Name: sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Адама Тейлора, Адама Прескотта, Кена Джонса, Арвиндера Палаху и Кевина Уилкинсона за их поддержку в разработке криогенной системы переноса образцов (CTS). Эта работа финансировалась компанией iNEXT-Discovery (Grant 871037), финансируемой программой Horizon 2020 Европейской комиссии.

1. Сбор кристаллов
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты: очки и перчатки, где это возможно.
<ol><li>После того, как SHs прибудут в пользовательскую лабораторию в комбипуках (рисунок 3C), отделите крышку от основания комбипука таким образом, чтобы SHs оставались прикрепленными к основанию, а флаконы сохранялись в крышке.</li>
	<li>Погрузите крышку флаконами в жидкий азот. Прикрепите адаптер SH + (рисунок 3B, справа) к магнитной палочке и собирайте кристаллы, как обычно.</li>
	<li>Мгновенно охлаждайте каждый образец непосредственно в комбинезон, отмечая положение образца. Чтобы закрыть шайбу, используйте палочку для шайбы, чтобы прикрепить основание к крышке.</li>
	<li>Перенесите комбипук из жидкого азота в сухой грузоотправитель или хранилище жидкого азота dewar. Отправьте сухого грузоотправителя в Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>2. Перенос образца в вакуум
<ol><li>Загрузка SH из комбинезона в передаточный блок<ol>
<li>Поместите основание шайбы блока (рисунок 3H), уже заполненное пустыми передаточными блоками (рисунок 3D), на его опорное основание внутри жидкого азота в пенопластовом контейнере (рисунок 3J-b). ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентация блоков переноса важна для точности переноса образца внутри вакуумного сосуда. Таким образом, блоки должны быть размещены на основании шайбы блока, убедившись, что булавка, отмеченная стрелкой на рисунке 3D , находится слева от блока.</li>
		<li>Поместите флакон в контейнер для пены, заполненный жидким азотом, убедившись, что основание шайбы закреплено на магнитном держателе внутри пенопластового контейнера (рисунок 3J-a).</li>
		<li>Предварительно охладите все необходимые инструменты жидким азотом. Используйте инструмент сепаратора шайбы, показанный на рисунке 3G на высокой настройке H , чтобы отделить крышку от основания, так что основание остается прикрепленным к магнитному держателю, а SHs подвергаются воздействию внутри жидкого азота.</li>
		<li>Чтобы удалить каждый SH из его адаптера, используйте палочку-разделитель (рисунок 3F), чтобы поднять SH из основания гребня и поместить в соответствующее положение передаточного блока в горизонтальном положении карусели на рисунке 3J-b.<ol>
<li>Поместите палочку сепаратора над адаптером SH + как можно дальше вниз, убедившись, что палочка вертикальна, чтобы избежать прикосновения к образцу.</li>
			<li>Переместите небольшой рычаг на палочке сепаратора вниз большим пальцем, пока он не щелкнет, чтобы закрепить SH внутри и вытащить SH из адаптера.</li>
			<li>Опустите сепаратор в нужное положение блока, убедившись, что один из трех зубцов помещается внутри центрального отверстия блока.</li>
			<li>Отпустите SH, переместив рычаг обратно вверх. Повторите эти шаги для каждого SH.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Чтобы загрузить образцы в следующий блок образцов, используйте инструмент ключа кольцевой галереи (рисунок 3E), чтобы повернуть пустой блок в горизонтальное положение.</li>
		<li>Прикрепите инструмент для разделения шайбы, показанный на рисунке 3G , используя низкую настройку L к крышке шайбы блока, прикрутив по часовой стрелке.</li>
		<li>После того, как все SH будут переданы, чтобы закрыть шайбу блока, поместите крышку в жидкий азот и подождите, пока температура уравновесится, затем установите крышку над основанием, как показано на рисунке 3I. С прикрепленным сепараторным инструментом осторожно поднимите, чтобы освободиться от карусели.</li>
		<li>На этом этапе блок-шайба может быть перенесена в ЦТС (рисунок 4В) или в хранилище жидкого азота Дьюара.</li>
	</ol></li>
	<li>Загрузка передаточных блоков в вакуумный сосуд<ol><li>Убедитесь, что шаттл надежно прикреплен к станции. Откройте газовые азотные и воздушные клапаны и убедитесь, что газы текут. Включите CTS.</li>
		<li>Если на дисплее не видно предупреждающих сообщений, продолжайте охлаждать ванну и шаттл жидким азотом. Поместите прилагаемую воронку в заправочное отверстие на шаттле и медленно налейте жидкий азот в воронку, контролируя уровень на экране. Остановитесь, когда индикатор превратится с красного на синий. ПРИМЕЧАНИЕ: Шаттл готов к использованию, когда температура холодного сиденья, отображаемого на сенсорном экране, ниже 100 К. Ванна Sample Station может быть заполнена одновременно с помощью правильной воронки до уровня, отмеченного на стенке ванны или 100% на дисплее уровня жидкого азота. Датчики уровня жидкого азота и температуры должны постоянно контролироваться на протяжении всей работы; потребуется несколько пополнений.</li>
		<li>Как только температура холодного сиденья шаттла станет ниже 100 К и уровень жидкого азота на шаттле и ванне стабилизируется, перенесите блочную шайбу из жидкого азота в ванну CTS с помощью прилагаемого инструмента для разделения шайбы. Снимите крышку блок-шайбы, и закройте крышку ванны CTS.</li>
		<li>Чтобы ввести блок в шаттл, откройте клапан CTS, если он еще не открыт, нажав кнопку «Открыть клапан шаттла» на дисплее. Разблокируйте ручку шаттла, повернув на 90° по часовой стрелке, и переместите ее к ванне, чтобы направляющаяся дорожка на ручке обеспечивала правильный путь движения к ванне. Как только крышка блока будет видна внутри ванны, дайте крышке остыть. После того, как пузырьки жидкого азота вокруг крышки прекратились, переходите к передаточному блоку.</li>
		<li>Чтобы зафиксировать передаточный блок на шаттле, поверните ручку на 180° по часовой стрелке.</li>
		<li>Втяните ручку в исходное заднее положение, а затем «заблокируйте» ее на месте, повернув на 90° против часовой стрелки.</li>
		<li>Нажмите Close Shuttle Valve & Pump на экране дисплея, чтобы начать эвакуацию шаттла.</li>
		<li>Как только сообщение Shuttle ready to detach отобразится на сенсорном экране, нажмите на рычаг под шаттлом и осторожно поднимите его, используя ручку наверху.</li>
		<li>Отнесите шаттл к шлюзу на вакуумной конечной станции в вертикальном положении.</li>
		<li>Прикрепите шаттл к шлюзу на вакуумной конечной станции. ПРИМЕЧАНИЕ: После надежного крепления сенсорный экран на конечной станции подтвердит состояние шаттла и блокировки.</li>
		<li>Выберите положение пустого блока внутри судна, нажав соответствующую кнопку на сенсорном экране и переместив образец отеля в правильное положение загрузки.</li>
		<li>Как только образец отеля будет в положении, кнопка Открыть станет активной. Нажмите эту кнопку, чтобы инициировать последовательность вакуумной блокировки. ПРИМЕЧАНИЕ: Насос запустится, и прогресс будет отображаться на мониторе. Это может занять до двух минут.</li>
		<li>После завершения последовательности состояние изменится на Airlock open, передача выполняется. Поверните рукоятку на 90° по часовой стрелке, чтобы разблокировать стержень, и осторожно протолкните стержень в сосуд, чтобы направляющаяся дорожка снова обеспечивала правильный путь движения к выборочному положению отеля. Используя видеопоток, отображаемый на экране для наведения, медленно вставьте блок в отель, убедившись, что индикатор положения блока на сенсорном дисплее активирован. После активации поверните ручку на 180° против часовой стрелки, чтобы освободить блок, и вытащите стержень из сосуда. После полного втягивания поверните ручку на 90° против часовой стрелки, чтобы зафиксировать стержень.</li>
		<li>Как только стержень будет заблокирован, кнопка Закрыть станет активной. Нажмите на него, чтобы закрыть вакуумный клапан конечной станции, и выведите пространство между шаттлом и сосудом под атмосферное давление, ожидая завершения до 20 с.</li>
		<li>Подождите, пока дисплей покажет состояние «нормально», чтобы удалить шаттл после завершения последовательности. На этом этапе снимите шаттл и вернитесь в CTS, чтобы повторить процесс для следующего блока.</li>
		<li>Чтобы подготовить следующий блок к передаче, поверните шайбу блока внутрь ванны. Нажмите встроенный ключ вращения на верхней части акриловой крышки вниз в замок в центре блок-шайбы. Удерживая его, поверните ключ , чтобы расположить нужный блок в положении подборщика.</li>
		<li>После того, как все блоки будут перенесены, убедитесь, что челночный клапан открыт, пока он установлен на CTS. Нажмите кнопку выпечки на сенсорном экране и выберите ванну и шаттл, затем нажмите «Выпекать». ПРИМЕЧАНИЕ: Это нагревает как шаттл, так и ванну, чтобы выкипятить жидкий азот и впоследствии испарить любой накопленный лед / конденсацию перед следующим использованием. Как только выпечка начнется, газ и воздух могут быть отключены.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+haemoglobin+-+IV.+Sign+determination+by+the+isomorphous+replacement+method.">The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287 (1954).</li><li>Hendrickson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anomalous+diffraction+in+crystallographic+phase+evaluation.">Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).</li><li>Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+heavy-atom+derivatization+of+protein+crystals.">An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).</li><li>Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selenomethionyl+proteins+produced+for+analysis+by+multiwavelength+anomalous+diffraction+(MAD):+A+vehicle+for+direct+determination+of+three-dimensional+structure.">Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure.</a> The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).</li><li>Liu, Q., Hendrickson, W. A., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+use+of+anomalous+diffraction+in+biomolecular+structure+analysis.">Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis.</a> Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. 1607, 377-399 (2017).</li><li>Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+SAD+is+maturing.">Native SAD is maturing.</a> IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).</li><li>Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+potassium+ions+for+ribosome+structure+and+function+revealed+by+long-wavelength+X-ray+diffraction.">Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction.</a> Nature Communications. 10 (1), 2519 (2019).</li><li>Rocchio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+dynamic,+partially+occupied+residues+using+anomalous+scattering.">Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).</li><li>Langan, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anomalous+X-ray+diffraction+studies+of+ion+transport+in+K++channels.">Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4540 (2018).</li><li>Lolicato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K2p+channel+C-type+gating+involves+asymmetric+selectivity+filter+order-disorder+transitions.">K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions.</a> Science Advances. 6 (44), (2020).</li><li>Thorn, A., Sheldrick, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANODE:+anomalous+and+heavy-atom+density+calculation.">ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation.</a> Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).</li><li>Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+metal-binding+sites+in+proteins+with+X-ray+crystallography.">Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).</li><li>Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+amino+acid+transport+by+the+CAT+family+of+SLC7+transporters.">Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters.</a> Nature Communications. 9 (1), 550 (2018).</li><li>Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vacuum+long-wavelength+macromolecular+crystallography.">In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).</li><li>Wernecke, J., Gollwitzer, C., M&#252;ller, P., Krumrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in-vacuum+PILATUS+1M+detector.">Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+tomographic+reconstruction+of+macromolecular+samples.">X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples.</a> Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).</li><li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+membrane+protein+crystal+using+ultraviolet+laser+irradiation.">Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).</li><li>Mykhaylyk, V., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+long-wavelength+protein+crystallography:+Keeping+a+protein+crystal+frozen+in+vacuum.">Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum.</a> Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010 (2013).</li><li>Snell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+mounting+and+alignment+system+for+biological+crystallography+at+a+synchrotron+source.">Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source.</a> Structure. 12 (4), 537-545 (2004).</li><li>. The universal container project Available from: <a target="_blank" href="https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/">https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/</a> (2020)</li><li>Teng, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+freestanding+thin-film.">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).</li><li>Esposito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glycosyltransferase+activity+of+the+salmonella+effector+SseK3.">Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).</li><li>O'Donnell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+EMC+reveals+a+path+for+membrane+protein+insertion.">The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion.</a> eLife. 9, 57887 (2020).</li><li>Mishra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+characterization+of+crimean-congo+hemorrhagic+fever+virus+GP38.">Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38.</a> Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).</li><li>Rudolf, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+inhibits+its+receptor+patched+by+a+pincer+grasp+mechanism.">The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism.</a> Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).</li><li>El Omari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+sulfur+sad+phasing:+De+novo+structure+solution+of+the+n-terminal+domain+of+the+ectodomain+of+hcv+e1.">Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIA2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Buccaneer+software+for+automated+model+building.+1.+Tracing+protein+chains.">The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).</li><li>Skubak, P., Pannu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+protein+structure+solution+from+weak+X-ray+data.">Automatic protein structure solution from weak X-ray data.</a> Nature Communications. 4 (1), 2777 (2013).</li></ol>

Текущий протокол был разработан для соответствия требованиям к пробоподготовке для экспериментов в вакууме с длинными волнами MX на лучевой линии I23. Он использовался на линии луча в течение прошлого года и способствовал успешному завершению нескольких проектов. Как показывают представленные здесь результаты, протокол обеспечивает безопасную и надежную передачу образцов на вакуумную конечную станцию при сохранении их дифракционного качества. Это важный аспект для работы линии луча и будет сопровождаться личным обучением пользователей персоналом beamline. Некоторые из этих шагов заслуживают особого внимания как критически важные для успешного и безопасного завершения процедуры: перенос образцов из оснований комбипука в блоки образцов требует точности и внимания, с тем чтобы избежать повреждения образцов (см. этап 2.1.4); мониторинг уровня жидкого азота на всех этапах имеет важное значение для предотвращения воздействия проб на воздух или тесного контакта с частями, которые не охлаждаются должным образом (2.1.3 и 2.2.2); ожидание полного завершения последовательности Close (2.2.14), прежде чем снимать шаттл с конечной станции (2.2.15), чтобы избежать деградации вакуума конечной станции.
Концепция протокола была инициирована вместе с инженерными усилиями, направленными на разработку специализированного оборудования для переноса кристаллов белка в вакуумную среду. Конечными продуктами этого проекта были CTS и связанные с ней инструменты обработки образцов, описанные выше. CTS является значительным улучшением по сравнению со своим предшественником, Leica EM VCT10014, и устраняет многочисленные ограничения, такие как отсутствие экранирования образцов и вакуумной среды во время передачи, накопление льда внутри ванны с жидким азотом, а также отсутствие интуитивно понятного пользовательского интерфейса и функций безопасности. Дополнительными функциями CTS, которые улучшают пользовательский опыт, являются мониторинг температуры и уровня жидкого азота внутри шаттла и станции отбора проб, ванна большей емкости, вмещающая четыре блока одновременно, а не один, и самоуправляемый механизм для работы шаттла. CTS полностью интегрирован в систему управления линией луча с удобным интерфейсом сенсорного экрана и повышенной вакуумной и механической безопасностью при взаимодействии с конечной станцией.
Beamline I23 является первым длинноволновым синхротронным прибором MX в своем роде и, как таковой, введение кристаллов белка в высоковакуумную среду и хранение их при криогенных температурах потребовало значительных усилий. Продолжается совершенствование средств и протокола подготовки образцов, а также усилия по рационализации процессов. В рамках поддержки пользователей сотрудники Beamline всегда готовы помочь в устранении неполадок. Примером одного из таких сценариев могут быть проблемы, которые ставят под угрозу целостность вакуумной системы, что приводит к трудностям при подключении или снятии шаттла с / из воздушного шлюза CTS или конечной станции. Различные уровни тестов проводятся еженедельно и ежедневно, и обучение пользователей будет охватывать дополнительные проверки, чтобы избежать потенциальных сбоев, таких как визуальный осмотр O-колец на интерфейсах, к которым прикрепляется шаттл. В то время как вакуумная среда открывает возможность для проведения дифракционных экспериментов в диапазоне длин волн, недоступном на других линиях луча, дополнительный этап передачи снижает общую пропускную способность образца.
Ручная передача только с четырьмя образцами на блок переноса и до пяти блоков внутри вакуумного сосуда ограничивает общую емкость до 20 образцов. Следовательно, для проектов с большой выборкой для вариативности выборки образцы должны быть предварительно просеяны на алмазных высокопроизводительных лучевых линиях, а затем только наиболее перспективные образцы должны быть переданы для последующего оптимизированного длинноволнового эксперимента. В то время как держатели образцов и блоки передачи не изменились с момента их первоначального введения несколько лет назад, инструменты обработки, представленные здесь, являются новыми разработками. Специальные держатели образцов I23 неизменяемы из-за их роли в концепции охлаждения линии луча. Таким образом, конструкция инструментов для обработки образцов была направлена на создание связи между этим новым типом держателя и стандартными коммерчески доступными инструментами, которые сообщество пользователей MX использовало в течение длительного времени, такими как комбипуки, палочки для сбора кристаллов и система транспортировки сухих грузоотправителей. Их разработка включала в себя значительные консультации с сообществом пользователей и требовала нескольких итераций для завершения. Оборудование, инструменты и протокол, представленные здесь, представляют собой простую и надежную систему для передачи пользовательских образцов для экспериментов на линии луча I23 в Diamond Light Source. Этот прибор для вакуумной длинноволновой макромолекулярной кристаллографии открывает новые возможности для структурной биологии.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12M detector</td>
			<td>Dectris, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>single-photon-counting X-ray detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CombiPuck</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-P1</td>
			<td>Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal-harvesting magnetic wand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td>Used for harvesting crystal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Shipper (CX100)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-21</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-PTC1</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton polyimide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sample mount made of Kapton polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perpsex lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>acrylic lid with built-in rotation key</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin powder</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source

Длинноволновая макромолекулярная кристаллография (MX) использует аномальные свойства рассеяния элементов, таких как сера, фосфор, калий, хлор или кальций, которые часто присутствуют в макромолекулах. Это позволяет получить прямое структурное решение белков и нуклеиновых кислот с помощью экспериментальной фазы без необходимости дополнительной маркировки. Чтобы исключить значительное поглощение воздуха рентгеновскими лучами в этом режиме длин волны, эти эксперименты проводят в вакуумной среде. Beamline I23 в Diamond Light Source, Великобритания, является первым синхротронным прибором такого рода, разработанным и оптимизированным для экспериментов MX в длинноволновом диапазоне до 5 Å. 
Чтобы сделать это возможным, большой вакуумный сосуд охватывает все компоненты конечной станции среды образца. Необходимость поддержания образцов при криогенных температурах при хранении и сборе данных в вакууме требует использования термопроводящих держателей образцов. Это способствует эффективному отводу тепла для обеспечения охлаждения образца примерно до 50 К. Текущий протокол описывает процедуры, используемые для пробоподготовки и передачи образцов в вакуум на лучевой линии I23. Обеспечивая единообразие в практиках и методах, уже установленных в сообществе макромолекулярной кристаллографии, охлаждение образца до температуры жидкого азота может быть выполнено в любых лабораторных условиях, оснащенных стандартными инструментами MX. 
Для криогенного хранения и транспортировки образцов требуется только стандартное коммерчески доступное оборудование. Для переноса криогенно охлажденных кристаллов из жидкого азота в вакуумную конечную станцию требуется специализированное оборудование. На месте были разработаны специальные инструменты для обработки образцов и специальная криогенная система переноса (CTS). Дифракционные данные, собранные на образцах, подготовленных с использованием этого протокола, показывают отличную статистику слияния, указывающую на то, что качество образцов не изменяется во время процедуры. Это открывает уникальные возможности для вакуумного MX в диапазоне длин волн за пределами стандартных линий синхротронного пучка.

Кристалл тауматина был введен на вакуумную конечную станцию с использованием протокола, описанного выше. Дифракционные данные собирались на длине волны 2,7552 Å (E = 4500 эВ) в виде 3600 изображений с шагом поворота 0,1° и экспозицией 0,1 с на изображение. Размер пучка был скорректирован до 150 мкм х 150 мкм и уменьшен до 10% пропускания с соответствующим измерением потока 7,1 х 109 фотонов/ с. Выбор λ = 2,7552 Å основан на компромиссе между увеличением аномальных эффектов поглощения сигнала и образца и уменьшением разрешения до более длинных волн. Хотя это и не близко к теоретическому краю поглощения серы (λ= 5,0095 Å), на этой длине волны воображаемый вклад в коэффициент рассеяния серы f" составляет 1,57 e- , что в 1,6-2,1 раза больше по сравнению с длинами волн между 1,7 и 2 Å. Полученные в результате более сильные аномальные сигналы позволяют успешно проводить фазирование S-SAD для более сложных проектов.
На линии пучка I2324,25,26,27 уже были проведены различные сложные поэтапные эксперименты с данными, собранными на этой длине волны. Хотя фазирование S-SAD возможно с использованием гораздо более коротких длин волн, это часто требует создания аномального сигнала путем слияния данных из многих изоморфных кристаллов для достижения значений кратности в течение 10028 года. Из-за усиленного аномального сигнала на более длинных волнах большинство поэтапных проектов, решаемых на I23, требовали данных только от одного кристалла. Репрезентативное дифракционное изображение показано на рисунке 7 слева. Обработка данных с использованием Xia2-3dii29 дала отличные статистические данные о слиянии, как показано в таблице 1. На рисунке 7 справа показана часть репрезентативного дифракционного изображения из набора данных тауматина и проиллюстрирован низкий фон, окружающий отражения Брэгга, что способствует большим значениям I/σ(I), обычно наблюдаемым в вакуумной установке, гарантируя, что только рентгеновские лучи, рассеянные образцом, достигают детектора.
Максимально достижимое разрешение 1,8 Å обусловлено геометрией детектора и выбранной длиной волны рентгеновского излучения. Набор данных дал очень сильный аномальный сигнал, отраженный в среднем наклоне аномального нормального параметра вероятности 2,677, что облегчило структурное решение автоматическим фазовым трубопроводом CRANK2. Высокое качество полученной карты электронной плотности позволило успешно построить автоматическую модель модулем Buccaneer30 в CRANK231 с правильным размещением 100% аминокислотной последовательности тауматина. Фазированная аномальная разностная карта Фурье, рассчитанная с помощью ANODE11, показывает 16 очень хорошо упорядоченных атомов серы и один атом серы из Cys159 с двумя альтернативными конформациями, что подтверждается 18 значительными высотами пиков в положениях аномальных рассеивателей в таблице 2. 16 остатков цистеина в тауматине образуют 8 дисульфидных мостиков, которые хорошо видны на карте 2Fo-Fc (рисунок 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> Рисунок 1: Дифракционные данные высокого разрешения из длинноволновых экспериментов MX. (A) График значений f" по отношению к энергии, показывающий края поглощения световых элементов, доступных на линии луча I23. (B) Максимальное разрешение, достижимое в углах детектора P12M против энергии. Аббревиатура: MX = макромолекулярная кристаллография. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> Рисунок 2: Горизонтальное сечение через вакуумный сосуд со всеми компонентами конечной станции. Аббревиатура: OAV = система просмотра по оси. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> Рисунок 3: Инструменты для обработки образцов. (A) I23 Держатель образца. (B) Стандартный штифт MX (слева) рядом с держателем образца I23 с адаптером (справа). (C) Крышка и основание Combipuck с держателями образцов I23 (синий). Блок крышки шайбы и основания с двумя передаточными блоками (золото). Сзади видна сухая трость грузоотправителя, совместимая как с гребнями, так и с блок-шайбами. (D) Передаточный блок с четырьмя держателями образцов I23. (E) Ключевой инструмент, используемый для вращения основы блок-шайбы. F) Палочка-сепаратор. (G) Инструмент для разделения шайб с двумя стрелками, показывающими высокие и низкие настройки. (H) Блок шайбы базы с четырьмя пустыми кубиками Cu. (I) Крышка для блок-шайбы. J) Пенопластовый контейнер со всеми необходимыми инструментами для переноса держателей образцов с оснований комбинезонов на медные блоки. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> Рисунок 4: Криогенная система переноса. (A) Пробоотборная станция CTS с прикрепленным челноком и воронками, используемыми для наполнения. (B) Блок шайбы с двумя передающими блоками, расположенными внутри CTS. (C) Сенсорный экран программного обеспечения управления CTS. Аббревиатура: CTS = Криогенная система переноса. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> Рисунок 5: Станция отбора проб криогенной системы переноса. Сокращения: светодиоды = светодиоды; LN2 = жидкий азот. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> Рисунок 6: Криогенная система передачи шаттлов. Сокращения: светодиоды = светодиоды; LN2 = жидкий азот. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> Рисунок 7: Дифракционные изображения. Слева дифракционное изображение из набора данных, собранных на кристалле тауматина. Справа, дифракционное пятно, окруженное фоновыми пикселями с низким количеством. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> Рисунок 8: Структурное решение Thaumatin с автоматическим трубопроводом CRANK2 (настройки по умолчанию, без последующей доработки). (A) Обзор тауматина с картой 2Fo-Fc при 1,6σ (синий) и фазированной аномальной разностной картой Фурье при 5σ, рассчитанной в ANODE (зеленый). (B) Обзор тауматина, показывающий только фазированную аномальную карту разности Фурье при 5σ. (C) Крупный план дисульфидного моста, присутствующего в тауматине, с картой 2Fo-Fc при 1,6σ (синий) и фазированной аномальной разностной картой Фурье при 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Имя</td>
			<td>Тауматин</td>
		</tr>
<tr>
<td>Длина волны сбора данных (Å) (энергия (эВ))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Количество изображений x размер клина (°)</td>
			<td>3600 х 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Спейсгрупп</td>
			<td>
П 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Константы ячейки единицы измерения</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Е)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Разрешение (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Полнота</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>ISa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Рмеас</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>РПИМ</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>СС1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Многочисленность</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Средний склон</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Статистика сбора и обработки данных по тауматину на длине волны 2,755 Å на линии луча I23, DLS. Для разрешения, полноты, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) и множественности оболочки высокого разрешения показаны в скобках. Аббревиатура: DLS = алмазный источник света.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Ближайший атом</td>
			<td>Пиковая высота (сигма)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>МЕТ112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>ЦИС149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>ЦЮС177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>СИС164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>СИС71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 2: Аномальная разность фурье карта пиковых высот, рассчитанная ANODE с использованием поэтапной и автоматически построенной модели из CRANK2.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Здесь мы представляем протокол криогенной пробоподготовки и переноса кристаллов в вакуумную конечную станцию на лучевой линии I23 в Diamond Light Source, для длинноволновых макромолекулярных рентгеновских кристаллографических экспериментов.

Протокол подготовки и передачи образцов для внутривакуумной длинноволновой кристаллографии на лучевой линии I23 на алмазном источнике света

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Длинноволновая макромолекулярная кристаллография использует аномальный сигнал от атомов света, изначально присутствующих в белках и нуклеиновых кислотах. Данная методика используется для экспериментального решения кристаллографической задачи лица и определения идентичности и расположения этих элементов. Beamline I23 at Diamond Light Source - это уникальный синхротронный прибор, оптимизированный для экспериментов на длинных волнах до пяти ангстрем.Это позволяет получить доступ к краям поглощения элементов высокой биологической значимости, таких как кальций, калий, хлор, сера и фосфор. Из-за значительного поглощения рентгеновских лучей воздухом в длинноволновом режиме эти эксперименты проводятся в вакуумной среде. Для поддержания образцов при криогенных температурах внутри вакуумной среды кристаллы устанавливаются на специальные термопроводящие держатели образцов.Криогенный перенос образца из жидкого азота на вакуумную конечную станцию очень похож на методы, используемые в криоэлектронной микроскопии. В этом протоколе представлена процедура переноса кристаллов в вакуумную среду с использованием инструментов и оборудования, разработанных в Diamond Light Source. Начните с отделения крышки от основания CombiPuck таким образом, чтобы держатели образцов оставались прикрепленными к основанию, а флаконы удерживались в крышке.Погрузите крышку с флаконами в жидкий азот, затем прикрепите держатель для образцов и адаптер к магнитной палочке и соберите кристаллы. Промывка охлаждает каждый образец непосредственно в CombiPuck, отмечая положение образца. Чтобы закрыть шайбу, используйте палочку для шайбы, чтобы прикрепить основание к крышке.Перенесите CombiPuck из жидкого азота в сухой грузоотправитель или хранилище. Поместите основание шайбы блока, уже заполненное пустыми передаточными блоками, на его опорное основание в пенопластовый контейнер, затем заполните жидким азотом. Затем поместите CombiPuck в пенопластовый контейнер, наполненный жидким азотом, убедившись, что основание шайбы закреплено на магнитном держателе внутри пенопластового контейнера.Предварительно охладите все необходимые инструменты жидким азотом. Затем отделите крышку от основания с помощью инструмента сепаратора шайбы на высокой установке, так что основание остается прикрепленным к магнитному держателю, подвергая держатели образцов внутри жидкого азота. Поместите сепараторную палочку над держателем образца и адаптером как можно дальше вниз, убедившись, что палочка вертикальна.Переместите небольшой рычаг на палочке сепаратора вниз большим пальцем, пока он не щелкнет, чтобы закрепить держатель образца внутри, и вытащите держатель образца из адаптера. Опустите сепаратор в нужное положение передаточного блока, убедившись, что один из трех зубцов помещается внутри центрального отверстия передаточного блока. Отпустите держатель образца, переместив рычаг обратно вверх.Чтобы загрузить образцы в следующий блок передачи, используйте инструмент ключа карусели для поворота пустого блока передачи в горизонтальное положение. После того, как все держатели образцов будут переданы, закройте шайбу блока, поместив крышку в жидкий азот. Подождите, пока температура уравновесится, а затем установите крышку над основанием и осторожно поднимите, чтобы освободиться от карусели.Прикрепите шаттл к станции. Откройте газовые азотные и воздушные клапаны и убедитесь, что газы текут. Затем включите CTS.Охладите ванну и шаттл жидким азотом. Поместите прилагаемую воронку в заправочное отверстие на шаттле и медленно налейте жидкий азот в воронку, контролируя уровень на экране. Остановитесь, когда индикатор превратится с красного на синий.Наполните ванну жидким азотом с помощью воронки. Перенесите блочную шайбу из жидкого азота в ванну CTS с помощью прилагаемого инструмента для разделения шайбы. Снимите крышку блок-шайбы и закройте крышку ванны CTS.Чтобы ввести передаточный блок в шаттл, разблокируйте ручку шаттла, повернув на 90 градусов по часовой стрелке, и переместите ее в сторону ванны, чтобы управляемая дорожка на ручке обеспечивала правильный путь движения. Как только крышка блока остынет, переместите ручку, чтобы ввести блок в шаттл. Чтобы зафиксировать передаточный блок на шаттле, поверните ручку на 180 градусов по часовой стрелке.Втяните ручку в исходное заднее положение и зафиксируйте ее на месте, повернув на 90 градусов против часовой стрелки. Нажмите Закрыть насос челночного клапана на экране дисплея, чтобы начать эвакуацию шаттла. Как только сообщения Шаттл готов к движению и Не перемещать стержень, клапан закрыт отображаются на сенсорном экране, нажмите на рычаг под шаттлом и осторожно поднимите его с помощью ручки наверху.Отнесите шаттл к шлюзу на вакуумной конечной станции в вертикальном положении и прикрепите его. Выберите положение пустого блока внутри судна, нажав соответствующую кнопку на сенсорном экране и переместив образец отеля в правильное положение загрузки. Как только образец отеля будет в положении, нажмите кнопку Открыть, чтобы инициировать последовательность вакуумной блокировки.После того, как последовательность завершена и состояние изменится на Airlock open, блокируйте в шаттле, поверните ручку на 90 градусов по часовой стрелке, чтобы разблокировать стержень. Осторожно втолкните стержень в судно, чтобы направляющаяся дорожка обеспечивала правильный путь движения к образцу отеля. Медленно вставьте блок трансфера в отель, используя видеопоток, отображаемый на экране для руководства, убедившись, что значок положения блока на сенсорном дисплее активирован.После активации поверните рукоятку на 180 градусов против часовой стрелки, чтобы освободить передаточный блок и вытащить стержень из сосуда. После полного втягивания поверните ручку на 90 градусов против часовой стрелки, чтобы зафиксировать стержень. Нажмите кнопку Close, чтобы закрыть вакуумный клапан конечной станции и выпустить пространство между шаттлом и сосудом под атмосферное давление.Извлеките шаттл, когда на дисплее блокировки отобразится состояние OK для отсоединения. Верните шаттл в ванну CTS и нажмите «Открытый клапан шаттла», чтобы эвакуировать шаттл перед загрузкой следующего блока образцов. Как только светофор станет зеленым и появится сообщение OK для перемещения стержня, следующий блок передачи может быть введен в шаттл.Чтобы подготовить следующий трансферный блок, поверните шайбу блока внутрь ванны. Нажмите встроенный ключ вращения на верхней части акриловой крышки вниз в замок в центре блок-шайбы. Удерживая его, поверните ключ, чтобы расположить нужный передаточный блок в положении пикапа.После того, как все блоки были перенесены, убедитесь, что челночный клапан открыт, нажмите кнопку Bake на сенсорном экране, выберите Bath и Shuttle, затем нажмите Start Bake. Длинноволновая макромолекулярная кристаллографическая лучевая линия I23 в diamond Light Source может получить доступ к краям поглощения элементов высокой биологической важности, таких как кальций, калий, хлор, сера и фосфор, давая усиленный аномальный сигнал, который может быть использован для фазирования или размещения этих элементов в макромолекулах. Дифракционные данные были собраны из одного кристалла тауматина на длине волны 2,75 ангстрема, выбранного в качестве компромисса между повышенным аномальным сигналом и эффектами поглощения образца на более длинных волнах.Вакуумная установка гарантирует, что только рентгеновские лучи, рассеянные образцом, достигают детектора, обеспечивая низкий фон вокруг отражений Брэгга. Набор данных выдавал очень сильный аномальный сигнал, облегчая структурное решение с помощью автоматического поэтапного трубопровода CRANK2. Высокое качество полученной карты электронной плотности позволило успешно построить автоматическую модель с правильным размещением 100% аминокислотной последовательности тауматина.16 остатков цистеина в тауматине образуют восемь дисульфидных мостиков, которые хорошо видны на карте электронной плотности. Поскольку вакуумная длинноволновая кристаллография белка является новой областью, мы разработали новые инструменты и оборудование для обработки образцов. Этот протокол помогает пользователям безопасно передавать образцы на вакуумную конечную станцию на лучевой линии I23 в Diamond Light Source.Вакуумная среда открывает уникальные возможности для проведения дифракционных экспериментов в диапазоне длин волн, недоступном на других линиях луча. Длинноволновая рентгеновская кристаллография позволяет экспериментально фазировать макромолекулы непосредственно из нативных кристаллов. Это также позволяет однозначно идентифицировать ионы, связанные с молекулами.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Универсальный выборочный держатель для макромолекулярной рентгеновской кристаллографии с минимальным рассеянием фона

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Оптимизация роста кристаллов эндотиапепсина для серийных кристаллографических экспериментов

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Кристаллизация и структурное определение фермента: Субстратный комплекс по серийной кристаллографии в универсальном микрофлюидной чипе

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Рабочий процесс и инструменты для скрининга кристаллографических фрагментов в Берлинском центре Гельмгольца

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Получение ламелей из биологических образцов стекловидного тела с помощью двухлучевого сканирующего электронного микроскопа для криоэлектронной томографии

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...