Name: sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha y Kevin Wilkinson por su apoyo en el desarrollo del Sistema de Transferencia de Muestras Criogénicas (CTS). Este trabajo fue financiado por iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado por el programa Horizonte 2020 de la Comisión Europea.

1. Cosecha de cristales
NOTA: Use el equipo de protección personal adecuado: gafas y guantes, siempre que sea posible.
<ol><li>Después de que los SH lleguen al laboratorio del usuario en combipucks (Figura 3C), separe la tapa de la base del combipuck de tal manera que los SH permanezcan unidos a la base, y los viales se retengan en la tapa.</li>
	<li>Sumergir la tapa con viales en nitrógeno líquido. Conecte un adaptador SH + (Figura 3B, derecha) a una varita magnética y recolecte cristales como de costumbre.</li>
	<li>Enfríe cada muestra directamente en el combipuck, tomando nota de la posición de la muestra. Para cerrar el disco, use una varita de disco para unir la base a la tapa.</li>
	<li>Transfiera el combipuck del nitrógeno líquido al cargador seco o al dewar de almacenamiento de nitrógeno líquido. Envíe el remitente seco a Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>2. Transferencia de muestras al vacío
<ol><li>Carga de SH desde combipuck al bloque de transferencia<ol>
<li>Coloque la base del disco de bloque (Figura 3H) ya poblada con bloques de transferencia vacíos (Figura 3D) sobre su base de soporte dentro del nitrógeno líquido en un recipiente de espuma (Figura 3J-b). NOTA: La orientación de los bloques de transferencia es importante para la precisión de la transferencia de muestras dentro del recipiente de vacío. Como tal, los bloques deben colocarse en la base del disco de bloque asegurándose de que el pasador marcado con una flecha en la Figura 3D esté a la izquierda del bloque.</li>
		<li>Coloque el disco del vial en el recipiente de espuma lleno de nitrógeno líquido, asegurándose de que la base del disco esté asegurada al soporte magnético dentro del recipiente de espuma (Figura 3J-a).</li>
		<li>Pre-enfríe todas las herramientas necesarias en nitrógeno líquido. Utilice la herramienta separadora de discos que se muestra en la Figura 3G en el ajuste alto H para separar la tapa de la base, de modo que la base permanezca unida al soporte magnético y los SH estén expuestos dentro del nitrógeno líquido.</li>
		<li>Para retirar cada SH de su adaptador, utilice la varita separadora (Figura 3F) para recoger el SH de la base de combipuck, y colóquelo en la posición apropiada del bloque de transferencia en la posición horizontal del carrusel en la Figura 3J-b.<ol>
<li>Coloque la varita separadora sobre el adaptador SH + lo más abajo posible, asegurándose de que la varita esté vertical, para evitar tocar la muestra.</li>
			<li>Mueva la pequeña palanca de la varita separadora hacia abajo con el pulgar hasta que haga clic, para asegurar el SH en el interior y tirar del SH del adaptador.</li>
			<li>Baje el separador sobre la posición de bloque deseada, asegurándose de que una de las tres puntas quepa dentro del orificio central del bloque.</li>
			<li>Suelte el SH moviendo la palanca hacia arriba. Repita estos pasos para cada SH.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para cargar muestras en el siguiente bloque de muestras, utilice la herramienta de tecla de carrusel (Figura 3E) para girar un bloque vacío en la posición horizontal.</li>
		<li>Conecte la herramienta separadora de discos que se muestra en la Figura 3G utilizando la L de ajuste bajo a la tapa del disco de bloque atornillando en el sentido de las agujas del reloj.</li>
		<li>Una vez que se transfieren todos los SH, para cerrar el disco de bloque, coloque la tapa en nitrógeno líquido y espere a que la temperatura se equilibre, luego coloque la tapa sobre la base como en la Figura 3I. Con la herramienta separadora conectada, levante suavemente para liberarla del carrusel.</li>
		<li>En esta etapa, el disco de bloque se puede transferir al CTS (Figura 4B) o a un dewar de almacenamiento de nitrógeno líquido.</li>
	</ol></li>
	<li>Carga de bloques de transferencia en el recipiente de vacío<ol><li>Asegúrese de que el servicio de transporte esté bien conectado a la estación. Abra las válvulas de gas nitrógeno y aire, y asegúrese de que los gases fluyan. Encienda el CTS.</li>
		<li>Si no hay mensajes de advertencia en la pantalla, proceda a enfriar tanto el baño como el transbordador con nitrógeno líquido. Coloque el embudo suministrado en el puerto de llenado del transbordador y vierta lentamente nitrógeno líquido en el embudo mientras monitorea el nivel en la pantalla. Deténgase cuando el indicador cambie de rojo a azul. NOTA: El transbordador está listo para usar cuando la temperatura del asiento frío que se muestra en la pantalla táctil es inferior a 100 K. El baño de la estación de muestreo se puede llenar simultáneamente utilizando el embudo correcto al nivel marcado en la pared del baño o al 100% en la pantalla de nivel de nitrógeno líquido. Los niveles de nitrógeno líquido y los sensores de temperatura deben monitorearse constantemente durante toda la operación; se requerirán varias recargas.</li>
		<li>Una vez que la temperatura del asiento frío del transbordador esté por debajo de 100 K y los niveles de nitrógeno líquido en el transbordador y el baño se estabilicen, transfiera un disco de bloque de nitrógeno líquido al baño CTS utilizando la herramienta separadora de disco adjunta. Retire la tapa del disco de bloque y cierre la tapa del baño CTS.</li>
		<li>Para introducir un bloque en la lanzadera, abra la válvula CTS, si aún no está abierta, presionando el botón Abrir válvula de lanzadera en la pantalla. Desbloquee el mango del transbordador girando 90 ° en el sentido de las agujas del reloj y avance hacia el baño para que la pista guiada en el mango haga cumplir el camino correcto de viaje hacia el baño. Una vez que la cubierta del bloque sea visible dentro del baño, deje que la cubierta se enfríe. Después de que el burbujeo de nitrógeno líquido alrededor de la cubierta se haya detenido, avance al bloque de transferencia.</li>
		<li>Para bloquear el bloque de transferencia en el transbordador, gire el mango 180 ° en el sentido de las agujas del reloj.</li>
		<li>Retraiga el mango a la posición original hacia atrás y luego "Bloquee" en su lugar girando 90 ° en sentido contrario a las agujas del reloj.</li>
		<li>Presione Cerrar válvula y bomba de lanzadera en la pantalla de visualización para iniciar la evacuación de la lanzadera.</li>
		<li>Una vez que el mensaje Shuttle ready to detach se muestre en la pantalla táctil, presione la palanca debajo del shuttle y levántelo con cuidado con el mango en la parte superior.</li>
		<li>Lleve el transbordador a la esclusa de aire en la estación final de vacío en posición vertical.</li>
		<li>Conecte el transbordador a la esclusa de aire en la estación final de vacío. NOTA: Una vez conectada de forma segura, la pantalla táctil de la estación final confirmará el estado del transbordador y el enclavamiento.</li>
		<li>Seleccione una posición de bloque vacía dentro del recipiente presionando el botón correspondiente en la pantalla táctil y moviendo el hotel de muestra a la posición de carga correcta.</li>
		<li>Una vez que el hotel de muestra esté en su posición, el botón Abrir se activará. Pulse este botón para iniciar la secuencia de enclavamiento al vacío. NOTA: La bomba se iniciará y el progreso se mostrará en el monitor. Esto puede tardar hasta dos minutos en completarse.</li>
		<li>Una vez completada la secuencia, el estado cambiará a Airlock open, transferencia en curso. Gire el mango 90 ° en el sentido de las agujas del reloj para desbloquear la varilla y empuje suavemente la varilla hacia el recipiente para que la pista guiada vuelva a imponer la trayectoria correcta de viaje hacia la posición del hotel de muestra. Utilizando la fuente de video que se muestra en la pantalla como guía, inserte lentamente el bloque en el hotel, asegurándose de que la luz de posición del bloque en la pantalla táctil esté activada. Una vez activado, gire el mango 180 ° en sentido contrario a las agujas del reloj para liberar el bloque y saque la varilla del recipiente. Una vez que esté completamente retraído, gire el mango 90 ° en sentido contrario a las agujas del reloj para bloquear la varilla.</li>
		<li>Una vez que la varilla está bloqueada, el botón Cerrar se activará. Presione esto para cerrar la válvula de vacío de la estación final y ventile el espacio entre el transbordador y el recipiente a la presión atmosférica, esperando hasta 20 s para completarse.</li>
		<li>Espere a que la pantalla muestre el estado correcto para eliminar el transbordador una vez que se complete la secuencia. En este punto, retire la lanzadera y vuelva al CTS para repetir el proceso para el siguiente bloque.</li>
		<li>Para preparar el siguiente bloque para la transferencia, gire el disco de bloque dentro del baño. Empuje la llave de rotación incorporada en la parte superior de la tapa de acrílico hacia abajo en la cerradura en el centro del disco de bloque. Mientras lo mantiene presionado, gire la llave para colocar el bloque deseado en la posición de recogida.</li>
		<li>Una vez que se hayan transferido todos los bloques, asegúrese de que la válvula de lanzadera esté abierta mientras está montada en el CTS. Presione el botón de hornear en la pantalla táctil, seleccione tanto el baño como el transbordador, luego presione hornear. NOTA: Esto calienta tanto el transbordador como el baño para hervir el nitrógeno líquido y posteriormente evaporar cualquier hielo / condensación acumulada antes del próximo uso. Una vez que el horneado ha comenzado, el gas y el aire se pueden apagar.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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El protocolo actual se ha desarrollado para cumplir con los requisitos de preparación de muestras para experimentos MX de longitud de onda larga en vacío en la línea de haz I23. Ha estado en uso en la línea de viga durante el año pasado y ha contribuido a la finalización exitosa de múltiples proyectos. Como lo indican los resultados presentados aquí, el protocolo permite una transferencia segura y confiable de muestras a la estación final de vacío al tiempo que preserva su calidad de difracción. Es un aspecto importante para la operación de la línea de haz y estará acompañado por la capacitación en persona de los usuarios por parte del personal de la línea de luz. Vale la pena destacar algunos de los pasos como críticos para la finalización exitosa y segura del procedimiento: la transferencia de muestras de bases de combipuck a bloques de muestra requiere precisión y atención para evitar dañar muestras (ver paso 2.1.4); el control del nivel de nitrógeno líquido en todas las fases es importante para evitar que las muestras se expongan al aire o estén en estrecho contacto con partes que no se enfrían adecuadamente (2.1.3 y 2.2.2); esperar hasta que la secuencia Close (2.2.14) esté completamente terminada, antes de retirar el transbordador de la estación final (2.2.15), para evitar la degradación del vacío de la estación final.
La concepción del protocolo se inició junto con un esfuerzo de ingeniería destinado a desarrollar equipos especialmente diseñados para la transferencia de cristales de proteínas al entorno de vacío. Los productos finales de este proyecto fueron el CTS y las herramientas de manejo de muestras asociadas descritas anteriormente. El CTS es una mejora significativa con respecto a su predecesor, el Leica EM VCT10014, y elimina múltiples limitaciones, como la falta de blindaje de muestras y el entorno de vacío durante la transferencia, la acumulación de hielo dentro del baño de nitrógeno líquido y la ausencia de una interfaz de usuario intuitiva y características de seguridad. Las características adicionales del CTS que mejoran la experiencia del usuario son el monitoreo de la temperatura y el nivel de nitrógeno líquido dentro del transbordador y la estación de muestras, un baño de mayor capacidad con capacidad que acomoda cuatro bloques simultáneamente, en lugar de uno, y un mecanismo autoguiado para la operación del transbordador. El CTS está totalmente integrado en el sistema de control de la línea de haz con una interfaz de pantalla táctil fácil de usar y una mayor seguridad mecánica y de vacío al interactuar con la estación final.
Beamline I23 es el primer instrumento de sincrotrón MX de longitud de onda larga de su tipo y, como tal, la introducción de cristales de proteínas en un entorno de alto vacío y su almacenamiento a temperaturas criogénicas ha requerido esfuerzos considerables. Las mejoras en las herramientas y el protocolo de preparación de muestras, así como los esfuerzos para agilizar los procesos, están en curso. Como parte del soporte al usuario, el personal de beamline siempre está disponible para ayudar con la solución de problemas. Un ejemplo de uno de estos escenarios serían los problemas que comprometen la integridad del sistema de vacío, lo que llevaría a dificultades para conectar o quitar el transbordador hacia / desde el CTS o la esclusa de aire de la estación final. Se realizan diferentes niveles de pruebas semanales y diarias, y la capacitación del usuario cubrirá verificaciones adicionales para evitar posibles fallas, como la inspección visual de los anillos O en las interfaces a las que se conecta el transbordador. Si bien el entorno de vacío abre la oportunidad de realizar experimentos de difracción en un rango de longitud de onda no accesible en otras líneas de haz, el paso de transferencia adicional reduce el rendimiento general de la muestra.
La transferencia manual con solo cuatro muestras por bloque de transferencia y hasta cinco bloques dentro del recipiente de vacío limita la capacidad total a 20 muestras. Por lo tanto, para los proyectos con una gran variabilidad de muestra a muestra, las muestras deben ser preseleccionadas en las líneas de haz de alto rendimiento Diamond, y luego solo las muestras más prometedoras deben transferirse para el posterior experimento optimizado de longitud de onda larga. Si bien los soportes de muestra y los bloques de transferencia no han cambiado desde su introducción inicial hace unos años, las herramientas de manejo presentadas aquí son todos nuevos desarrollos. Los soportes de muestra dedicados I23 son inmutables debido a su papel en el concepto de enfriamiento para la línea de haz. Como tal, el diseño de las herramientas de manejo de muestras tenía como objetivo crear un vínculo entre este nuevo tipo de soporte y las herramientas estándar disponibles comercialmente que la comunidad de usuarios de MX había adoptado durante mucho tiempo, como los combipucks, las varitas de recolección de cristales y el sistema de transporte de cargadores secos. Su diseño implicó una consulta significativa con la comunidad de usuarios y requirió varias iteraciones para completarse. El equipo, las herramientas y el protocolo presentados aquí representan un sistema simple y robusto para la transferencia de muestras de usuario para experimentos en la línea de haz I23 en Diamond Light Source. Este instrumento para la cristalografía macromolecular de longitud de onda larga en el vacío abre nuevas oportunidades para la biología estructural.

La difracción de rayos X de longitud de onda larga se utiliza para aprovechar las propiedades de dispersión anómalas de átomos de luz específicos presentes de forma nativa en macromoléculas. Esto ayuda a resolver el problema de la fase cristalográfica y a confirmar inequívocamente la identidad y la ubicación de dichos elementos dentro de las macromoléculas. Mientras que en los primeros días de la cristalografía macromolecular, las estructuras de novo se resolvían mediante el reemplazo isomorfo múltiple1, con el advenimiento de líneas de haz de rayos X sintonizables en sincrotrones, la fase experimental basada en técnicas de difracción anómala de longitud de onda múltiple y longitud de onda única (SAD) se ha convertido en el método dominante2 . Ambos métodos se han basado históricamente en la señal isomorfa o anómala de metales pesados, que deben introducirse artificialmente en los cristales mediante cocristalización o remojo de cristales3. El enfoque de prueba y error y el resultado impredecible pueden hacer que estos experimentos consuman frustrantemente tiempo. La incorporación de seleno-metionina durante la expresión de proteínas4 es una forma muy elegante de superar estas limitaciones y explotar la difracción anómala en longitudes de onda cortas, aunque puede ser muy desafiante en los sistemas de expresión de proteínas eucariotas.
Mx de longitud de onda larga es extremadamente atractivo para la determinación de la estructura mediante experimentos nativos de SAD5,6 debido a la conveniencia de usar cristales directamente de un ensayo de cristalización exitoso sin tratamiento adicional. Adicionalmente, el acceso a los bordes de absorción de elementos de alta importancia biológica, como calcio, potasio, cloro, azufre y fósforo, abre la oportunidad de identificar directamente las posiciones de estos elementos en macromoléculas7,8,9,10. A resolución media y baja, la asignación de elementos basada en la densidad de electrones 2Fo-Fc y el entorno químico puede ser difícil, particularmente para elementos con un número similar de electrones o iones débilmente unidos con ocupaciones parciales. Estas ambigüedades pueden resolverse mediante la recopilación de datos por debajo y por encima del borde de absorción del elemento de interés y la interpretación de los mapas de Fourier de diferencia anómala en fase de modelo resultante11,12. La localización de las posiciones de los átomos de azufre en estos mapas también puede ayudar a la construcción de modelos en mapas de densidad de electrones de baja resolución13. Los bordes de absorción de estos elementos ligeros se observan en longitudes de onda entre λ = 3 y 6 Å (ver Figura 1, arriba). Este rango de longitud de onda ha estado mucho más allá de las capacidades de cualquier línea de haz MX de sincrotrón, y una operación eficiente en este rango requiere superar varios desafíos técnicos, como se describe a continuación.
Beamline I23 en Diamond Light Source, Reino Unido, es un instrumento único, diseñado específicamente para facilitar experimentos MX de longitud de onda larga, sintonizable en un rango de longitud de onda entre λ = 1.13 y 5.9 Å (rango de energía entre E = 2.1 y 11 keV). Al operar en un entorno de alto vacío14, se elimina la absorción y dispersión del aire, lo que mejora la eficiencia de los experimentos de difracción y la relación señal-ruido. Una gran estación final de vacío encierra todos los componentes del entorno de la muestra, incluido el detector semicilíndrico Pilatus 12M, un goniómetro multieje, los sistemas de visualización y colimación en línea, así como el equipo a medida para la transferencia y el almacenamiento de muestras (Figura 2). Cada equipo se ha optimizado para garantizar que se puedan recopilar los datos de longitud de onda larga de mejor calidad. El detector curvo Pilatus 12M puede recopilar ángulos de difracción de 2θ = ±100°, lo que resulta en datos de difracción de resolución suficientemente altos incluso en longitudes de onda más largas (Figura 1, abajo). Los 120 módulos detectores han sido seleccionados específicamente para la compatibilidad de baja energía y se han proporcionado calibraciones para un modo adicional de ganancia ultra alta.
El umbral de detector más bajo posible es de 1,8 keV, lo que lleva a un aumento de los efectos de esquina y borde para energías inferiores a 3,6 keV y se puede observar una calidad de datos comprometida en las longitudes de onda más largas, particularmente para cristales de baja mosaicidad. Este efecto en combinación con la disminución de la eficiencia cuántica del detector15 debe tenerse en cuenta al planificar un experimento. El goniómetro multieje permite la reorientación de los cristales para permitir estrategias de recopilación de datos que maximizan la calidad y la fuerza de la señal anómala, así como la integridad de los datos anómalos recopilados. La absorción de muestras es un factor limitante para los experimentos, particularmente en longitudes de onda más largas. Las correcciones de absorción, tal como se implementan en los paquetes de software de procesamiento MX de uso común16,17, están funcionando bien a longitudes de onda de alrededor de 3 Å. Las longitudes de onda más largas requerirán correcciones analíticas de absorción basadas en reconstrucciones tomográficas18 o ablación con láser para eliminar material no difracante y cortar los cristales en formas bien definidas19. Este último también ayudará a reducir el tamaño de cristales más grandes, ya que los experimentos de difracción de rayos X en longitudes de onda más largas son más eficientes para cristales más pequeños14. El desafío de mantener las muestras a temperaturas criogénicas durante la recopilación de datos se aborda mediante el enfriamiento conductivo, ya que el uso de dispositivos de flujo abierto de flujo frío de gas no es compatible con un entorno de vacío. Por lo tanto, se necesitan materiales térmicamente conductores, como el cobre, para conectar la muestra a un refrigerador criogénico de tubo de pulso. Los pines estándar SPINE de acero inoxidable utilizados en todo MX, así como cualquier otro soporte de muestra disponible comercialmente, no son adecuados para MX de longitud de onda larga en vacío debido a su mala conductividad térmica.
Los soportes de muestra (SH) para MX en vacío deben ser una parte esencial de la vía térmica de eliminación de calor (Figura 3A). Como tales, consisten en un cuerpo y un pasador de cobre térmicamente conductores e incluyen dos características importantes: una base de imán fuerte para garantizar un enlace térmico adecuado a la cabeza del goniómetro frío, y un soporte de muestra, hecho de poliimida, para minimizar la absorción y dispersión de rayos X20. Se hicieron esfuerzos para garantizar que la experiencia del usuario de la recolección de cristales y el enfriamiento por flash sea casi idéntica a la asociada con las prácticas estándar de MX. Como los SH I23 dedicados no son directamente compatibles con otras líneas de haz de sincrotrón, se utiliza un adaptador de acero inoxidable para la compatibilidad con las varitas magnéticas de recolección de cristal y las interfaces de goniómetro existentes en otras líneas de haz MX (Figura 3B). El adaptador también es importante para hacer uso de las instalaciones de automatización en otras líneas de haz Diamond MX, que se basan en cabezales de pinza robot tipo ALS21 y diseños de base de estilo unipuck22, si la variación de la muestra requiere una preselección rápida para la selección de los mejores cristales de difracción. El protocolo de preparación y carga de muestras se puede dividir en dos etapas:
Etapa 1: Recolección de cristales y congelación instantánea realizada por los usuarios en sus propios laboratorios
Tras la evaluación de la idoneidad del proyecto para la recopilación de datos I23, los soportes de muestra con bucles que coinciden con los tamaños de cristal (preensamblados con adaptadores) se envían a los laboratorios de los usuarios para la recolección de cristales. Para evitar cualquier daño, los SH y los adaptadores no deben separarse y deben usarse como una unidad con el fin de pescar cristales con bucles de tamaño adecuado utilizando varitas magnéticas estándar de recolección de cristales. Como es común en MX, esta tarea se realiza manualmente bajo el microscopio, y los cristales se enfrían inmediatamente en un dewar de espuma con nitrógeno líquido23. Debido a un desajuste de fuerzas magnéticas, los SH actualmente no son compatibles con unipucks. El almacenamiento y el envío se realizan utilizando combipucks (consulte la Tabla de materiales), que están disponibles para los usuarios que lo soliciten, junto con los insertos de remitente seco compatibles (Figura 3C). Estos discos comparten la misma placa base con los unipucks ampliamente utilizados y permiten una rápida preselección de muestras en otras líneas de haz Diamond MX. Prestar este equipo a los usuarios es actualmente la mejor disposición, hasta que los portamuestras a medida estén disponibles comercialmente. El transporte a la línea de viga requiere los cargadores secos estándar utilizados en la comunidad MX.
Etapa 2: Transferencia de muestras crioenfriadas a la estación final de vacío
Una vez que las muestras llegan a la línea de haz, se preparan para su transferencia a la estación final de vacío. Esto implica la eliminación de los SH de los peinados y la separación de los adaptadores. La introducción de muestras biológicas al vacío se realiza rutinariamente en el campo de la criomicroscopía electrónica. Algunos de los conceptos bien establecidos se adaptaron para la transferencia de muestras I23. En resumen, los SH se transfieren bajo nitrógeno líquido a bloques de transferencia (Figura 3D). Estos bloques tienen una excelente conductividad térmica y una masa térmica significativa, evitando que los cristales alcancen la temperatura de transición vítrea cuando están en vacío. Hasta cuatro bloques, con una capacidad de cuatro muestras cada uno, se cargan bajo nitrógeno líquido en un disco de bloque (Figura 3H), que se utiliza para transferir muestras al Sistema de Transferencia Criogénica (CTS) o para el almacenamiento en dewars de nitrógeno líquido entre experimentos.
El Sistema de Transferencia Criogénica desarrollado en Diamond Light Source consta de dos subconjuntos, la Estación de Muestra y el Transbordador (Figura 4A). La Estación de Muestra consiste en un baño de nitrógeno líquido para el almacenamiento temporal de cristales de proteínas y tiene características específicas para garantizar la seguridad y permitir una experiencia fácil de usar (Figura 5). El CTS está controlado por un controlador lógico programable a través de una interfaz de pantalla táctil fácil de usar. La estación de muestreo tiene diodos emisores de luz incorporados para una mejor visualización y un conjunto de calentadores controlados en bucle cerrado para automatizar el secado del baño de nitrógeno líquido una vez que las muestras han sido transferidas. También tiene una variedad de sensores para garantizar la seguridad y el funcionamiento eficiente del sistema. La estación de muestra tiene hardware a medida para proporcionar una interfaz eléctrica confiable para interactuar con el transbordador para las operaciones, como el bombeo al vacío aproximado para la transferencia de muestras, así como el monitoreo de los niveles de nitrógeno líquido y la temperatura dentro del transbordador.
El Shuttle (Figura 6) es un dispositivo portátil utilizado para recoger un bloque de transferencia del baño de nitrógeno líquido de la Estación de Muestras y transferirlo dentro de un entorno criogénico y de vacío a la estación final. Incluye un dewar de nitrógeno líquido para mantener las muestras frías durante la transferencia, monitoreo del nivel de líquido en el dewar y una variedad de sensores para la operación y la seguridad del usuario. El brazo de transferencia está equipado con un accionamiento magnético e incluye ranuras mecanizadas para guiar a los usuarios en la carga y descarga segura de bloques de transferencia en la estación final. La transferencia desde el transbordador al recipiente de vacío se realiza a través de una esclusa de aire. La esclusa de aire es una interfaz para el transbordador en la estación final utilizada para evacuar el interespacio entre el transbordador y la estación final, antes de abrir las válvulas de vacío del transbordador y la estación final. Las secuencias de bombeo y ventilación están totalmente automatizadas y se pueden operar a través de una gran pantalla táctil con una interfaz fácil de usar (Figura 4C). El protocolo actual se utiliza para transferir un cristal de taumatina a la estación final de vacío para la recopilación de datos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12M detector</td>
			<td>Dectris, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>single-photon-counting X-ray detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CombiPuck</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-P1</td>
			<td>Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal-harvesting magnetic wand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td>Used for harvesting crystal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Shipper (CX100)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-21</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-PTC1</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton polyimide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sample mount made of Kapton polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perpsex lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>acrylic lid with built-in rotation key</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin powder</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source

La cristalografía macromolecular de longitud de onda larga (MX) explota las propiedades de dispersión anómalas de elementos, como azufre, fósforo, potasio, cloro o calcio, que a menudo están presentes de forma nativa en las macromoléculas. Esto permite la solución de estructura directa de proteínas y ácidos nucleicos a través de fases experimentales sin necesidad de etiquetado adicional. Para eliminar la absorción significativa de aire de los rayos X en este régimen de longitud de onda, estos experimentos se realizan en un entorno de vacío. Beamline I23 en Diamond Light Source, Reino Unido, es el primer instrumento de sincrotrón de su tipo, diseñado y optimizado para experimentos MX en el rango de longitud de onda larga hacia 5 Å. 
Para que esto sea posible, un gran recipiente de vacío encierra todos los componentes de la estación final del entorno de la muestra. La necesidad de mantener las muestras a temperaturas criogénicas durante el almacenamiento y la recolección de datos en el vacío requiere el uso de soportes de muestra térmicamente conductores. Esto facilita la eliminación eficiente del calor para garantizar el enfriamiento de la muestra a aproximadamente 50 K. El protocolo actual describe los procedimientos utilizados para la preparación de muestras y la transferencia de muestras al vacío en la línea de haz I23. Asegurando la uniformidad en las prácticas y métodos ya establecidos dentro de la comunidad de cristalografía macromolecular, el enfriamiento de muestras a temperatura de nitrógeno líquido se puede realizar en cualquier entorno de laboratorio equipado con herramientas MX estándar. 
El almacenamiento criogénico y el transporte de muestras solo requieren equipos estándar disponibles comercialmente. Se requiere equipo especializado para la transferencia de cristales enfriados criogénicamente desde nitrógeno líquido a la estación final de vacío. Se han desarrollado internamente herramientas de manejo de muestras a medida y un sistema de transferencia criogénica (CTS) dedicado. Los datos de difracción recopilados en muestras preparadas con este protocolo muestran excelentes estadísticas de fusión, lo que indica que la calidad de las muestras no se altera durante el procedimiento. Esto abre oportunidades únicas para MX en vacío en un rango de longitud de onda más allá de las líneas de haz de sincrotrón estándar.

Se introdujo un cristal de taumatina en la estación final de vacío utilizando el protocolo descrito anteriormente. Los datos de difracción se recogieron a una longitud de onda de 2,7552 Å (E = 4500 eV) como 3600 imágenes con un incremento de rotación de 0,1° y 0,1 s de exposición por imagen. El tamaño del haz se ajustó a 150 μm x 150 μm y se redujo al 10% de transmisión, con una medición de flujo correspondiente de 7,1 x 109 fotones/ s. La elección de λ = 2.7552 Å se basa en un compromiso entre el aumento de la señal anómala y los efectos de absorción de muestras y la disminución de la resolución a longitudes de onda más largas. Aunque no está cerca del borde de absorción teórico del azufre (λ= 5.0095 Å), en esta longitud de onda, la contribución imaginaria al factor de dispersión del azufre f" es 1.57 e- , un factor de 1.6-2.1 mayor en comparación con las longitudes de onda entre 1.7 y 2 Å. Las señales anómalas más fuertes resultantes permiten una fase S-SAD exitosa para proyectos más desafiantes.
Ya se han llevado a cabo una variedad de experimentos difíciles de escalonamiento en la línea de haz I2324,25,26,27, con datos recopilados en esta longitud de onda. Si bien la fase por S-SAD es posible utilizando longitudes de onda mucho más cortas, esto a menudo requiere la construcción de señal anómala a través de la fusión de datos de muchos cristales isomorfos para alcanzar valores de multiplicidad durante 10028. Debido a la señal anómala mejorada en longitudes de onda más largas, la mayoría de los proyectos de fase resueltos en I23 solo requerían datos de un cristal. Una imagen de difracción representativa se muestra en la Figura 7, izquierda. El procesamiento de datos utilizando Xia2-3dii29 produjo excelentes estadísticas de fusión, como se describe en la Tabla 1. La Figura 7, a la derecha, muestra parte de una imagen de difracción representativa del conjunto de datos de taumatina e ilustra el bajo fondo que rodea las reflexiones de Bragg, lo que contribuye a los grandes valores de I / σ (I) típicamente observados en la configuración de vacío, asegurando que solo los rayos X dispersos por la muestra lleguen al detector.
La resolución máxima alcanzable de 1,8 Å se debe a la geometría del detector y a la longitud de onda elegida de la radiación de rayos X. El conjunto de datos produjo una señal anómala muy fuerte, reflejada en la pendiente media del parámetro de probabilidad normal anómalo de 2.677, lo que facilita la solución de la estructura mediante la tubería de fase automática CRANK2. La alta calidad del mapa de densidad de electrones resultante permitió la construcción automática exitosa de modelos por el módulo Buccaneer30 dentro de CRANK231, con la colocación correcta para el 100% de la secuencia de aminoácidos de la taumatina. El mapa de Fourier de diferencia anómala en fase, calculado con ANODE11, revela 16 átomos de azufre muy bien ordenados y un átomo de azufre de Cys159 con dos conformaciones alternativas, como lo confirman las 18 alturas significativas de los picos en las posiciones de los dispersores anómalos en la Tabla 2. Los 16 residuos de cisteína dentro de la taumatina forman 8 puentes disulfuro, que son claramente visibles en el mapa 2Fo-Fc (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> Figura 1: Datos de difracción de alta resolución de experimentos MX de longitud de onda larga. (A) Gráfico de valores de f" contra energía, indicando los bordes de absorción de los elementos de luz accesibles en la línea de haz I23. (B) Resolución máxima alcanzable en las esquinas del detector P12M contra la energía. Abreviatura: MX = cristalografía macromolecular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> Figura 2: Sección horizontal a través del recipiente de vacío con todos los componentes de la estación final. Abreviatura: OAV = sistema de visualización en el eje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> Figura 3: Herramientas de manipulación de muestras. (A) Soporte de muestra i23. (B) Pin estándar de columna MX (izquierda) junto a un soporte de muestra I23 con adaptador (derecha). (C) Tapa y base de Combipuck con portamuestras I23 (azul). Tapa y base de disco de bloque con dos bloques de transferencia (oro). Un bastón de cargador seco, compatible tanto con combipucks como con discos de bloque, es visible en la parte posterior. (D) Bloque de transferencia con cuatro portamuestras I23. (E) Herramienta clave utilizada para la rotación de la base del disco de bloque. (F) Varita separadora. (G) Herramienta separadora de disco con dos flechas que muestran los ajustes altos y bajos. (H) Base de disco de bloque con cuatro bloques de Cu vacíos. (I) Tapa para el disco de bloque. (J) Contenedor de espuma con todas las herramientas necesarias para transferir soportes de muestras de bases de combipuck a bloques de cobre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> Figura 4: Sistema de transferencia criogénica. (A) Estación de muestra CTS con lanzadera conectada y los embudos utilizados para el llenado. (B) Un disco de bloque con dos bloques de transferencia colocados dentro del CTS. (C) Pantalla táctil del software de control CTS. Abreviatura: CTS = Sistema de transferencia criogénica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> Figura 5: Estación de muestra del sistema de transferencia criogénica. Abreviaturas: LEDs = diodos emisores de luz; LN2 = nitrógeno líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> Figura 6: Lanzadera del sistema de transferencia criogénica. Abreviaturas: LEDs = diodos emisores de luz; LN2 = nitrógeno líquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> Figura 7: Imágenes de difracción. A la izquierda, una imagen de difracción del conjunto de datos recopilado en el cristal de taumatina. A la derecha, un punto de difracción rodeado de píxeles de fondo de bajo conteo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> Figura 8: Solución estructural de Thaumatin con tubería automática CRANK2 (configuración predeterminada, sin refinamiento posterior). (A) Descripción general de la taumatina con mapa 2Fo-Fc a 1.6σ (azul) y diferencia anómala en fases Mapa de Fourier a 5σ calculado en ANODE (verde). (B) Visión general de la taumatina que muestra solo la diferencia anómala escalonada del mapa de Fourier en 5σ. (C) Vista en primer plano de un puente disulfuro presente en la taumatina con mapa 2Fo-Fc a 1,6σ (azul) y diferencia anómala escalonada mapa de Fourier a 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nombre</td>
			<td>Taumatina</td>
		</tr>
<tr>
<td>Longitud de onda de recogida de datos (Å) (energía (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Número de imágenes x tamaño de cuña (°)</td>
			<td>3600 x 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Grupo espacial</td>
			<td>
P 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Constantes de celda unitaria</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resolución (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Integridad</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicidad</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pendiente media</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Estadísticas de recopilación y procesamiento de datos para Thaumatin a una longitud de onda de 2.755 Å en la línea de haz I23, DLS. Para la resolución, la integridad, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) y la multiplicidad, los shells de alta resolución se muestran entre paréntesis. Abreviatura: DLS = Fuente de luz de diamante.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Átomo más cercano</td>
			<td>Altura máxima (sigma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>MET112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Diferencia anómala las alturas de pico del mapa de Fourier calculadas por ANODE utilizando el modelo por fases y construido automáticamente de CRANK2.

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Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Aquí, presentamos un protocolo para la preparación de muestras criogénicas y la transferencia de cristales a la estación final de vacío en la línea de haz I23 en Diamond Light Source, para experimentos de cristalografía de rayos X macromoleculares de longitud de onda larga.

Protocolo de preparación y transferencia de muestras para cristalografía de longitud de onda larga en vacío en Beamline I23 en Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

La cristalografía macromolecular de longitud de onda larga explota la señal anómala de los átomos de luz presentes de forma nativa en proteínas y ácidos nucleicos. Esta técnica se utiliza para resolver experimentalmente el problema de la cara cristalográfica y para determinar la identidad y la ubicación de estos elementos. Beamline I23 en Diamond Light Source es un instrumento de sincrotrón único optimizado para experimentos en longitudes de onda largas de hasta cinco angstrom.Permite acceder a los bordes de absorción de elementos de alta relevancia biológica, como calcio, potasio, cloro, azufre y fósforo. Debido a la absorción significativa de rayos X por el aire en el régimen de longitud de onda larga, estos experimentos se realizan en un entorno de vacío. Para mantener las muestras a temperaturas criogénicas dentro del entorno de vacío, los cristales se montan en soportes de muestra dedicados y térmicamente conductores.La transferencia de muestra criogénica del nitrógeno líquido a la estación final de vacío es muy similar a las técnicas utilizadas en la microscopía crioelectrónica. Este protocolo presenta el procedimiento para transferir cristales al entorno de vacío utilizando las herramientas y equipos desarrollados en Diamond Light Source. Comience separando la tapa de la base del CombiPuck de modo que los soportes de la muestra permanezcan unidos a la base y los viales se conserven en la tapa.Sumerja la tapa con viales en nitrógeno líquido, luego conecte un soporte de muestra y un adaptador a una varita magnética y recolecte los cristales. Enjuague cada muestra directamente en el CombiPuck, anotando la posición de la muestra. Para cerrar el disco, use una varita de disco para unir la base a la tapa.Transfiera el CombiPuck del nitrógeno líquido al cargador seco o al almacenamiento. Coloque la base del disco de bloque ya poblado con bloques de transferencia vacíos sobre su base de soporte en un recipiente de espuma, luego llene con nitrógeno líquido. Luego, coloque el CombiPuck en el recipiente de espuma lleno de nitrógeno líquido, asegurándose de que la base del disco esté asegurada al soporte magnético dentro del recipiente de espuma.Pre-enfríe todas las herramientas necesarias en nitrógeno líquido. Luego, separe la tapa de la base utilizando la herramienta separadora de discos en el ajuste alto, de modo que la base permanezca unida al soporte magnético, exponiendo los soportes de muestra dentro del nitrógeno líquido. Coloque la varita separadora sobre el soporte de la muestra y el adaptador lo más abajo posible, asegurándose de que la varita sea vertical.Mueva la pequeña palanca de la varita separadora hacia abajo con el pulgar hasta que haga clic para asegurar el soporte de la muestra en el interior y tire del soporte de la muestra del adaptador. Baje el separador sobre la posición deseada del bloque de transferencia, asegurándose de que una de las tres puntas quepa dentro del orificio central del bloque de transferencia. Suelte el soporte de muestra moviendo la palanca hacia arriba.Para cargar muestras en el siguiente bloque de transferencia, utilice la herramienta de llave de carrusel para girar un bloque de transferencia vacío en la posición horizontal. Una vez que se transfieran todos los soportes de muestra, cierre el disco de bloque colocando la tapa en nitrógeno líquido. Espere a que la temperatura se equilibre, y luego coloque la tapa sobre la base y levántela suavemente para liberarla del carrusel.Conecte el servicio de transporte a la estación. Abra las válvulas de gas nitrógeno y aire y asegúrese de que los gases fluyan. Luego, encienda el CTS.Enfríe tanto el baño como el transbordador con nitrógeno líquido. Coloque el embudo suministrado en el puerto de llenado del transbordador y vierta lentamente nitrógeno líquido en el embudo mientras monitorea el nivel en la pantalla. Deténgase cuando el indicador cambie de rojo a azul.Llene el baño con nitrógeno líquido usando el embudo. Transfiera un disco de bloque de nitrógeno líquido al baño CTS utilizando la herramienta separadora de disco adjunta. Retire la tapa del disco de bloque y cierre la tapa del baño CTS.Para introducir un bloque de transferencia en el transbordador, desbloquee el mango del transbordador girando 90 grados en el sentido de las agujas del reloj y avance hacia el baño para que la pista guiada en el mango haga cumplir el camino correcto de viaje. Una vez que la cubierta del bloque esté enfriada, avance el mango para introducir el bloque en el transbordador. Para bloquear el bloque de transferencia en el transbordador, gire el mango 180 grados en el sentido de las agujas del reloj.Retraiga el mango a la posición original de atrás y bloquéelo en su lugar girando 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj. Presione Cerrar la bomba de válvula de lanzadera en la pantalla de visualización para iniciar la evacuación de la lanzadera. Una vez que los mensajes Shuttle listo para mover y No mover la varilla, la válvula cerrada se muestran en la pantalla táctil, presione la palanca debajo de la lanzadera y levántela con cuidado usando el mango en la parte superior.Lleve el transbordador a la esclusa de aire en la estación de extremo de vacío en posición vertical y conéctelo. Seleccione una posición de bloque vacía dentro del recipiente presionando el botón correspondiente en la pantalla táctil y moviendo el hotel de muestra a la posición de carga correcta. Una vez que un hotel de muestra esté en posición, presione el botón Abrir para iniciar la secuencia de enclavamiento de vacío.Después de que se complete la secuencia y el estado cambie a Airlock abierto, bloquee en el transbordador, gire el mango 90 grados en el sentido de las agujas del reloj para desbloquear la varilla. Empuje suavemente la varilla hacia el recipiente para que la pista guiada haga cumplir el camino correcto de viaje hacia el hotel de muestra. Inserte lentamente el bloque de transferencia en el hotel utilizando la fuente de video que se muestra en la pantalla para obtener orientación, asegurándose de que el icono de posición del bloque en la pantalla táctil esté activado.Una vez activado, gire el mango 180 grados en sentido contrario a las agujas del reloj para liberar el bloque de transferencia y sacar la varilla del recipiente. Una vez que esté completamente retraído, gire el mango 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj para bloquear la varilla. Presione el botón Cerrar para cerrar la válvula de vacío de la estación final y ventilar el espacio entre el transbordador y el recipiente a la presión atmosférica.Retire la lanzadera cuando la pantalla de la esclusa de aire muestre el estado OK para separar. Devuelva el transbordador al baño CTS y presione Open Shuttle Valve para evacuar el transbordador antes de cargar el siguiente bloque de muestra. Una vez que el semáforo está en verde y aparece el mensaje OK to move rod, se puede introducir el siguiente bloque de transferencia en el transbordador.Para preparar el siguiente bloque de transferencia, gire el disco de bloque dentro del baño. Empuje la llave de rotación incorporada en la parte superior de la tapa de acrílico hacia abajo en la cerradura en el centro del disco de bloque. Mientras lo mantiene presionado, gire la llave para colocar el bloque de transferencia deseado en la posición de recogida.Una vez que se hayan transferido todos los bloques, asegúrese de que la válvula de transporte esté abierta, presione el botón Hornear en la pantalla táctil, seleccione Baño y Lanzadera y, a continuación, presione Iniciar hornear. La línea de haz de cristalografía macromolecular de longitud de onda larga I23 en Diamond Light Source puede acceder a los bordes de absorción de elementos de alta importancia biológica, como calcio, potasio, cloro, azufre y fósforo, dando una señal anómala mejorada que se puede utilizar para escalonar o localizar estos elementos dentro de macromoléculas. Los datos de difracción se recopilaron de un solo cristal de taumatina a una longitud de onda de 2,75 angstrom, elegido como un compromiso entre el aumento de la señal anómala y los efectos de absorción de muestras en longitudes de onda más largas.La configuración de vacío garantiza que solo los rayos X dispersos por la muestra lleguen al detector, proporcionando un fondo bajo alrededor de los reflejos de Bragg. El conjunto de datos produjo una señal anómala muy fuerte, facilitando la solución de la estructura mediante la tubería de fase automática CRANK2. La alta calidad del mapa de densidad de electrones resultante permitió la construcción automática exitosa del modelo, con la colocación correcta para el 100% de la secuencia de aminoácidos de la taumatina.Los 16 residuos de cisteína dentro de la taumatina forman ocho puentes disulfuro, que son claramente visibles en el mapa de densidad de electrones. Dado que la cristalografía de proteínas de longitud de onda larga en vacío es un campo nuevo, hemos desarrollado nuevas herramientas y equipos de manejo de muestras. Este protocolo guía a los usuarios en la transferencia segura de muestras a la estación final de vacío en la línea de haz I23 en Diamond Light Source.El entorno de vacío abre oportunidades únicas para realizar experimentos de difracción en un rango de longitud de onda no accesible en otras líneas de haz. La cristalografía de rayos X de longitud de onda larga permite la fase experimental de macromoléculas directamente a partir de cristales nativos. También permite la identificación inequívoca de iones unidos a las moléculas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Preparación y entrega de microcristales de proteínas en fase cúbica lipídico para la serie de femtosegundo Cristalografía

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Investigación

Bioquímica

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

Un soporte de muestra todo en uno para cristalografía de rayos X macromolecular con dispersión mínima de fondo

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Análisis de los datos de la SEC-SAXS a través de la desconvolución y dispersión de EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimización del crecimiento de cristales de endotiapepsina para experimentos de cristalografía en serie

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Cristalización y determinación estructural de una enzima: complejo de sustratos por cristalografía serie en un chip microfluídico versátil

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Recopilación de datos en serie de destino fijo en Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Flujo de trabajo y herramientas para la detección de fragmentos cristalográficos en el Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Una tubería de preparación de muestras para microcristales en vmXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Preparación de laminillas a partir de muestras biológicas vítreas utilizando un microscopio electrónico de barrido de doble haz para la criotomografía electrónica

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...