파장에 비해 1.6-2.1배 더 크다. 그 결과 더 강력한 비정상적인 신호로 인해 더 어려운 프로젝트를 위한 성공적인 S-SAD 태싱이 허용됩니다.
이 파장에서 수집된 데이터와 함께 빔라인 I2324,25,26,27에서 이미 다양한 어려운 해싱 실험이 수행되었다. S-SAD에 의한 단계화는 훨씬 짧은 파장을 사용하여 가능하지만, 이것은 종종 10028 년 이상의 복합성 값에 도달하기 위해 많은 동종 결정에서 데이터를 병합하여 비정상적인 신호를 구축해야합니다. 더 긴 파장에서 향상된 비정상적인 신호로 인해 I23에서 해결된 대부분의 진행 프로젝트는 하나의 결정의 데이터만 필요했습니다. 대표적인 회절 이미지는 그림 7,왼쪽에 표시됩니다. Xia2-3dii29를 사용한 데이터 처리는 표 1에 설명된 바와 같이 우수한 병합 통계를 생성했습니다. 도 7, 오른쪽은 타우마티닌 데이터 세트에서 대표적인 회절 이미지의 일부를 나타내고 일반적으로 진공 설정에서 관찰되는 큰 I/σ(I) 값에 기여하는 브래그 반사를 둘러싼 낮은 배경을 보여 주므로 샘플에 흩어진 X선만 검출기에 도달할 수 있도록 합니다.
1.8 Å의 최대 달성 가능한 해상도는 검출기 형상 및 X선 방사선의 선택한 파장 때문입니다. 데이터 세트는 2.677의 비정상적인 정상 확률 매개 변수의 중간 경사에 반영된 매우 강력한 비정상적인 신호를 산출하여 자동 페이징 파이프라인 CRANK2에 의해 구조 솔루션을 용이하게 했습니다. 그 결과 전자 밀도 맵의 고품질은 CRANK231 내의 Buccaneer30 모듈에 의한 성공적인 자동 모델 건물을 가능하게 했으며, 타우마틴의 아미노산 서열의 100%를 올바르게 배치할 수 있었습니다. ANODE11로 계산된 단계별 비정상적인 차이 Fourier 맵은 Cys159의 16개의 매우 잘 정렬된 황 원자와 1개의 유황 원자를 두 가지 대체 순응으로 보여 주며, 표 2의 비정상적인 산란기 의 위치에서 18개의 중요한 봉우리높이에 의해 확인되었습니다. 타우마티안 내의 16개의 시스테인 잔류물은 모두 2Fo-Fc 맵(그림 8)에서 명확하게 볼 수 있는 8개의 이황화물 교량을 형성합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> 그림 1: 긴 파장 MX 실험에서 고해상도 회절 데이터. (A) 빔 라인 I23에서 액세스 할 수있는 광 원소의 흡수 가장자리를 나타내는 에너지에 대한 f"값의 플롯. (B) 에너지에 대한 P12M 검출기의 모서리에서 달성 가능한 최대 해상도. 약어: MX = 대식분자 결정학. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> 그림 2: 엔드스테이션의 모든 구성 요소를 갖춘 진공 용기를 통과하는 수평 단면입니다. 약어: OAV = 축 보기 시스템. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> 그림 3: 샘플 처리 도구. (A) I23 샘플 홀더. (B) 어댑터가 있는 I23 샘플 홀더 옆의 MX 척추 표준 핀(왼쪽). (C) I23 샘플 홀더(파란색)가 있는 콤비퍽 뚜껑 및 베이스. 두 개의 전송 블록 (금)으로 퍽 뚜껑과 베이스를 차단합니다. 빗비퍽과 블록 퍽과 호환되는 드라이 화주 지팡이가 뒷면에 보입니다. (D) 4개의 I23 샘플 홀더가 있는 전송 블록. (E) 블록 퍽 베이스의 회전에 사용되는 키 도구. (F) 분리기 지팡이. (G) 높이 및 낮은 설정을 보여주는 두 개의 화살표가있는 퍽 분리기 도구. (H) 네 개의 빈 Cu 블록블록으로 퍽 베이스를 차단합니다. (I) 블록 퍽뚜껑. (J) 콤비퍽 베이스에서 구리 블록으로 샘플 홀더를 전송하는 데 필요한 모든 도구가 있는 거품 용기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> 그림 4: 극저온 전송 시스템. (A) 셔틀이 부착된 CTS 샘플 스테이션과 충전에 사용되는 깔때기. (B) CTS . (C) CTS 제어 소프트웨어 터치스크린 내부에 두 개의 전송 블록이 있는 블록 퍽. 약어: CTS = 극저온 전송 시스템. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> 그림 5: 극저온 이송 시스템 샘플 스테이션. 약어: LED = 발광 다이오드; LN2 = 액체 질소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> 그림 6: 극저온 전송 시스템 셔틀. 약어: LED = 발광 다이오드; LN2 = 액체 질소. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> 그림 7: 회절 이미지입니다. 왼쪽, 타우마티인 결정상에 수집된 데이터 집합의 회절 이미지. 오른쪽, 낮은 수의 배경 픽셀로 둘러싸인 회절 지점입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> 그림 8: 자동 파이프라인 CRANK2(기본 설정, 후속 세련미 없음)를 가진 타우마티닌의 구조 솔루션입니다. (A) 1.6°C의 2Fo-Fc 맵을 가진 타우마티닌의 개요와 ANODE(녹색)에서 계산된 5μg에서 단계별 비정상적인 차이 Fourier 맵. (B) 5μkr에서 단계별 비정상적인 차이 푸리에 맵만 을 보여주는 타우마티닌의 개요. (C) 타우마틴에 존재하는 이황화물 교량의 클로즈업 뷰와 2Fo-Fc 맵 1.6μc(파란색) 및 5°C에서 푸리에 맵의 위상 차이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>이름</td>
			<td>타우마티닌</td>
		</tr>
<tr>
<td>데이터 수집 파장(Å) (에너지(eV)</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>이미지 수 x 웨지 크기(°)</td>
			<td>3600 x 0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>스페이스 그룹</td>
			<td>
P 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>단위 셀 상수</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>해상도 (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>완전성</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>이사 (주)</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>라스 (주)</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>다양성</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>중간 경사</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 1.755 Å 파장에서 Thaumatin에 대한 데이터 수집 및 처리 통계. 해상도, 완전성, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I), 및 복합성, 고해상도 쉘이 괄호안에 표시됩니다. 약어: DLS = 다이아몬드 광원.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>가장 가까운 원자</td>
			<td>피크 높이(시그마)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>MET112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: CRANK2에서 단계적 및 자동으로 빌드된 모델을 사용하여 ANODE에서 계산한 비정상적인 차이 Fourier 맵 피크 높이입니다.

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Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

여기서, 우리는 다이아몬드 광원에서 빔 라인 I23에 진공 엔드 스테이션으로 결정의 극저온 샘플 준비 및 전송을위한 프로토콜을 제시, 긴 파장 대식차 X 선 결정학 실험.

다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

긴 파장 대식체 결정예학은 단백질과 핵산에 기본적으로 존재하는 빛 원자로부터 비정상적인 신호를 이도합니다. 이 기술은 결정적 얼굴 문제를 실험적으로 해결하고 이러한 요소의 식별 및 위치를 결정하는 데 사용됩니다. 다이아몬드 라이트 소스의 Beamline I23은 최대 5개의 앙스트롬의 긴 파장에서 실험에 최적화된 독특한 싱크로트론 계측기입니다.칼슘, 칼륨, 염소, 유황 및 인과 같은 높은 생물학적 관련성의 요소의 흡수 가장자리에 접근할 수 있습니다. 긴 파장 정권에서 공기에 의해 X 선의 상당한 흡수로 인해 이러한 실험은 진공 환경에서 수행됩니다. 진공 환경 내부의 극저온 온도에서 샘플을 유지하기 위해 크리스탈은 전담 열 전도성 샘플 홀더에 장착됩니다.액체 질소에서 진공 말단으로의 극저온 시료 전달은 극저온 전자 현미경 검사법에 사용되는 기술과 매우 유사하다. 이 프로토콜은 다이아몬드 광원에서 개발 된 도구와 장비를 사용하여 진공 환경으로 결정을 전송하는 절차를 제공합니다. 먼저 뚜껑을 CombiPuck의 베이스에서 분리하여 샘플 홀더가 베이스에 부착된 상태로 유지되고 유리병이 뚜껑에 유지됩니다.액체 질소에 바이알로 뚜껑을 담그고 샘플 홀더와 어댑터를 자기 지팡이에 부착하고 결정을 수확합니다. 각 샘플을 CombiPuck으로 직접 식히고 샘플 위치를 지적합니다. 퍽을 닫기 위해 퍽 지팡이를 사용하여 베이스를 뚜껑에 부착합니다.빗비퍽을 액체 질소에서 건조 발송인 또는 저장으로 옮기십시오. 이미 빈 이송 블록으로 채워진 블록 퍽의 베이스를 폼 용기의 지지 기지에 놓고 액체 질소로 채웁니다. 그런 다음, CombiPuck을 액체 질소로 채워진 거품 용기에 배치하여 퍽의 베이스가 거품 용기 내부의 자기 홀더에 고정되어 있는지 확인합니다.액체 질소에 필요한 모든 도구를 미리 냉각. 이어서, 높은 설정에 퍽 분리기 도구를 사용하여 뚜껑을 베이스로부터 분리하여 베이스가 자기 홀더에 부착되어 액체 질소 내부의 샘플 홀더를 노출시합니다. 분리기 지팡이를 샘플 홀더 와 어댑터 위에 최대한 내려 놓고 지팡이가 수직인지 확인합니다.샘플 홀더를 내부의 고정하고 어댑터에서 샘플 홀더를 당길 때까지 엄지 손가락으로 분리기 지팡이의 작은 레버를 아래로 이동합니다. 원하는 전송 블록 위치에 분리제를 낮추어 세 갈래 중 하나가 전송 블록의 중앙 구멍 내부에 맞는지 확인합니다. 레버를 다시 위로 이동하여 샘플 홀더를 놓습니다.샘플을 다음 전송 블록에 로드하려면 회전 목마 키 도구를 사용하여 빈 이송 블록을 수평 위치로 회전합니다. 모든 샘플 홀더가 전송되면 뚜껑을 액체 질소에 배치하여 블록 퍽을 닫습니다. 온도가 평형될 때까지 기다린 다음 뚜껑을 베이스 위로 맞추고 부드럽게 들어 올려 회전 목마에서 방출합니다.역까지 셔틀을 연결합니다. 질소 가스 및 공기 밸브를 열고 가스가 흐르는지 확인합니다. 그런 다음 CTS를 켭타보시고 전환합니다.액체 질소로 목욕과 셔틀을 모두 식힙니다. 제공된 깔때기를 셔틀의 충전 포트에 놓고 화면의 레벨을 모니터링하는 동안 액체 질소를 깔때기에 천천히 붓습니다. 표시등이 빨간색에서 파란색으로 바뀌면 중지합니다.깔때기를 사용하여 액체 질소로 목욕을 채웁니다. 연결된 퍽 분리기 도구를 사용하여 액체 질소에서 CTS 욕조로 블록 퍽을 전송합니다. 블록 퍽의 뚜껑을 제거하고 CTS 욕조의 뚜껑을 닫습니다.셔틀로 전송 블록을 도입하려면 시계 방향으로 90도 회전하여 셔틀 핸들의 잠금을 해제하고 핸들의 가이드 트랙이 올바른 여행 경로를 적용하도록 목욕쪽으로 진행합니다. 블록 커버가 냉각되면 손잡이를 가서 블록을 셔틀로 소개합니다. 환승 블록을 셔틀에 고정하려면 핸들을 시계 방향으로 180도 회전합니다.핸들을 원래 백 위치로 되돌리고 시계 반대 방향으로 90도 회전하여 제자리에 고정합니다. 디스플레이 화면에서 가까운 셔틀 밸브 펌프를 눌러 셔틀 대피를 시작합니다. 메시지가 셔틀이 움직일 준비가 되어 있고 막대를 움직이지 않으면 밸브가 터치 스크린에 표시되고 셔틀 아래의 레버를 누르고 상단의 핸들을 사용하여 조심스럽게 들어 올립니다.셔틀을 진공 엔드 스테이션의 에어록까지 똑바로 세워 부착합니다. 터치 스크린의 해당 버튼을 누르고 샘플 호텔을 올바른 로딩 위치로 이동하여 선박 내의 빈 블록 위치를 선택합니다. 샘플 호텔이 위치에 있으면 열기 버튼을 눌러 진공 연동 시퀀스를 시작합니다.시퀀스가 완료되고 상태가 Airlock으로 변경되면 셔틀에서 블록을 열고 핸들을 시계 방향으로 비틀어 막대의 잠금을 해제합니다. 로드를 용기에 부드럽게 밀어 넣어 가이드 트랙이 샘플 호텔을 향한 올바른 이동 경로를 적용합니다. 화면에 표시된 비디오 피드를 사용하여 전송 블록을 천천히 호텔에 삽입하여 터치 디스플레이의 블록 위치 아이콘이 활성화되도록 합니다.일단 활성화되면 핸들을 시계 반대 방향으로 회전하여 이송 블록을 해제하고 용기에서 막대를 당깁니다. 완전히 철회되면 핸들을 시계 반대 방향으로 회전하여 막대를 잠급니다. 닫기 버튼을 눌러 엔드 스테이션 진공 밸브를 닫고 셔틀과 선박 사이의 공간을 대기압으로 배출합니다.에어록 디스플레이에 분리할 상태 확인이 표시되면 셔틀을 제거합니다. 셔틀을 CTS 욕조로 되돌리고 오픈 셔틀 밸브를 눌러 다음 샘플 블록을 적재하기 전에 셔틀을 대피시보도록 합니다. 신호등이 녹색이고 로드를 이동하도록 확인된 메시지가 나타나면 다음 전송 블록을 셔틀에 도입할 수 있습니다.다음 전송 블록을 준비하려면 욕조 내부의 블록 퍽을 회전시십시오. 아크릴 뚜껑 상단의 기본 제공 회전 키를 블록 퍽의 중앙에 있는 잠금 장치로 밀어 넣습니다. 그것을 누르는 동안, 픽업 위치에 원하는 전송 블록을 배치키를 켭니다.모든 블록이 전송되면 셔틀 밸브가 열려 있는지 확인하고 터치 스크린의 베이크 버튼을 누르고 배스와 셔틀을 모두 선택한 다음 시작 굽기를 누릅니다. 다이아몬드 광원의 긴 파장 대치 분자 결정 빔 I23은 칼슘, 칼륨, 염소, 황 및 인과 같은 생물학적 중요성이 높은 요소의 흡수 가장자리에 액세스 할 수 있으므로 거시 분자 내에서 이러한 요소를 페이징하거나 찾는 데 사용할 수있는 향상된 비정상적인 신호를 제공합니다. 회절 데이터는 파장 2.75 앙스트롬에서 단일 타우마티닌 결정으로부터 수집되었으며, 더 긴 파장에서 증가된 비정상적인 신호와 시료 흡수 효과 사이의 절충안으로 선택되었다.진공 설정은 샘플에 의해 산란된 엑스레이만 검출기에 도달할 수 있도록 하여 브래그 반사 주위의 낮은 배경을 제공합니다. 데이터 집합은 자동 페이징 파이프라인 CRANK2에 의해 구조 솔루션을 용이하게 하는 매우 강력한 비정상적인 신호를 산출했습니다. 결과 전자 밀도 맵의 높은 품질은 타우마티인의 아미노산 서열의 100%에 대한 올바른 배치와 함께 성공적인 자동 모델 구축을 가능하게 했습니다.타우마티안 내의 16개의 시스테인 잔류물은 모두 전자 밀도 맵에서 명확하게 볼 수 있는 8개의 이황화물 다리를 형성합니다. 진공 내 장파장 단백질 결정학은 새로운 분야이기 때문에 새로운 샘플 처리 도구와 장비를 개발했습니다. 이 프로토콜은 사용자가 다이아몬드 광원의 빔라인 I23의 진공 엔드 스테이션으로 샘플을 안전하게 전송할 수 있습니다.진공 환경은 다른 빔라인에서 접근할 수 없는 파장 범위에서 회절 실험을 수행할 수 있는 고유한 기회를 열어줍니다. 긴 파장 X 선 결정예학은 네이티브 결정에서 직접 거대 분자의 실험 적 태면화를 가능하게합니다. 또한 분자에 바인딩된 이온의 명확한 식별을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

준비 및 직렬 펨토초 결정학에 대한 지질 큐빅 단계에서 단백질 미세 배달

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

연구

생화학

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

최소한의 배경 산란을 갖춘 거대 분자 X선 결정학을 위한 올인원 샘플 홀더

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

EFA 감소 및 분산을 통한 SEC-SAXS 데이터 분석

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

연속 결정학 실험을 위한 Endothiapepsin 결정의 성장 최적화

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

다목적 미세 유체 칩의 직렬 결정학에 의한 효소의 결정화 및 구조적 결정: 기질 복합체

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...