Name: sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer a Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha e Kevin Wilkinson por seu apoio no desenvolvimento do Sistema de Transferência de Amostras Criogênicas (CTS). Este trabalho foi financiado pelo iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado pelo programa Horizon 2020 da Comissão Europeia.

1. Colheita de cristais
NOTA: Use equipamentos de proteção individual adequados: óculos e luvas, sempre que possível.
<ol><li>Depois que os SHs chegarem ao laboratório do usuário em combipucks (Figura 3C), separe a tampa da base do combipuck de tal forma que os SHs permaneçam anexados à base, e os frascos sejam mantidos na tampa.</li>
	<li>Mergulhe a tampa com frascos em nitrogênio líquido. Conecte um adaptador SH + (Figura 3B, à direita) a uma varinha magnética e colher cristais como de costume.</li>
	<li>Resfrie-se cada amostra diretamente no combipuck, anotando a posição da amostra. Para fechar o disco, use uma varinha de disco para prender a base à tampa.</li>
	<li>Transfira o combipuck de nitrogênio líquido para o navio seco ou de guerra de armazenamento de nitrogênio líquido. Envie o navio seco para Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>2. Transferência de amostra para vácuo
<ol><li>Carregamento de SH de combipuck para o bloco de transferência<ol>
<li>Coloque a base do disco de bloco (Figura 3H) já povoada com blocos de transferência vazios (Figura 3D) em sua base de suporte dentro do nitrogênio líquido em um recipiente de espuma (Figura 3J-b). NOTA: A orientação dos blocos de transferência é importante para a precisão da transferência de amostras dentro do vaso de vácuo. Como tal, os blocos devem ser colocados na base do disco de bloco, certificando-se de que o pino marcado com uma seta na Figura 3D esteja à esquerda do bloco.</li>
		<li>Coloque o disco de frasco no recipiente de espuma cheio de nitrogênio líquido, certificando-se de que a base do disco esteja presa ao suporte magnético dentro do recipiente de espuma (Figura 3J-a).</li>
		<li>Pré-esfrie todas as ferramentas necessárias em nitrogênio líquido. Use a ferramenta separadora do disco mostrada na Figura 3G na configuração alta H para separar a tampa da base, de tal forma que a base permaneça presa ao suporte magnético e os SHs sejam expostos dentro do nitrogênio líquido.</li>
		<li>Para remover cada SH de seu adaptador, use a varinha separadora (Figura 3F) para pegar o SH da base combipuck e coloque na posição apropriada do bloco de transferência na posição horizontal do carrossel na Figura 3J-b.<ol>
<li>Coloque a varinha do separador sobre o adaptador SH + o mais longe possível, certificando-se de que a varinha está vertical, para evitar tocar na amostra.</li>
			<li>Mova a pequena alavanca na varinha do separador para baixo com o polegar até que ele clique, para fixar o SH dentro e puxe o SH do adaptador.</li>
			<li>Abaixe o separador sobre a posição desejada do bloco, certificando-se de que uma das três pontas se encaixe dentro do orifício central do bloco.</li>
			<li>Solte o SH movendo a alavanca de volta para cima. Repita estes passos para cada SH.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para carregar amostras no próximo bloco de amostra, use a ferramenta chave do carrossel (Figura 3E) para girar um bloco vazio na posição horizontal.</li>
		<li>Conecte a ferramenta separadora do disco mostrada na Figura 3G usando a configuração baixa L à tampa do disco do bloco, parafusando no sentido horário.</li>
		<li>Uma vez que todos os SHs são transferidos, para fechar o disco do bloco, coloque a tampa em nitrogênio líquido e espere a temperatura se equilibrar, em seguida, encaixe a tampa sobre a base como na Figura 3I. Com a ferramenta separadora anexada, levante delicadamente para soltar do carrossel.</li>
		<li>Nesta fase, o disco de bloco pode ser transferido para o CTS (Figura 4B) ou para uma de guerra de armazenamento de nitrogênio líquido.</li>
	</ol></li>
	<li>Carregamento de blocos de transferência para o vaso de vácuo<ol><li>Certifique-se de que a nave está bem ligada à estação. Abra o gás nitrogênio e as válvulas de ar, e garanta que os gases estejam fluindo. Ligue o CTS.</li>
		<li>Se nenhuma mensagem de aviso for aparente no visor, proceda com o resfriamento tanto do banho quanto da nave auxiliar com nitrogênio líquido. Coloque o funil fornecido na porta de enchimento na nave auxiliar, e despeje lentamente nitrogênio líquido no funil enquanto monitora o nível na tela. Pare quando o indicador passar de vermelho para azul. NOTA: A nave está pronta para uso quando a temperatura do assento frio exibida na tela sensível ao toque estiver abaixo de 100 K. O banho da Estação amostral pode ser preenchido simultaneamente usando o funil correto para o nível marcado na parede do banho ou 100% no display do nível de nitrogênio líquido. Os níveis de nitrogênio líquido e os sensores de temperatura devem ser monitorados constantemente durante toda a operação; vários top-ups serão necessários.</li>
		<li>Uma vez que a temperatura do assento frio do transporte esteja abaixo de 100 K e os níveis de nitrogênio líquido na nave auxiliar e o banho estabilizarem, transfira um disco de bloco de nitrogênio líquido para o banho CTS usando a ferramenta separadora do disco anexado. Retire a tampa do disco do bloco e feche a tampa do banho cts.</li>
		<li>Para introduzir um bloco na nave auxiliar, abra a válvula CTS, se ainda não estiver aberta, pressionando o botão Open Shuttle Valve no visor. Desbloqueie a alça do transporte girando 90° no sentido horário, e avance-a em direção ao banho para que a faixa guiada na alça imponha o caminho correto da viagem em direção ao banho. Uma vez que a tampa do bloco esteja visível dentro do banho, deixe a tampa esfriar. Depois que o borbulhar de nitrogênio líquido ao redor da tampa parou, avance para o bloco de transferência.</li>
		<li>Para travar o bloco de transferência na nave auxiliar, gire a alça 180° no sentido horário.</li>
		<li>Retire a pega para a posição traseira original e, em seguida, 'Bloqueie' no lugar girando 90° no sentido anti-horário.</li>
		<li>Pressione a Válvula e a Bomba de Ônibus de perto na tela de exibição para iniciar a evacuação do transporte.</li>
		<li>Uma vez que a mensagem Shuttle pronta para desapegar é exibida na tela sensível ao toque, pressione a alavanca por baixo da nave auxiliar e levante-a cuidadosamente usando a alça na parte superior.</li>
		<li>Leve a nave auxiliar até a câmara de ar na estação de vácuo em posição vertical.</li>
		<li>Conecte a nave auxiliar à câmara de ar na estação de vácuo. NOTA: Uma vez conectado com segurança, a tela sensível ao toque na estação final confirmará o status da nave auxiliar e do bloqueio.</li>
		<li>Selecione uma posição de bloco vazia dentro da embarcação pressionando o botão correspondente na tela sensível ao toque e movendo o hotel de amostra para a posição de carregamento correta.</li>
		<li>Uma vez que o hotel de amostra esteja em posição, o botão Abrir ficará ativo. Pressione este botão para iniciar a sequência de bloqueio de vácuo. NOTA: A bomba será iniciada, e o progresso será exibido no monitor. Isso pode levar até dois minutos para ser concluído.</li>
		<li>Depois que a sequência estiver completa, o status mudará para Airlock aberto, transferência em andamento. Gire a pega 90° no sentido horário para desbloquear a haste e empurre suavemente a haste para dentro da embarcação para que a faixa guiada imponha novamente o caminho correto da viagem em direção à posição do hotel de amostra. Usando o feed de vídeo exibido na tela para orientação, insira lentamente o bloco no hotel, garantindo que a luz de posição do bloco no visor de toque seja ativada. Uma vez ativado, gire a alça 180° no sentido anti-horário para soltar o bloco e puxe a haste para fora do vaso. Uma vez totalmente retraído, gire a alça 90° no sentido anti-horário para travar a haste.</li>
		<li>Uma vez que a haste esteja bloqueada, o botão Fechar ficará ativo. Pressione isso para fechar a válvula de vácuo da estação final e ventilar o espaço entre o ônibus e a nave à pressão atmosférica, esperando até 20 s para conclusão.</li>
		<li>Aguarde que o display mostre o status certo para remover a nave auxiliar assim que a sequência estiver concluída. Neste ponto, remova a nave auxiliar e retorne ao CTS para repetir o processo para o próximo bloco.</li>
		<li>Para preparar o próximo bloco para transferência, gire o disco de bloco dentro do banho. Empurre a tecla de rotação incorporada na parte superior da tampa acrílica para baixo na trava no centro do disco de bloco. Enquanto segurá-lo para baixo, gire a tecla para posicionar o bloco desejado na posição de pick-up.</li>
		<li>Uma vez que todos os blocos tenham sido transferidos, certifique-se de que a válvula de transporte esteja aberta enquanto está montada no CTS. Pressione o botão de asse na tela sensível ao toque e selecione banho e transporte, em seguida, pressione assar. NOTA: Isso aquece tanto a nave auxiliar quanto o banho para ferver o nitrogênio líquido e, posteriormente, evaporar qualquer gelo/condensação acumulado antes do próximo uso. Uma vez que o cozimento tenha começado, o gás e o ar podem ser desligados.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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O protocolo atual foi desenvolvido para cumprir os requisitos de preparação da amostra para experimentos MX de comprimento de onda longa no vácuo na linha de feixe I23. Tem sido usado na linha de traves no último ano e contribuiu para a conclusão bem sucedida de vários projetos. Conforme indicado pelos resultados aqui apresentados, o protocolo permite uma transferência segura e confiável de amostras para a estação final de vácuo, preservando sua qualidade de difração. É um aspecto importante para a operação da linha de trave e será acompanhado por treinamento presencial do usuário pela equipe da linha de trave. Algumas das etapas merecem ser destacadas como críticas para a conclusão bem-sucedida e segura do procedimento: a transferência de amostras de bases combipuck para blocos amostrais requer precisão e atenção para evitar amostras prejudiciais (ver passo 2.1.4); o monitoramento do nível de nitrogênio líquido em todas as etapas é importante para evitar que as amostras sejam expostas ao ar ou estejam em contato próximo a peças que não estejam devidamente resfriadas (2.1.3 e 2.2.2); esperando até que a sequência close (2.2.14) esteja completamente concluída, antes de remover o transporte da estação final (2.2.15), para evitar a degradação do vácuo de estação final.
A concepção do protocolo foi iniciada em conjunto com um esforço de engenharia destinado ao desenvolvimento de equipamentos construídos para a transferência de cristais proteicos para o ambiente de vácuo. Os produtos finais deste projeto foram o CTS e as ferramentas associadas de manuseio de amostras descritas acima. O CTS é uma melhoria significativa em seu antecessor, o Leica EM VCT10014, e remove múltiplas limitações, como a falta de proteção de amostras e ambiente de vácuo durante a transferência, acúmulo de gelo dentro do banho de nitrogênio líquido e a ausência de uma interface de usuário intuitiva e recursos de segurança. Características adicionais do CTS que melhoram a experiência do usuário são o monitoramento do nível de temperatura e nitrogênio líquido dentro da estação de transporte e amostra, um banho de capacidade maior acomodando quatro blocos simultaneamente, em vez de um, e um mecanismo autoguiado para a operação do transporte. O CTS é totalmente integrado ao sistema de controle de linha de vigas com uma interface touchscreen fácil de usar e maior vácuo e segurança mecânica ao interagir com a estação final.
O Beamline I23 é o primeiro instrumento síncrotron MX de comprimento de onda longa do seu tipo e, como tal, introduzir cristais proteicos em um ambiente de alto vácuo e armazená-los a temperaturas criogênicas, tem exigido esforços consideráveis. Melhorias nas ferramentas e protocolos de preparação de amostras, bem como esforços para agilizar processos, estão em andamento. Como parte do suporte ao usuário, a equipe de linha de vigas está sempre disponível para ajudar na solução de problemas. Um exemplo de tal cenário seriam questões que comprometem a integridade do sistema de vácuo, levando a dificuldades em anexar ou remover a nave auxiliar de/para o CTS ou a câmara de ar de estação final. Diferentes níveis de testes são realizados semanalmente e diariamente, e o treinamento do usuário cobrirá verificações adicionais para evitar possíveis falhas, como a inspeção visual dos anéis O nas interfaces a que a nave auxiliar se conecta. Embora o ambiente de vácuo abra a oportunidade de realizar experimentos de difração em uma faixa de comprimento de onda não acessível em outras linhas de luz, a etapa de transferência adicional reduz o throughput geral da amostra.
A transferência manual com apenas quatro amostras por bloco de transferência e até cinco blocos dentro do vaso de vácuo limita a capacidade total a 20 amostras. Assim, para projetos com uma grande amostra para a variabilidade da amostra, as amostras devem ser pré-triadas nas linhas de feixe de alto rendimento diamond, e então apenas as amostras mais promissoras devem ser transferidas para o experimento de comprimento de onda longa otimizado subsequente. Embora os titulares de amostras e os blocos de transferência estejam inalterados em relação à sua introdução inicial há alguns anos, as ferramentas de manuseio aqui apresentadas são todas novas desenvolvimentos. Os porta-amostras dedicados do I23 são imutáveis devido ao seu papel no conceito de resfriamento para a linha de trave. Como tal, o desenho das ferramentas de manuseio de amostras visava criar um elo entre esse novo tipo de suporte e ferramentas comerciais padrão disponíveis comercialmente que a comunidade de usuários MX havia adotado por muito tempo, como combipucks, varinhas de colheita de cristais e o sistema de transporte seco. Seu projeto envolvia uma consulta significativa com a comunidade de usuários e exigia várias iterações para ser concluída. Os equipamentos, ferramentas e protocolo apresentados aqui representam um sistema simples e robusto para a transferência de amostras de usuários para experimentos na linha de luz I23 na Diamond Light Source. Este instrumento para cristalografia macromolecular de comprimento de onda longa no vácuo abre novas oportunidades para a biologia estrutural.

A difração de raios-X de comprimento de onda longa é usada para aproveitar as propriedades de dispersão anômalas de átomos de luz específicos nativamente presentes em macromoléculas. Isso ajuda a resolver o problema da fase cristalográfica e a confirmar inequivocamente a identidade e a localização de tais elementos dentro das macromoléculas. Enquanto nos primeiros dias da cristalografia macromolecular, as estruturas de novo foram resolvidas por múltiplas substituições isomorfos1, com o advento de linhas de raios-X tificável em síncrotrons, o enfeitio experimental baseado em multi-comprimento de onda e comprimento de onda única (SAD) técnicas de difração anômola (SAD) tornaram-se os métodos dominantes2 . Ambos os métodos têm historicamente se baseado no sinal isomorfo ou anômroo de metais pesados, que precisam ser introduzidos artificialmente nos cristais por co-cristalização ou imersão de cristal3. A abordagem de tentativa e erro e o resultado imprevisível podem tornar esses experimentos frustrantemente demorados. A incorporação de seleno-metionina durante a expressão proteica4 é uma maneira muito elegante de superar essas limitações e explorar a difração anômima em comprimentos de onda curtos, embora possa ser muito desafiador nos sistemas de expressão de proteínas eucarióticas.
MX de comprimento de onda longa é extremamente atraente para a determinação da estrutura por experimentos SAD nativos5,6 devido à conveniência de usar cristais diretamente de um teste de cristalização bem sucedido sem tratamento adicional. Além disso, o acesso às bordas de absorção de elementos de alta importância biológica, como cálcio, potássio, cloro, enxofre e fósforo, abre a oportunidade de identificar diretamente as posições desses elementos em macromoléculas7,8,9,10. Em média e baixa resolução, a atribuição de elementos baseados na densidade eletrônica 2Fo-Fc e no ambiente químico pode ser difícil, particularmente para elementos com número semelhante de elétrons ou íons fracamente ligados com ocupações parciais. Essas ambiguidades podem ser resolvidas coletando dados abaixo e acima da borda de absorção do elemento de interesse e interpretação da diferença anômula de fases do modelo resultante Fourier mapeia11,12. Localizar posições de átomos de enxofre nesses mapas também pode ajudar a construção de modelos em mapas de densidade eletrônica de baixa resolução13. As bordas de absorção desses elementos de luz são observadas em comprimentos de onda entre λ = 3 e 6 Å (ver Figura 1, topo). Este alcance de comprimento de onda tem sido muito além das capacidades de qualquer linha de feixe MX síncrotron, e a operação eficiente nesta faixa requer superar vários desafios técnicos, conforme descrito abaixo.
Beamline I23 em Diamond Light Source, Reino Unido, é um instrumento único, projetado especificamente para facilitar experimentos MX de comprimento de onda longa, incapaz em uma faixa de comprimento de onda entre λ = 1,13 e 5,9 Å (faixa de energia entre E = 2,1 e 11 keV). Operando em um ambiente de alto vácuo14, a absorção de ar e a dispersão são eliminadas, consequentemente aumentando a eficiência dos experimentos de difração e a relação sinal-ruído. Uma grande estação de endiçamento a vácuo inclui todos os componentes do ambiente amostral, incluindo o detector pilatus 12M semi-cilíndrico, um goniômetro de vários eixos, os sistemas de visualização e colmia on-line, bem como o equipamento sob medida para transferência e armazenamento de amostras (Figura 2). Cada equipamento foi otimizado para garantir que os dados de comprimento de onda longa de melhor qualidade possam ser coletados. O detector Pilatus 12M curvo pode coletar para ângulos de difração de 2φ = ±100°, resultando em dados de difração de alta resolução suficientemente altos mesmo em comprimentos de onda mais longos (Figura 1, inferior). Os 120 módulos detectores foram especificamente selecionados para compatibilidade de baixa energia e foram fornecidas calibrações para um modo adicional de ganho ultra-alto.
O menor limiar de detector possível é de 1,8 keV, levando a aumento de efeitos de canto e borda para energias inferiores a 3,6 keV e qualidade de dados comprometida nos comprimentos de onda mais longos, particularmente para cristais de baixa mosaico, pode ser observado. Esse efeito em combinação com a diminuição da eficiência quântica do detector15 precisa ser levado em consideração ao planejar um experimento. O goniômetro multiplatariculo permite a reorientação de cristais para permitir estratégias de coleta de dados que maximizem a qualidade e a força do sinal anômroo, bem como a completude dos dados anômalos coletados. A absorção de amostras é um fator limitante para os experimentos, particularmente em comprimentos de onda mais longos. As correções de absorção, implementadas em pacotes de software de processamento MX comumente usados16,17, estão funcionando bem para comprimentos de onda em torno de 3 Å. Comprimentos de onda mais longos exigirão correções de absorção analíticas baseadas em reconstruções tomográficas18 ou ablação a laser para remover material não difusor e cortar os cristais em formas bem definidas19. Este último também ajudará a reduzir o tamanho de cristais maiores, pois experimentos de difração de raios-X em comprimentos de onda mais longos são mais eficientes para cristais menores14. O desafio de manter amostras a temperaturas criogênicas durante a coleta de dados é abordado pelo resfriamento condutivo, já que o uso de dispositivos de fluxo aberto de gás frio não é compatível com um ambiente de vácuo. Assim, materiais termicamente condutores, como o cobre, são necessários para conectar a amostra a um criocooler do tubo de pulso. Os pinos padrão SPINE de aço inoxidável usados em toda a MX, bem como quaisquer outros suportes de amostra disponíveis comercialmente, não são adequados para mx de comprimento de onda longa no vácuo devido à sua má condutividade térmica.
Os porta-amostras (SHs) para MX no vácuo devem ser uma parte essencial da via térmica de remoção de calor (Figura 3A). Como tal, eles consistem em um corpo e pino de cobre termicamente condutores e incluem duas características importantes: uma forte base de ímã para garantir uma ligação térmica adequada à cabeça do goniômetro frio, e um suporte amostral, feito de poliímida, para minimizar a absorção de raios-X e a dispersão20. Esforços foram feitos para garantir que a experiência do usuário de colheita de cristais e resfriamento de flash seja quase idêntica à associada às práticas padrão de MX. Como os SHs I23 dedicados não são diretamente compatíveis com outras linhas de feixe síncrotron, um adaptador de aço inoxidável é usado para compatibilidade com as varinhas magnéticas de colheita de cristal e interfaces goniômetro existentes em outras linhas de feixe MX (Figura 3B). O adaptador também é importante para fazer uso das instalações de automação em outras linhas de vigas Diamond MX, que são baseadas em cabeças de gripper robô tipo ALS21 e layouts básicos estilo unipuck22, se a variação de amostra exigir uma pré-triagem rápida para seleção dos melhores cristais de difusão. O protocolo de preparação e carregamento da amostra pode ser dividido em duas etapas:
Estágio 1: Colheita de cristais e congelamento de flash realizados por usuários em seus próprios laboratórios
Após avaliação da adequação do projeto para coleta de dados I23, os titulares de amostras com loops que correspondem aos tamanhos de cristal (pré-montados com adaptadores) são enviados aos laboratórios de usuários para coleta de cristais. Para evitar qualquer dano, SHs e adaptadores não devem ser separados e devem ser usados como uma unidade para fins de pesca de cristais com laços de tamanho apropriado usando varinhas magnéticas padrão de colheita de cristais. Como é comum no MX, esta tarefa é realizada manualmente sob o microscópio, e os cristais são imediatamente resfriados em uma de guerra de espuma com nitrogênio líquido23. Devido a uma incompatibilidade de forças magnéticas, as SHs atualmente não são compatíveis com unipucks. O armazenamento e o envio são realizados por meio de combipucks (ver a Tabela de Materiais), que estão disponíveis aos usuários mediante solicitação, juntamente com as pastilhas de dry shipper compatíveis (Figura 3C). Estes discos compartilham a mesma placa base com as unipucks amplamente utilizadas e permitem uma rápida pré-triagem de amostras em outras linhas de raios Diamond MX. Emprestar este equipamento aos usuários é atualmente o melhor arranjo, até que os detentores de amostras sob medida estejam disponíveis comercialmente. O transporte para a linha de transporte requer os carregadores secos padrão usados na comunidade MX.
Estágio 2: Transferência de amostras resfriadas crio-cooled para a estação de vácuo
Uma vez que as amostras chegam na linha de luz, elas são preparadas para transferência para a estação de vácuo. Isso envolve a remoção de SHs de combipucks e a separação de adaptadores. A introdução de amostras biológicas ao vácuo é realizada rotineiramente no campo da microscopia crio-elétron. Alguns dos conceitos bem estabelecidos foram adaptados para a transferência de amostras I23. Em suma, as SHs são transferidas sob nitrogênio líquido para blocos de transferência (Figura 3D). Estes blocos possuem excelente condutividade térmica e uma massa térmica significativa, impedindo que os cristais atinjam a temperatura de transição de vidro quando no vácuo. Até quatro blocos, com capacidade de quatro amostras cada, são carregados sob nitrogênio líquido em um disco de bloco (Figura 3H), que é usado tanto para a transferência de amostras para o Sistema de Transferência Criogênica (CTS) ou para armazenamento em dewars de nitrogênio líquido entre experimentos.
O Sistema de Transferência Criogênica desenvolvido na Diamond Light Source é composto por dois sub-conjuntos, a Estação de Amostra e o Shuttle (Figura 4A). A Estação de Amostra consiste em um banho de nitrogênio líquido para armazenamento temporário de cristais proteicos e possui características específicas para garantir a segurança e permitir uma experiência fácil de usar (Figura 5). O CTS é controlado por um controlador lógico programável através de uma interface touchscreen fácil de usar. A Estação de Amostra tem diodos emissores de luz embutidos para melhor visualização e um conjunto de aquecedores controlados em close-loop para automatizar a secagem do banho de nitrogênio líquido uma vez que as amostras tenham sido transferidas. Também possui uma variedade de sensores para garantir a segurança e o funcionamento eficiente do sistema. A Estação de Amostra tem hardware sob medida para fornecer uma interface elétrica confiável para interagir com o transporte para operações, como bombear até vácuo áspero para transferência de amostras, bem como monitoramento dos níveis de nitrogênio líquido e a temperatura dentro do transporte.
O Shuttle (Figura 6) é um dispositivo portátil usado para pegar um bloco de transferência do banho de nitrogênio líquido da Estação amostra e transferi-lo dentro de um ambiente criogênico e de vácuo para a estação final. Inclui uma de guerra de nitrogênio líquido para manter as amostras frias durante a transferência, monitoramento de nível líquido na de guerra e uma variedade de sensores para operação e segurança do usuário. O braço de transferência é equipado com uma unidade magnética e inclui ranhuras usinadas para orientar os usuários em blocos de transferência de carregamento e descarga com segurança para a estação final. A transferência da nave auxiliar para o vaso de vácuo é conduzida através de uma câmara de ar. A câmara de ar é uma interface para a nave auxiliar na estação final usada para evacuar o interespaço entre a nave auxiliar e a estação final, antes de abrir as válvulas de vácuo da nave auxiliar e da estação final. As sequências de bombeamento e ventilação são totalmente automatizadas e podem ser operadas através de uma grande tela sensível ao toque com uma interface fácil de usar (Figura 4C). O protocolo atual é usado para transferir um cristal de talumatina para a estação final de vácuo para coleta de dados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12M detector</td>
			<td>Dectris, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>single-photon-counting X-ray detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CombiPuck</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-P1</td>
			<td>Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal-harvesting magnetic wand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td>Used for harvesting crystal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Shipper (CX100)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-21</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-PTC1</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton polyimide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sample mount made of Kapton polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perpsex lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>acrylic lid with built-in rotation key</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin powder</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source

A cristalografia macromolecular de comprimento de onda longa (MX) explora as propriedades anômalas de dispersão de elementos, como enxofre, fósforo, potássio, cloro ou cálcio, que muitas vezes estão presentes nativamente em macromoléculas. Isso permite a solução de estrutura direta de proteínas e ácidos nucleicos através de eliminação experimental sem a necessidade de rotulagem adicional. Para eliminar a significativa absorção de raios-X neste regime de comprimento de onda, esses experimentos são realizados em um ambiente de vácuo. Beamline I23 na Diamond Light Source, Reino Unido, é o primeiro instrumento síncrotron do seu tipo, projetado e otimizado para experimentos MX na longa faixa de comprimento de onda para 5 Å. 
Para tornar isso possível, um grande vaso de vácuo inclui todos os componentes de estação final do ambiente amostral. A necessidade de manter amostras a temperaturas criogênicas durante o armazenamento e coleta de dados no vácuo requer o uso de suportes de amostras termicamente condutores. Isso facilita a remoção eficiente do calor para garantir o resfriamento da amostra para aproximadamente 50 K. O protocolo atual descreve os procedimentos utilizados para preparação e transferência de amostras para vácuo na linha de trave I23. Garantindo uniformidade em práticas e métodos já estabelecidos dentro da comunidade de cristalografia macromolecular, o resfriamento da amostra à temperatura de nitrogênio líquido pode ser realizado em qualquer ambiente de laboratório equipado com ferramentas MX padrão. 
O armazenamento criogênico e o transporte de amostras exigem apenas equipamentos padrão comercialmente disponíveis. Equipamentos especializados são necessários para a transferência de cristais criogenicamente resfriados de nitrogênio líquido para a estação de vácuo. Ferramentas de manuseio de amostras sob medida e um sistema de transferência criogênica dedicado (CTS) foram desenvolvidos em casa. Os dados de difração coletados em amostras preparadas por este protocolo mostram excelentes estatísticas de fusão, indicando que a qualidade das amostras é imrateira durante o procedimento. Isso abre oportunidades únicas para MX no vácuo em um comprimento de onda além das linhas de síncrotron padrão.

Um cristal de talumatina foi introduzido na estação de vácuo usando o protocolo descrito acima. Os dados de difração foram coletados em um comprimento de onda de 2,7552 Å (E = 4500 eV) como 3600 imagens com um incremento de rotação de 0,1° e 0,1 s de exposição por imagem. O tamanho do feixe foi ajustado para 150 μm x 150 μm e reduzido para transmissão de 10%, com uma medição de fluxo correspondente de 7,1 x 109 fótons/s. A escolha de λ = 2,7552 Å baseia-se em um compromisso entre o aumento dos efeitos anômalos de sinal e absorção da amostra e a diminuição da resolução para comprimentos de onda mais longos. Embora não esteja perto da borda teórica de absorção de enxofre (λ= 5,0095 Å), neste comprimento de onda, a contribuição imaginária para o fator de dispersão do enxofre f" é de 1,57 e- , um fator de 1,6-2,1 maior em comparação com comprimentos de onda entre 1,7 e 2 Å. Os sinais anômalos mais fortes resultantes permitem o sucesso do S-SAD para projetos mais desafiadores.
Uma variedade de experimentos difíceis de eliminação já foram realizados na linha de trave I2324,25,26,27, com dados coletados neste comprimento de onda. Embora o esfinge por S-SAD seja possível usando comprimentos de onda muito mais curtos, isso muitas vezes requer a construção de sinal anômo através da fusão de dados de muitos cristais isomorfos para alcançar valores multiplicidade ao longo de 10028. Devido ao sinal anômroo aprimorado em comprimentos de onda mais longos, a maioria dos projetos de eliminação resolvidos no I23 só exigia dados de um cristal. Uma imagem de difração representativa é mostrada na Figura 7, à esquerda. O processamento de dados utilizando Xia2-3dii29 produziu excelentes estatísticas de fusão, conforme descrito na Tabela 1. A Figura 7, à direita, mostra parte de uma imagem representativa de difração do conjunto de dados thaumatin e ilustra o baixo fundo em torno das reflexões de Bragg, o que contribui para os grandes valores de I/σ(I) normalmente observados na configuração do vácuo, garantindo que apenas raios-X espalhados pela amostra cheguem ao detector.
A resolução máxima alcançável de 1,8 Å deve-se à geometria do detector e ao comprimento de onda escolhido da radiação de raios-X. O conjunto de dados produziu um sinal anômroo muito forte, refletido na inclinação média do parâmetro de probabilidade normal anômroo de 2.677, facilitando a solução de estrutura pelo duto de eliminação automática CRANK2. A alta qualidade do mapa de densidade eletrônica resultante permitiu a construção bem sucedida do modelo automático pelo módulo Buccaneer30 dentro do CRANK231, com colocação correta para 100% da sequência de aminoácidos de thaumatina. A diferença anômera em fases do mapa Fourier, calculado com ANODE11, revela 16 átomos de enxofre muito bem ordenados e um átomo de enxofre de Cys159 com duas conformações alternativas, como confirmado pelas 18 alturas significativas dos picos nas posições dos dispersores anômalos na Tabela 2. Os 16 resíduos de cisteína dentro de thaumatin formam 8 pontes de dissulfeto, que são todas claramente visíveis no mapa 2Fo-Fc (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> Figura 1: Dados de difração de alta resolução de experimentos MX de comprimento de onda longa. (A) Plot de valores f" contra energia, indicando bordas de absorção de elementos de luz acessíveis na linha de luz I23. (B) Resolução máxima alcançável nos cantos do detector P12M contra energia. Abreviação: MX = cristalografia macromolecular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> Figura 2: Seção horizontal através do vaso de vácuo com todos os componentes da estação final. Abreviação: OAV = sistema de visualização no eixo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> Figura 3: Ferramentas de manuseio de amostras. (A) Suporte de amostra I23. (B) Pino padrão da coluna MX (esquerda) ao lado de um suporte de amostra I23 com adaptador (à direita). (C) Tampa e base com suportes de amostra I23 (azul). Bloqueie a tampa do disco e a base com dois blocos de transferência (ouro). Uma bengala seca, compatível com combipucks e discos de bloco, é visível na parte de trás. (D) Bloco de transferência com quatro titulares de amostras I23. (E) Ferramenta de chave usada para a rotação da base do disco de bloco. (F) Varinha separadadora. (G) Ferramenta separadora de disco com duas setas mostrando as configurações altas e baixas. (H) Bloqueie a base do disco com quatro blocos vazios de. (I) Tampa para o disco de bloco. (J) Recipiente de espuma com todas as ferramentas necessárias para a transferência de suportes de amostras de bases combipuck para blocos de cobre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> Figura 4: Sistema de Transferência Criogênica. (A) Estação de amostra CTS com transporte anexado e os funis utilizados para enchimento. (B) Um disco de bloco com dois blocos de transferência posicionados dentro da tela sensível ao toque do software cts. (C) CTS. Abreviação: CTS = Sistema de Transferência Criogênica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> Figura 5: Estação amostra do sistema de transferência criogênica. Abreviaturas: LEDs = diodos emissores de luz; LN2 = nitrogênio líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> Figura 6: Transporte do sistema de transferência criogênica. Abreviaturas: LEDs = diodos emissores de luz; LN2 = nitrogênio líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> Figura 7: Imagens de difração. À esquerda, uma imagem de difração do conjunto de dados coletado no cristal thaumatin. Certo, um ponto de difração cercado por pixels de fundo de baixa contagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> Figura 8: Solução estrutural de Thaumatin com duto automático CRANK2 (configurações padrão, sem refinamento subsequente). (A) Visão geral da thaumatina com mapa 2Fo-Fc a 1,6σ (azul) e diferença anômal em fases mapa Fourier a 5σ calculado em ANODE (verde). (B) Visão geral da thaumatina mostrando apenas a diferença anômera em fases do mapa fourier em 5σ. (C) Visão de close-up de uma ponte de dissulfeto presente em thaumatin com mapa 2Fo-Fc a 1,6σ (azul) e diferença anômalo em fases fourier mapa a 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome</td>
			<td>Thaumatin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Comprimento de onda de coleta de dados (Å) (energia (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de imagens x tamanho da cunha (°)</td>
			<td>3600 x 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grupo espacial</td>
			<td>
P 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Constantes celulares unitárias</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resolução (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Completude</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicidade</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>No meio da encosta</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Estatísticas de coleta e processamento de dados para Thaumatin a 2.755 Å comprimento de onda na linha de trave I23, DLS. Para resolução, completude, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) e multiplicidade, conchas de alta resolução são mostradas entre parênteses. Abreviação: DLS = Fonte de Luz de Diamante.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Átomo mais próximo</td>
			<td>Altura máxima (sigma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>MET112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Diferença anômeada As alturas máximas do mapa Fourier calculadas pelo ANODE usando o modelo em fases e construído automaticamente a partir do CRANK2.

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Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Aqui, apresentamos um protocolo para preparação de amostras criogênicas e transferência de cristais para a estação final de vácuo na linha de luz I23 na Diamond Light Source, para experimentos de cristalografia de raios-X de comprimento de onda longa.

Protocolo de preparação e transferência de amostras para cristalografia de comprimento de onda longa no vácuo na linha de luz I23 na Fonte de Luz de Diamante

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

A cristalografia macromolecular de comprimento de onda longa explora o sinal anômo de átomos de luz nativamente presentes em proteínas e ácidos nucleicos. Esta técnica é usada para resolver experimentalmente o problema da face cristalográfica e para determinar a identidade e localização desses elementos. Beamline I23 na Diamond Light Source é um instrumento síncrotron exclusivo otimizado para experimentos em comprimentos de onda longos até cinco angstrom.Permite o acesso às bordas de absorção de elementos de alta relevância biológica, como cálcio, potássio, cloro, enxofre e fósforo. Devido à significativa absorção de raios-X pelo ar no regime de comprimento de onda longa, esses experimentos são realizados em um ambiente de vácuo. Para manter amostras a temperaturas criogênicas dentro do ambiente de vácuo, os cristais são montados em suportes de amostras dedicados e condutores termicamente.A transferência de amostra criogênica do nitrogênio líquido para a estação final de vácuo é muito semelhante às técnicas utilizadas na microscopia crio-elétron. Este protocolo apresenta o procedimento de transferência de cristais para o ambiente de vácuo usando as ferramentas e equipamentos desenvolvidos na Diamond Light Source. Comece separando a tampa da base do CombiPuck de tal forma que os suportes de amostra permaneçam presos à base e os frascos sejam retidos na tampa.Mergulhe a tampa com frascos de nitrogênio líquido, em seguida, conecte um porta-amostras e adaptador a uma varinha magnética e colhe os cristais. Esfrie diretamente cada amostra no CombiPuck, observando a posição da amostra. Para fechar o disco, use uma varinha de disco para prender a base à tampa.Transfira o CombiPuck de nitrogênio líquido para o carregador seco ou armazenamento. Coloque a base do disco de bloco já povoada com blocos de transferência vazios em sua base de suporte em um recipiente de espuma e, em seguida, encha com nitrogênio líquido. Em seguida, coloque o CombiPuck no recipiente de espuma cheio de nitrogênio líquido, certificando-se de que a base do disco esteja presa ao suporte magnético dentro do recipiente de espuma.Pré-esfrie todas as ferramentas necessárias em nitrogênio líquido. Em seguida, separe a tampa da base usando a ferramenta separadora do disco no ajuste superior, de tal forma que a base permaneça presa ao suporte magnético, expondo os suportes de amostra dentro do nitrogênio líquido. Coloque a varinha separadadora sobre o suporte de amostra e o adaptador o mais longe possível, certificando-se de que a varinha é vertical.Mova a pequena alavanca na varinha do separador para baixo com o polegar até que ele clique para fixar o suporte da amostra dentro e puxe o suporte da amostra do adaptador. Abaixe o separador sobre a posição desejada do bloco de transferência, certificando-se de que um dos três pinos se encaixe dentro do orifício central do bloco de transferência. Solte o suporte da amostra movendo a alavanca de volta para cima.Para carregar amostras no próximo bloco de transferência, use a ferramenta chave do carrossel para girar um bloco de transferência vazio na posição horizontal. Uma vez que todos os suportes de amostra são transferidos, feche o disco do bloco colocando a tampa em nitrogênio líquido. Aguarde o equilíbrio da temperatura e, em seguida, coloque a tampa sobre a base e levante suavemente para soltar do carrossel.Anexar a nave auxiliar à estação. Abra o gás nitrogênio e as válvulas de ar e certifique-se de que os gases estão fluindo. Em seguida, ligue o CTS.Esfrie tanto o banho quanto a nave auxiliar com nitrogênio líquido. Coloque o funil fornecido na porta de enchimento na nave auxiliar e despeje lentamente nitrogênio líquido no funil enquanto monitora o nível na tela. Pare quando o indicador passar de vermelho para azul.Encha o banho com nitrogênio líquido usando o funil. Transfira um disco de bloco de nitrogênio líquido para o banho CTS usando a ferramenta separadora do disco anexado. Retire a tampa do disco do bloco e feche a tampa do banho CTS.Para introduzir um bloco de transferência no transporte, desbloqueie a alça da nave, girando 90 graus no sentido horário e avance-a em direção ao banho para que a pista guiada na alça imponha o caminho correto da viagem. Uma vez que a tampa do bloco seja resfriada, avance a alça para introduzir o bloco na nave auxiliar. Para travar o bloco de transferência na nave auxiliar, gire a alça 180 graus no sentido horário.Retire a pega para a posição traseira original e bloqueie-a no lugar girando 90 graus no sentido anti-horário. Pressione a bomba da válvula de transporte de perto na tela de exibição para iniciar a evacuação da nave auxiliar. Uma vez que as mensagens Navegem prontas para mover e não mova a haste, a válvula fechada é exibida na tela de toque, pressione a alavanca por baixo da nave auxiliar e levante-a cuidadosamente usando a alça na parte superior.Leve a nave auxiliar até a câmara de ar na estação de extremidade de vácuo em posição vertical e anexe-a. Selecione uma posição de bloco vazia dentro da nave pressionando o botão correspondente na tela de toque e movendo o hotel de amostra para a posição de carregamento correta. Uma vez que um hotel de amostra esteja em posição, pressione o botão Abrir para iniciar a sequência de entrelaçamento de vácuo.Depois que a sequência estiver completa e o status mudar para Airlock aberto, bloqueie a nave auxiliar, gire a alça 90 graus no sentido horário para desbloquear a haste. Empurre suavemente a haste para dentro da embarcação para que a trilha guiada imponha o caminho correto da viagem em direção ao hotel de amostra. Insira lentamente o bloco de transferência no hotel usando o feed de vídeo exibido na tela para orientação, garantindo que o ícone de posição do bloco no visor de toque seja ativado.Uma vez ativado, gire a alça 180 graus no sentido anti-horário para liberar o bloco de transferência e retirar a haste da nave. Uma vez totalmente retraído, gire a alça 90 graus no sentido anti-horário para travar a haste. Pressione o botão Close para fechar a válvula de vácuo da estação final e ventilar o espaço entre o ônibus e a nave à pressão atmosférica.Remova a nave auxiliar quando a tela da câmara de ar mostrar o status OK para se desprender. Devolva a nave auxiliar ao banho cts e pressione a Válvula de Transporte Aberto para evacuar a nave antes de carregar o próximo bloco de amostra. Uma vez que o semáforo esteja verde e a mensagem OK para mover a haste apareça, o próximo bloco de transferência pode ser introduzido na nave auxiliar.Para preparar o próximo bloco de transferência, gire o disco de bloco dentro do banho. Empurre a tecla de rotação incorporada na parte superior da tampa acrílica para baixo na trava no centro do disco de bloco. Enquanto segurá-lo para baixo, vire a chave para posicionar o bloco de transferência desejado na posição de captação.Uma vez que todos os blocos tenham sido transferidos, certifique-se de que a válvula de transporte está aberta, pressione o botão Bake na tela de toque, selecione bath e shuttle e pressione Start Bake. A linha de cristalografia cristalina de comprimento de onda longa I23 da Diamond Light Source pode acessar as bordas de absorção de elementos de alta importância biológica, como cálcio, potássio, cloro, enxofre e fósforo, dando um sinal anômola aprimorado que pode ser usado para esfingar ou localizar esses elementos dentro de macromoléculas. Os dados de difração foram coletados de um único cristal de talumatina no comprimento de onda 2,75 angstrom, escolhido como um compromisso entre o aumento do sinal anômo e os efeitos de absorção de amostras em comprimentos de onda mais longos.A configuração do vácuo garante que apenas os raios-X espalhados pela amostra cheguem ao detector, fornecendo baixo fundo em torno dos reflexos de Bragg. O conjunto de dados rendeu um sinal anômroo muito forte, facilitando a solução da estrutura pelo duto automático DE eliminação CRANK2. A alta qualidade do mapa de densidade eletrônica resultante permitiu a construção de modelos automáticos bem sucedidos, com colocação correta para 100% da sequência de aminoácidos de thaumatina.Os 16 resíduos de cisteína dentro da talumatina formam oito pontes de dissulfeto, todas claramente visíveis no mapa de densidade de elétrons. Uma vez que a cristalografia proteica de comprimento de onda longa no vácuo é um novo campo, desenvolvemos novas ferramentas e equipamentos de manuseio de amostras. Este protocolo orienta os usuários a transferir amostras com segurança para a estação final de vácuo na linha de luz I23 na Diamond Light Source.O ambiente de vácuo abre oportunidades únicas para realizar experimentos de difração em uma faixa de comprimento de onda não acessível em outras linhas de luz. A cristalografia de raios-X de comprimento de onda longa permite a eliminação experimental de macromoléculas diretamente de cristais nativos. Também permite a identificação inequívoca de íons ligados às moléculas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Preparação e entrega de microcristais de proteína na fase cúbica lipídico para Serial Femtosecond Cristalografia

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Bioquímica

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Um suporte de amostra tudo-em-um para a cristalografia macromolecular do raio X com espalhamento mínimo do fundo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Análise dos dados da SEC-SAXS via desconvolução e dispersão da EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Otimizando o Crescimento de Cristais de Endotiapsina para Experimentos de Cristalografia Seriada

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristalização e Determinação Estrutural de uma Enzima:Complexo de Substrato por Cristalografia Serial em um Chip Microfluido Versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Fluxo de trabalho e ferramentas para triagem de fragmentos cristalográficos no Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Um pipeline de preparação de amostras para microcristais na linha de feixe VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Preparação de Lamelas a partir de Amostras Biológicas Vítreas Usando um Microscópio Eletrônico de Varredura de Feixe Duplo para Tomografia Crio-Eletrônica

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...