Name: sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

Vi vill tacka Adam Taylor, Adam Prescott, Ken Jones, Arvinder Palaha och Kevin Wilkinson för deras stöd i utvecklingen av Kryogent provöverföringssystem (CTS). Detta arbete finansierades av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansierat av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program.

1. Kristallskörd
OBS: Använd lämplig personlig skyddsutrustning: skyddsglasögon och handskar, om möjligt.
<ol><li>När SHs anländer till användarlabbet i kombihål (figur 3C), separera locket från basen av kombihålet så att SHs förblir fastsatta på basen och injektionsflaskan behålls i locket.</li>
	<li>Sänk ner locket med injektionsflaskan i flytande kväve. Fäst en SH + adapter (bild 3B, höger) på en magnetisk trollstav och skörda kristaller som vanligt.</li>
	<li>Blixtkyla varje prov direkt i kombihålet och notera provpositionen. För att stänga pucken, använd en puckstav för att fästa basen på locket.</li>
	<li>Överför kombipinen från flytande kväve till den torra avsändaren eller den flytande kvävelagringsdewar. Skicka den torra avsändaren till Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>2. Provöverföring till vakuum
<ol><li>Lastning av SH från combipuck till överföringsblocket<ol>
<li>Placera basen på blockpucken (figur 3H) som redan är fylld med tomma överföringsblock (figur 3D) på dess stödbas inuti det flytande kvävet i en skumbehållare (figur 3J-b). OBS: Överföringsblockens orientering är viktig för att provöverföringen ska vara korrekt inuti vakuumkärlet. Som sådan bör blocken placeras på block puckbasen och se till att stiftet markerat med en pil i figur 3D är till vänster om blocket.</li>
		<li>Placera injektionsflaskans puck i skumbehållaren fylld med flytande kväve och se till att puckens botten är fastsatt på magnethållaren inuti skumbehållaren (bild 3J-a).</li>
		<li>Förkyl alla nödvändiga verktyg i flytande kväve. Använd puckavskiljningsverktyget som visas i figur 3G på höginställningen H för att separera locket från basen, så att basen förblir fastsatt på magnethållaren och SHs exponeras inuti det flytande kvävet.</li>
		<li>För att avlägsna varje SH från sin adapter, använd separatorstaven (figur 3F) för att plocka upp SH från kombihålsbasen och placera i överföringsblockets lämpliga läge i karusellens horisontella läge i figur 3J-b.<ol>
<li>Placera separatorstaven över SH + adaptern så långt ner som den kan gå, se till att trollstaven är vertikal, för att undvika att röra provet.</li>
			<li>Flytta den lilla spaken på separatorns stav med tummen tills den klickar, för att säkra SH inuti och dra SH från adaptern.</li>
			<li>Sänk separatorn över önskat blockläge och se till att en av de tre spetsarna passar in i blockets centrala hål.</li>
			<li>Släpp SH genom att flytta upp spaken igen. Upprepa dessa steg för varje SH.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Om du vill ladda prover i nästa provblock använder du karusellnyckelverktyget (bild 3E) för att rotera ett tomt block i horisontellt läge.</li>
		<li>Fäst puckavskiljaren som visas i figur 3G med den låga inställningen L på blockpuckens lock genom att skruva medurs.</li>
		<li>När alla SHs har överförts, för att stänga blockpucken, placera locket i flytande kväve och vänta på att temperaturen ska balansera och montera sedan locket över basen som i figur 3I. Lyft försiktigt för att lossna från karusellen med separatorverktyget monterat.</li>
		<li>I detta skede kan blockpucken överföras till CTS (figur 4B) eller till en flytande kvävelagringsdewar.</li>
	</ol></li>
	<li>Lastning av överföringsblock i vakuumkärlet<ol><li>Se till att skytteln är ordentligt fastsatt på stationen. Öppna kvävegas- och luftventilerna och se till att gaser flödar. Slå på CTS.</li>
		<li>Om inga varningsmeddelanden syns på displayen, fortsätt med att kyla ner både badet och skytteln med flytande kväve. Placera den medföljande tratten i påfyllningsporten på skytteln och häll långsamt flytande kväve i tratten samtidigt som du övervakar nivån på skärmen. Stanna när indikatorn blir röd till blå. OBS: Skytteln är klar att användas när temperaturen på det kalla sätet som visas på pekskärmen är under 100 K. Provstationsbadet kan fyllas samtidigt med rätt tratt till den nivå som är markerad på badväggen eller 100% på den flytande kvävenivådisplayen. Flytande kvävenivåer och temperatursensorer bör övervakas kontinuerligt under hela drift. flera påfyllningar kommer att krävas.</li>
		<li>När temperaturen för skyttel kallsätet är under 100 K och flytande kvävenivåer på skytteln och badet stabiliseras, överför en blockpuck från flytande kväve till CTS-badet med hjälp av det bifogade puckavskiljningsverktyget. Ta bort locket på blockpucken och stäng locket på CTS-badet.</li>
		<li>För att föra in ett block i skytteln, öppna CTS-ventilen, om den inte redan är öppen, genom att trycka på knappen Open Shuttle Valve på displayen. Lås upp skyttelhandtaget genom att vrida 90° medurs och för det mot badet så att det guidade spåret på handtaget upprätthåller rätt färdväg mot badet. Låt locket svalna när blockskyddet är synligt inuti badet. När bubblan av flytande kväve runt locket har upphört, gå vidare till överföringsblocket.</li>
		<li>För att låsa överföringsblocket på skytteln, rotera handtaget 180° medurs.</li>
		<li>Dra tillbaka handtaget till det ursprungliga ryggläget och "Lås" det på plats genom att rotera 90° moturs.</li>
		<li>Tryck på Stäng shuttle valve & pump på skärmen för att starta shuttle evakuering.</li>
		<li>När meddelandet Shuttle är redo att lossna visas på pekskärmen trycker du på spaken under skytteln och lyfter den försiktigt med handtaget upptill.</li>
		<li>Bär skytteln till luftslussen på vakuumstationen i upprätt läge.</li>
		<li>Fäst skytteln på luftslussen på vakuumstationen. Obs: När pekskärmen på ändstationen är ordentligt fastsatt bekräftar skyttelns och förreglingens status.</li>
		<li>Välj en tom blockposition i kärlet genom att trycka på motsvarande knapp på pekskärmen och flytta provhotellet till rätt lastläge.</li>
		<li>När provhotellet är på plats aktiveras knappen Öppna . Tryck på den här knappen för att initiera vakuumförreglingssekvensen. OBS: Pumpen startar och förloppet visas på monitorn. Detta kan ta upp till två minuter att slutföra.</li>
		<li>När sekvensen är klar ändras statusen till Luftsluss öppen, överföring pågår. Vrid handtaget 90° medurs för att låsa upp stången och tryck försiktigt in stången i kärlet så att den guidade spåret igen upprätthåller rätt färdväg mot provhotellets läge. Använd videoflödet som visas på skärmen för vägledning och sätt långsamt in blocket i hotellet och se till att blocklägeslampan på pekskärmen aktiveras. När det är aktiverat roterar du handtaget 180° moturs för att släppa blocket och dra ut stången ur kärlet. När handtaget är helt infällt vrider du handtaget 90° moturs för att låsa stången.</li>
		<li>När stången är låst aktiveras knappen Stäng . Tryck på detta för att stänga slutstationens vakuumventil och ventilera utrymmet mellan skytteln och fartyget till atmosfärstryck, i väntan på upp till 20 s för slutförande.</li>
		<li>Vänta tills displayen visar status okej för att ta bort skytteln när sekvensen är klar. Ta nu bort skytteln och återgå till CTS för att upprepa processen för nästa block.</li>
		<li>För att förbereda nästa block för överföring, rotera block pucken inuti badet. Tryck ner den inbyggda rotationsknappen på toppen av akryllocket i låset i mitten av blockpucken. Vrid på nyckeln för att placera önskat block i upphämtningsläget medan du håller den nere.</li>
		<li>När alla block har överförts, se till att skyttelventilen är öppen medan den är monterad på CTS. Tryck på bakknappen på pekskärmen och välj både bad och skyttel och tryck sedan på bake. OBS: Detta värmer upp både skytteln och badet för att koka av det flytande kvävet och därefter avdunsta eventuell ackumulerad is/kondensation före nästa användning. När bakningen har startat kan gasen och luften stängas av.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+haemoglobin+-+IV.+Sign+determination+by+the+isomorphous+replacement+method.">The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287 (1954).</li><li>Hendrickson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anomalous+diffraction+in+crystallographic+phase+evaluation.">Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).</li><li>Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+heavy-atom+derivatization+of+protein+crystals.">An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).</li><li>Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selenomethionyl+proteins+produced+for+analysis+by+multiwavelength+anomalous+diffraction+(MAD):+A+vehicle+for+direct+determination+of+three-dimensional+structure.">Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure.</a> The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).</li><li>Liu, Q., Hendrickson, W. A., Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contemporary+use+of+anomalous+diffraction+in+biomolecular+structure+analysis.">Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis.</a> Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology. 1607, 377-399 (2017).</li><li>Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+SAD+is+maturing.">Native SAD is maturing.</a> IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).</li><li>Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+potassium+ions+for+ribosome+structure+and+function+revealed+by+long-wavelength+X-ray+diffraction.">Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction.</a> Nature Communications. 10 (1), 2519 (2019).</li><li>Rocchio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+dynamic,+partially+occupied+residues+using+anomalous+scattering.">Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).</li><li>Langan, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anomalous+X-ray+diffraction+studies+of+ion+transport+in+K++channels.">Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4540 (2018).</li><li>Lolicato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K2p+channel+C-type+gating+involves+asymmetric+selectivity+filter+order-disorder+transitions.">K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions.</a> Science Advances. 6 (44), (2020).</li><li>Thorn, A., Sheldrick, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANODE:+anomalous+and+heavy-atom+density+calculation.">ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation.</a> Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).</li><li>Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+metal-binding+sites+in+proteins+with+X-ray+crystallography.">Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).</li><li>Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+amino+acid+transport+by+the+CAT+family+of+SLC7+transporters.">Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters.</a> Nature Communications. 9 (1), 550 (2018).</li><li>Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vacuum+long-wavelength+macromolecular+crystallography.">In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).</li><li>Wernecke, J., Gollwitzer, C., M&#252;ller, P., Krumrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in-vacuum+PILATUS+1M+detector.">Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIALS:+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package.">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li><li>Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+tomographic+reconstruction+of+macromolecular+samples.">X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples.</a> Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).</li><li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+membrane+protein+crystal+using+ultraviolet+laser+irradiation.">Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).</li><li>Mykhaylyk, V., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+long-wavelength+protein+crystallography:+Keeping+a+protein+crystal+frozen+in+vacuum.">Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum.</a> Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010 (2013).</li><li>Snell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+sample+mounting+and+alignment+system+for+biological+crystallography+at+a+synchrotron+source.">Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source.</a> Structure. 12 (4), 537-545 (2004).</li><li>. The universal container project Available from: <a target="_blank" href="https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/">https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/</a> (2020)</li><li>Teng, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+freestanding+thin-film.">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).</li><li>Esposito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+glycosyltransferase+activity+of+the+salmonella+effector+SseK3.">Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).</li><li>O'Donnell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+architecture+of+EMC+reveals+a+path+for+membrane+protein+insertion.">The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion.</a> eLife. 9, 57887 (2020).</li><li>Mishra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+characterization+of+crimean-congo+hemorrhagic+fever+virus+GP38.">Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38.</a> Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).</li><li>Rudolf, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogen+sonic+hedgehog+inhibits+its+receptor+patched+by+a+pincer+grasp+mechanism.">The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism.</a> Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).</li><li>El Omari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pushing+the+limits+of+sulfur+sad+phasing:+De+novo+structure+solution+of+the+n-terminal+domain+of+the+ectodomain+of+hcv+e1.">Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).</li><li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIA2:+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction.">XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li><li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Buccaneer+software+for+automated+model+building.+1.+Tracing+protein+chains.">The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).</li><li>Skubak, P., Pannu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+protein+structure+solution+from+weak+X-ray+data.">Automatic protein structure solution from weak X-ray data.</a> Nature Communications. 4 (1), 2777 (2013).</li></ol>

Det nuvarande protokollet har utvecklats för att uppfylla kraven på provberedning för MX-experiment i vakuum med lång våglängd på strållinje I23. Den har använts på strållinjen under det senaste året och har bidragit till att flera projekt har slutförts framgångsrikt. Som framgår av resultaten som presenteras här möjliggör protokollet en säker och tillförlitlig överföring av prover till vakuumstationen samtidigt som deras diffraktionskvalitet bevaras. Det är en viktig aspekt för strållinjedriften och kommer att åtföljas av personlig användarutbildning av beamline-personal. Några av stegen är värda att lyftas fram som avgörande för ett framgångsrikt och säkert slutförande av förfarandet: överföring av prover från kombihålsbaser till provblock kräver noggrannhet och uppmärksamhet för att undvika skadliga prover (se steg 2.1.4). Övervakning av den flytande kvävenivån i alla led är viktig för att förhindra att prover exponeras för luft eller kommer i nära kontakt med delar som inte är ordentligt kylda (2.1.3 och 2.2.2). vänta tills stängningssekvensen (2.2.14) är helt klar innan du tar bort skytteln från ändstation (2.2.15), för att undvika nedbrytning av ändstationsvakuum.
Idén till protokollet inleddes tillsammans med en teknisk insats som syftade till att utveckla specialbyggd utrustning för överföring av proteinkristaller till vakuummiljön. De slutliga produkterna i detta projekt var CTS och tillhörande provhanteringsverktyg som beskrivs ovan. CTS är en betydande förbättring jämfört med föregångaren Leica EM VCT10014 och tar bort flera begränsningar, såsom bristen på provskärmning och vakuummiljö under överföring, isbildning inuti det flytande kvävebadet och avsaknaden av ett intuitivt användargränssnitt och säkerhetsfunktioner. Ytterligare funktioner i CTS som förbättrar användarupplevelsen är temperatur- och vätskekvävenivåövervakning inuti skyttel- och provstationen, ett badkar med större kapacitet som rymmer fyra kvarter samtidigt, snarare än ett, och en självstyrd mekanism för skytteloperationen. CTS är helt integrerat i strållinjestyrningssystemet med ett användarvänligt pekskärmsgränssnitt och förbättrad vakuum- och mekanisk säkerhet vid gränssnitt med endstationen.
Beamline I23 är det första MX-synkrotroninstrumentet med lång våglängd i sitt slag och som sådant introducerar proteinkristaller i en högvakuummiljö och lagrar dem vid kryogena temperaturer, har krävt betydande ansträngningar. Förbättringar av provberedningsverktygen och protokollen, samt insatser för att effektivisera processer, pågår. Som en del av användarsupporten finns strållinepersonal alltid tillgänglig för att hjälpa till med felsökning. Ett exempel på ett sådant scenario skulle vara problem som äventyrar vakuumsystemets integritet, vilket leder till svårigheter att fästa eller avlägsna skytteln till/från antingen CTS eller endstationsluftslussen. Olika testnivåer utförs varje vecka och dagligen, och användarutbildningen kommer att omfatta ytterligare kontroller för att undvika potentiella fel, som visuell inspektion av O-ringarna på gränssnitten som skytteln fäster vid. Medan vakuummiljön öppnar möjligheten att utföra diffraktionsexperiment i ett våglängdsområde som inte är tillgängligt vid andra strållinjer, minskar det ytterligare överföringssteget det totala provgenomströmningen.
Den manuella överföringen med endast fyra prover per överföringsblock och upp till fem block inuti vakuumkärlet begränsar den totala kapaciteten till 20 prover. För projekt med ett stort urval för att prova variabilitet bör prover därför förhandsgranskas vid Diamonds strålar med hög genomströmning, och då bör endast de mest lovande proverna överföras för det efterföljande optimerade långvåglängdsexperimentet. Även om provhållarna och överföringsblocken är oförändrade från den första introduktionen för några år sedan, är de hanteringsverktyg som presenteras här alla nya utvecklingar. De i23-hängivna provhållarna är oföränderliga på grund av sin roll i kylkonceptet för strållinjen. Som sådan syftade utformningen av provhanteringsverktygen till att skapa en länk mellan denna nya typ av hållare och standard kommersiellt tillgängliga verktyg som MX-användargemenskapen hade antagit under lång tid, såsom kombihål, kristallskördsstavar och transportsystemet för torravlastare. Deras design involverade betydande samråd med användargemenskapen och krävde flera iterationer för att slutföra. Utrustningen, verktygen och protokollet som presenteras här representerar ett enkelt och robust system för överföring av användarprover för experiment vid beamline I23 vid Diamond Light Source. Detta instrument för makromolekylär kristallografi i vakuum under lång våglängd öppnar nya möjligheter för strukturbiologi.

Långvågig röntgendiffraktion används för att utnyttja de avvikande spridningsegenskaperna hos specifika ljusatomer som finns i makromolekyler. Detta hjälper till att lösa problemet med den kristallografiska fasen och att otvetydigt bekräfta identiteten och platsen för sådana element inom makromolekyler. Medan de novo-strukturer i början av makromolekylär kristallografi löstes genom flera isomorfa ersättningar1, med tillkomsten av tunable röntgenstrålningsstrålar vid synkrotroner, experimentell fasning baserad på multivåglängd och envåglängd (SAD) avvikande diffraktionstekniker har blivit de dominerande metoderna2 . Båda metoderna har historiskt förlitat sig på den isomorfa eller avvikande signalen från tungmetaller, som måste introduceras artificiellt i kristallerna genom samkristallisering eller kristall blötläggning3. Trial-and-error-metoden och oförutsägbara resultatet kan göra dessa experiment frustrerande tidskrävande. Införlivandet av seleno-metionin under proteinuttryck4 är ett mycket elegant sätt att övervinna dessa begränsningar och utnyttja avvikande diffraktion vid korta våglängder, även om det kan vara mycket utmanande i eukaryota proteinuttryckssystem.
MX med lång våglängd är extremt tilltalande för strukturbestämning genom inhemska SAD-experiment5,6 på grund av bekvämligheten med att använda kristaller direkt från en framgångsrik kristalliseringsstudie utan ytterligare behandling. Dessutom öppnar tillgång till absorptionskanterna för element av hög biologisk betydelse, såsom kalcium, kalium, klor, svavel och fosfor, möjligheten att direkt identifiera positionerna för dessa element i makromolekyler7,8,9,10. Vid medelhög och låg upplösning kan elementtilldelning baserad på 2Fo-Fc elektrontäthet och kemisk miljö vara svårt, särskilt för element med liknande antal elektroner eller svagt bundna joner med partiell beläggning. Dessa tvetydigheter kan lösas genom att samla in data under och över absorptionskanten för intresseelementet och tolkningen av den resulterande modellfasade avvikande skillnaden Fourier maps11,12. Att lokalisera svavelatomerpositioner i dessa kartor kan också hjälpa modellbyggande till lågupplösta elektrontäthetskartor13. Absorptionskanterna för dessa ljuselement observeras vid våglängder mellan λ = 3 och 6 Å (se figur 1, överst). Detta våglängdsområde har varit långt bortom kapaciteten hos någon synkrotron MX-strållinje, och effektiv drift i detta intervall kräver att man övervinner flera tekniska utmaningar, som beskrivs nedan.
Beamline I23 på Diamond Light Source, Storbritannien, är ett unikt instrument, speciellt utformat för att underlätta MX-experiment med lång våglängd, tunable i ett våglängdsområde mellan λ = 1,13 och 5,9 Å (energiområde mellan E = 2,1 och 11 keV). Genom att verka i en miljö med hög vakuum14 elimineras luftabsorption och spridning, vilket ökar effektiviteten hos diffraktionsexperiment och signal-till-brus-förhållandet. En stor vakuumändstation omsluter alla komponenter i provmiljön, inklusive den halvcylindriska Pilatus 12M-detektorn, en fleraxlig goniometer, online-visnings- och kollideringssystemen samt skräddarsydd utrustning för överföring och lagring av prover (figur 2). Varje utrustning har optimerats för att säkerställa att data av lång våglängd av bästa kvalitet kan samlas in. Den böjda Pilatus 12M-detektorn kan samla in till diffraktionsvinklar på 2θ = ±100°, vilket resulterar i tillräckligt högupplösta diffraktionsdata även vid längsta våglängder (figur 1, botten). De 120 detektormodulerna har valts specifikt för lågenergikompatibilitet och kalibreringar för ett extra ultrahögt förstärkningsläge har tillhandahållits.
Lägsta möjliga detektortröskel är 1,8 keV, vilket leder till ökade hörn- och kanteffekter för energier som är lägre än 3,6 keV och komprometterad datakvalitet vid de längsta våglängderna, särskilt för kristaller med låg mosaik, kan observeras. Denna effekt i kombination med minskningen av detektorns kvanteffektivitet15 måste beaktas vid planeringen av ett experiment. Den fleraxliga goniometern möjliggör omorientering av kristaller för att möjliggöra datainsamlingsstrategier som maximerar kvaliteten och styrkan hos den avvikande signalen, liksom fullständigheten hos de avvikande data som samlas in. Provabsorption är en begränsande faktor för experimenten, särskilt vid längsta våglängder. Absorptionskorrigeringar, som implementeras i vanliga MX-bearbetningsprogrampaket16,17, fungerar bra till våglängder runt 3 Å. Längre våglängder kommer att kräva analytiska absorptionskorrigeringar baserade på tomografiska rekonstruktioner18 eller laserablation för att avlägsna icke-diffracting material och skära kristallerna i väldefinierade former19. Den senare kommer också att bidra till att minska storleken på större kristaller eftersom röntgendiffraktionsexperiment vid längre våglängder är effektivare för mindre kristaller14. Utmaningen att hålla prover vid kryogena temperaturer under datainsamlingen hanteras genom ledande kylning, eftersom användning av kallgasströmsanordningar med öppet flöde inte är kompatibelt med en vakuummiljö. Därför behövs termiskt ledande material, såsom koppar, för att ansluta provet till en pulsrör cryocooler. De spine-standardstift i rostfritt stål som används i hela MX, liksom alla andra kommersiellt tillgängliga provfästen, är inte lämpliga för MX i vakuum med lång våglängd på grund av deras dåliga värmeledningsförmåga.
Provhållarna för MX i vakuum skall vara en väsentlig del av värmeavskigningsvägen (figur 3A). Som sådan består de av en termiskt ledande kopparkropp och stift och innehåller två viktiga funktioner: en stark magnetbas för att säkerställa en adekvat termisk länk till kall goniometerhuvudet och ett provfäste, tillverkat av polyimid, för att minimera röntgenabsorption och spridning20. Ansträngningar gjordes för att säkerställa att användarupplevelsen av kristallskörd och blixtkylning är nästan identisk med den som är förknippad med vanliga MX-metoder. Eftersom de dedikerade I23 SHs inte är direkt kompatibla med andra synkrotronbalkar används en adapter i rostfritt stål för kompatibilitet med kristallskördande magnetiska trollstavar och befintliga goniometergränssnitt på andra MX-strållinjer (figur 3B). Adaptern är också viktig för att använda automationsanläggningarna på andra Diamond MX-strållinjer, som är baserade på ALS-typ robotgriphuvuden21 och unipuck-stil baslayouter22, om provvariation kräver snabb förscreening för val av de bästa diffracting kristallerna. Provtagnings- och inläsningsprotokollet kan delas upp i två steg:
Steg 1: Skörd av kristaller och blixtfrysning som utförs av användare i sina egna laboratorier
Efter bedömning av projektets lämplighet för I23-datainsamling skickas provhållare med slingor som matchar kristallstorlekarna (förmonterade med adaptrar) till användarlaboratorier för kristallskörd. För att förhindra skador bör SHs och adaptrar inte separeras och ska användas som en enhet för fiskekristaller med öglor av lämplig storlek med hjälp av vanliga magnetiska trollstavar av kristallskörd. Som är vanligt i MX utförs denna uppgift manuellt under mikroskopet, och kristaller blixtkyls omedelbart i en skumdewar med flytande kväve23. På grund av en missmatchning av magnetiska krafter är SHs för närvarande inte kompatibla med unipucks. Lagring och frakt realiseras med hjälp av kombihål (se tabellen över material), som är tillgängliga för användare på begäran, tillsammans med de kompatibla torravlastarinsatserna (bild 3C). Dessa puckar delar samma basplatta med de allmänt använda unipucksna och möjliggör snabb förkontroll av prover vid andra Diamond MX-strållinjer. Att låna ut denna utrustning till användare är för närvarande det bästa arrangemanget, tills de skräddarsydda provinnehavarna är kommersiellt tillgängliga. Transport till strållinjen kräver de vanliga torravsändare som används i MX-samhället.
Steg 2: Överföring av kryokylda prover till vakuumstationen
När proverna anländer till strållinjen förbereds de för överföring till vakuumstationen. Detta innebär avlägsnande av SHs från kombihål och separation från adaptrar. Införandet av biologiska prover till vakuum utförs rutinmässigt inom kryoelektronmikroskopi. Några av de väletablerade koncepten anpassades för I23-provöverföringen. Kort sagt överförs SHs under flytande kväve till överföringsblock (figur 3D). Dessa block har utmärkt värmeledningsförmåga och en betydande termisk massa, vilket hindrar kristallerna från att nå glasövergångstemperaturen när de är i vakuum. Upp till fyra block, med en kapacitet på fyra prover vardera, lastas under flytande kväve i en blockpuck (figur 3H), som används antingen för överföring av prover till Kryogena överföringssystemet (CTS) eller för lagring i flytande kvävekrig mellan experiment.
Cryogenic Transfer System som utvecklats vid Diamond Light Source består av två underenheter, provstationen och skytteln (figur 4A). Provstationen består av ett flytande kvävebad för tillfällig lagring av proteinkristaller och har särskilda egenskaper för att garantera säkerheten och möjliggöra en användarvänlig upplevelse (figur 5). CTS styrs av en programmerbar logikstyrenhet via ett användarvänligt pekskärmsgränssnitt. Provstationen har lysdioder inbyggda för bättre visualisering och en uppsättning värmare som styrs i närbild för att automatisera torkningen av det flytande kvävebadet när proverna har överförts. Den har också en mängd olika sensorer för att säkerställa säkerhet och effektiv funktion av systemet. Provstationen har skräddarsydd hårdvara för att tillhandahålla ett tillförlitligt elektriskt gränssnitt för att interagera med skytteln för drift, såsom att pumpa ner till grovt vakuum för provöverföring, samt övervakning av flytande kvävenivåer och temperaturen inuti skytteln.
Shuttle (figur 6) är en bärbar enhet som används för att plocka upp ett överföringsblock från provstationens flytande kvävebad och överföra det i en kryogen och vakuummiljö till slutstationen. Den innehåller en flytande kvävedewar för att hålla proverna kalla under överföring, vätskenivåövervakning i dewar och en mängd olika sensorer för drift och användarsäkerhet. Överföringsarmen är utrustad med en magnetdrivning och innehåller bearbetade spår för att vägleda användare i säkert lastning och lossning av överföringsblock till ändstationen. Överföring från skytteln till vakuumkärlet sker via en luftsluss. Luftslussen är ett gränssnitt för skytteln på ändstationen som används för att evakuera utrymmet mellan skytteln och ändstationen, innan du öppnar pendel- och endstationsvakuumventilerna. Pump- och ventilationssekvenserna är helt automatiserade och kan styras via en stor pekskärm med ett användarvänligt gränssnitt (bild 4C). Det aktuella protokollet används för att överföra en thaumatinkristall till vakuumstationen för datainsamling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12M detector</td>
			<td>Dectris, Switzerland</td>
			<td></td>
			<td>single-photon-counting X-ray detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CombiPuck</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-P1</td>
			<td>Cryopucks used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal-harvesting magnetic wand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td>Used for harvesting crystal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Shipper (CX100)</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-21</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry shipper insert (CombiPuck Transport Cane)</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>SKU: M-CBP-PTC1</td>
			<td>Used for cryogenic storage and transport of I23 samples holders and samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton polyimide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>sample mount made of Kapton polyimide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perpsex lid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>acrylic lid with built-in rotation key</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin powder</td>
			<td>&#160;Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Used for production of thaumatin crystals by vapour diffusion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and transfer protocol for in-vacuum long-wavelength crystallography on beamline i23 at diamond light source

Makromolekylär kristallografi med lång våglängd (MX) utnyttjar de avvikande spridningsegenskaperna hos element, såsom svavel, fosfor, kalium, klor eller kalcium, som ofta förekommer i makromolekyler. Detta möjliggör en direkt strukturlösning av proteiner och nukleinsyror genom experimentell infasning utan behov av ytterligare märkning. För att eliminera den betydande luftabsorptionen av röntgenstrålar i denna våglängdsregim utförs dessa experiment i en vakuummiljö. Beamline I23 på Diamond Light Source, Storbritannien, är det första synkrotroninstrumentet i sitt slag, designat och optimerat för MX-experiment i det långa våglängdsområdet mot 5 Å. 
För att göra detta möjligt omsluter ett stort vakuumkärl alla ändstationskomponenter i provmiljön. Behovet av att hålla prover vid kryogena temperaturer under lagring och datainsamling i vakuum kräver användning av termiskt ledande provhållare. Detta underlättar effektiv värmeborttagning för att säkerställa provkylning till cirka 50 K. I det nuvarande protokollet beskrivs de förfaranden som används för provberedning och överföring av prover till vakuum på strållinje I23. För att säkerställa enhetlighet i praxis och metoder som redan fastställts inom makromolekylär kristallografigemenskapen kan provkylning till flytande kvävetemperatur utföras i alla laboratorieregioner utrustade med standard MX-verktyg. 
Kryogen lagring och transport av prover kräver endast standard kommersiellt tillgänglig utrustning. Specialiserad utrustning krävs för överföring av kryogeniskt kylda kristaller från flytande kväve till vakuumstationen. Skräddarsydda provhanteringsverktyg och ett dedikerat kryogent överföringssystem (CTS) har utvecklats internt. Uppgifter om uppgift som samlats in på prover som utarbetats med hjälp av detta protokoll visar utmärkt sammanslagningsstatistik som visar att provernas kvalitet inte är oförändrad under förfarandet. Detta öppnar unika möjligheter för in-vacuum MX i ett våglängdsområde utöver vanliga synkrotronbalklinjer.

En thaumatin kristall introducerades till vakuumstationen med hjälp av protokollet som beskrivs ovan. Diffraktionsdata samlades in vid en våglängd på 2,7552 Å (E = 4500 eV) som 3600 bilder med en rotationsökning på 0,1° och 0,1 s exponering per bild. Strålstorleken justerades till 150 μm x 150 μm och reducerades till 10% överföring, med en motsvarande flödesmätning på 7,1 x 109 fotoner/s. Valet av λ = 2,7552 Å bygger på en kompromiss mellan ökningen av avvikande signal- och provabsorptionseffekter och minskningen av upplösningen till längre våglängder. Även om det inte är i närheten av svavelets teoretiska absorptionskant (λ= 5,0095 Å), är det imaginära bidraget till svavel f: s spridningsfaktor 1,57 e- , en faktor på 1,6-2,1 större jämfört med våglängder mellan 1,7 och 2 Å. De resulterande starkare avvikande signalerna möjliggör framgångsrik S-SAD-fasning för mer utmanande projekt.
En mängd svåra fasningsexperiment har redan utförts på strållinjen I2324,25,26,27, med data som samlats in vid denna våglängd. Även om infasning av S-SAD är möjlig med mycket kortare våglängder, kräver detta ofta att man bygger upp avvikande signal genom att slå samman data från många isomorfa kristaller för att nå multiplicitetsvärden under 10028. På grund av den förbättrade avvikande signalen vid längre våglängder krävde de flesta fasningsprojekt som löstes på I23 endast data från en kristall. En representativ diffraktionsbild visas i figur 7, vänster. Databehandling med hjälp av Xia2-3dii29 gav utmärkt sammanslagningsstatistik enligt tabell 1. Figur 7, till höger, visar en del av en representativ diffraktionsbild från datauppsättningen thaumatin och illustrerar den låga bakgrunden kring Bragg-reflektionerna, vilket bidrar till de stora I/σ(I) värden som vanligtvis observeras i vakuuminställningen, vilket säkerställer att endast röntgenstrålar som sprids av provet når detektorn.
Den maximala uppnåeliga upplösningen på 1,8 Å beror på detektorgeometrin och röntgenstrålningens valda våglängd. Data uppsättningen gav mycket stark avvikande signal, återspeglas i mitten av lutningen av avvikande normal sannolikhetsparameter på 2,677, vilket underlättar strukturlösningen genom den automatiska fasningsledningen CRANK2. Den höga kvaliteten på den resulterande elektrontäthetskartan möjliggjorde framgångsrik automatisk modellbyggnad av Buccaneer30-modulen inom CRANK231, med korrekt placering för 100% av aminosyrasekvensen av thaumatin. Den fasade avvikande skillnaden Fourier-kartan, beräknad med ANODE11, avslöjar 16 mycket välordnade svavelatomer och en svavelatom från Cys159 med två alternativa konformationer, vilket bekräftas av topparnas 18 signifikanta höjder vid positionerna för de avvikande spridarna i tabell 2. De 16 cysteinresterna inom thaumatin bildar 8 disulfidbroar, som alla är tydligt synliga på 2Fo-Fc-kartan (figur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg"> Bild 1: Högupplösta diffraktionsdata från MX-experiment med lång våglängd. A) Diagram över f-värden mot energi, med angivande av absorptionskanter för ljuselement som är åtkomliga på strållinjen I23. B) Maximal upplösning som kan uppnås i hörnen på P12M-detektorn mot energi. Förkortning: MX = makromolekylär kristallografi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg"> Bild 2: Horisontell sektion genom vakuumkärlet med alla komponenter på ändstationen. Förkortning: OAV = visningssystem på axeln. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg"> Bild 3: Provhanteringsverktyg. (A) I23 Provhållare. (B) MX ryggstandardstift (vänster) bredvid en I23-provhållare med adapter (höger). C) Kombilock och botten med I23-provhållare (blå). Blockera pucklock och bas med två transferblock (guld). En torr avlastarkäpp, kompatibel med både kombinpucks och blockpuckar, är synlig bak. D) Överföringsblock med fyra I23-provhållare. (E) Nyckelverktyg som används för rotation av blockpuckbasen. (F) Separator trollstav. (G) Puckavskiljareverktyg med två pilar som visar de höga och låga inställningarna. (H) Blockera puckbasen med fyra tomma Cu-block. (I) Lock till blockpucken. J) Skumbehållare med alla nödvändiga verktyg för överföring av provhållare från kombihålsbaser till kopparblock. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg"> Figur 4: Kryogent överföringssystem. A) CTS Provstation med fastsatt skyttel och de trattar som används för påfyllning. (B) En blockpuck med två överföringsblock placerade inuti CTS. (C) CTS-styrprogramvaran. Förkortning: CTS = Kryogent överföringssystem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg"> Bild 5: Provstation för kryogen överföringssystem. Förkortningar: LYSDIODER = lysdioder; LN2 = flytande kväve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg"> Figur 6: Kryogen överföringssystem Shuttle. Förkortningar: LYSDIODER = lysdioder; LN2 = flytande kväve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg"> Bild 7: Diffraktionsbilder. Vänster, en diffraktionsbild från datauppsättningen som samlats in på thaumatinkristallen. Höger, en diffraktionspunkt omgiven av bakgrundspixlar med lågt antal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg"> Figur 8: Strukturlösning av Thaumatin med automatisk rörledning CRANK2 (standardinställningar, ingen efterföljande förfining). (A) Översikt över thaumatin med 2Fo-Fc-karta vid 1,6σ (blå) och fasad avvikande skillnad Fourier karta vid 5σ beräknat i ANODE (grön). (B) Översikt över thaumatin som endast visar den fasade avvikande skillnaden Fourier karta vid 5σ. (C) Närbild av en disulfidbro som finns i thaumatin med 2Fo-Fc karta på 1,6σ (blå) och fasad avvikande skillnad Fourier karta vid 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Namn</td>
			<td>Thaumatin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Våglängd för datainsamling (Å) (energi (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Antal bilder x kilstorlek (°)</td>
			<td>3600 × 0,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rymdgrupp</td>
			<td>
S 41212</td>
		</tr>
<tr>
<td>Enhetscellskonstanter</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>Resolution (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fullständighet</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rmeas</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
<tr>
<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Multiplicitet</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mittbacke</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Datainsamlings- och behandlingsstatistik för Thaumatin vid 2.755 Å våglängd vid strållinje I23, DLS. För upplösning, fullständighet, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) och multiplicitet visas högupplösta skal inom parentes. Förkortning: DLS = Diamond Light Source.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Närmaste atom</td>
			<td>Topphöjd (sigma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>MET112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
<tr>
<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Avvikande skillnad Fourier karttoppar enligt ANODE:s fasade och automatiskt byggda modell från CRANK2.

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source at JoVE.com

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Här presenterar vi ett protokoll för kryogen provberedning och överföring av kristaller till vakuumstationen på beamline I23 vid Diamond Light Source, för makromolekylära röntgenkristallografiexperiment med lång våglängd.

Provberednings- och överföringsprotokoll för in-vacuum långvågig kristallografi på Beamline I23 vid Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Makromolekylär kristallografi med lång våglängd utnyttjar den avvikande signalen från ljusatomer som finns i proteiner och nukleinsyror. Denna teknik används för att experimentellt lösa det kristallografiska ansiktsproblemet och för att bestämma identiteten och platsen för dessa element. Beamline I23 på Diamond Light Source är ett unikt synkrotroninstrument optimerat för experiment vid långa våglängder upp till fem angstrom.Det ger tillgång till absorptionskanterna av element av hög biologisk relevans, såsom kalcium, kalium, klor, svavel och fosfor. På grund av den betydande absorptionen av röntgenstrålar med luft i långvåglängdsregimen utförs dessa experiment i en vakuummiljö. För att hålla proverna vid kryogena temperaturer i vakuummiljön monteras kristallerna på dedikerade, termiskt ledande provhållare.Den kryogena provöverföringen från flytande kväve till vakuumstationen är mycket lik de tekniker som används i kryoelektronmikroskopi. Detta protokoll presenterar proceduren för överföring av kristaller till vakuummiljön med hjälp av de verktyg och utrustning som utvecklats vid Diamond Light Source. Börja med att separera locket från CombiPucks botten så att provhållarna förblir fästa vid basen och flaskorna behålls i locket.Sänk ned locket med injektionsflaska i flytande kväve, fäst sedan en provhållare och adapter på en magnetisk trollstav och skörda kristallerna. Spola ner varje prov direkt i CombiPuck och notera provpositionen. För att stänga pucken, använd en puckstav för att fästa basen på locket.Överför CombiPuck från flytande kväve till den torra avsändaren eller förvaringen. Placera basen på blockpucken som redan är fylld med tomma överföringsblock på stödbasen i en skumbehållare och fyll sedan med flytande kväve. Placera sedan CombiPuck i skumbehållaren fylld med flytande kväve och se till att puckens botten är fastsatt på magnethållaren inuti skumbehållaren.Förkyl alla nödvändiga verktyg i flytande kväve. Separera sedan locket från basen med hjälp av puckavskiljaren på den höga inställningen, så att basen förblir fastsatt på magnethållaren och exponerar provhållarna inuti flytande kväve. Placera separatorstaven över provhållaren och adaptern så långt ner det går, och se till att trollstaven är vertikal.Flytta den lilla spaken på separatorstaven nedåt med tummen tills den klickar för att fästa provhållaren inuti och dra provhållaren från adaptern. Sänk separatorn över önskat överföringsblocksläge och se till att en av de tre spetsarna passar in i överföringsblockets centrala hål. Släpp provhållaren genom att flytta upp spaken igen.Om du vill ladda prover i nästa överföringsblock använder du karusellnyckelverktyget för att rotera ett tomt överföringsblock till horisontellt läge. När alla provhållare har överförts stänger du blockpucken genom att placera locket i flytande kväve. Vänta tills temperaturen balanserar och montera sedan locket över basen och lyft försiktigt för att släppa från karusellen.Fäst skytteln på stationen. Öppna kvävegas- och luftventilerna och se till att gaser flödar. Slå sedan på CTS.Kyl både badet och skytteln med flytande kväve. Placera den medföljande tratten i påfyllningsporten på skytteln och häll långsamt flytande kväve i tratten samtidigt som du övervakar nivån på skärmen. Stanna när indikatorn blir röd till blå.Fyll badet med flytande kväve med tratten. Överför en blockpuck från flytande kväve till CTS-badet med hjälp av det bifogade puckavskiljningsverktyget. Ta bort locket på blockpucken och stäng locket på CTS-badet.För att införa ett överföringsblock i skytteln låser du upp skyttelhandtaget genom att rotera 90 grader medurs och för det mot badet så att det guidade spåret på handtaget upprätthåller rätt färdväg. När blockskyddet har svalnat, för handtaget framåt för att föra in blocket i skytteln. För att låsa överföringsblocket på skytteln, rotera handtaget 180 grader medurs.Dra tillbaka handtaget till det ursprungliga ryggläget och lås det på plats genom att rotera 90 grader moturs. Tryck på Stäng shuttle valve pump på skärmen för att starta shuttle evakuering. När meddelandena Shuttle är redo att röra sig och flytta inte stången, ventilen stängd visas på pekskärmen, tryck på spaken under skytteln och lyft den försiktigt med handtaget upptill.Bär skytteln till luftslussen på vakuumstationen i upprätt läge och fäst den. Välj en tom blockposition i kärlet genom att trycka på motsvarande knapp på pekskärmen och flytta provhotellet till rätt lastläge. När ett provhotell är på plats trycker du på knappen Öppna för att initiera vakuumförreglingssekvensen.När sekvensen är klar och statusen ändras till Luftsluss öppen, blockera i skyttel, vrid handtaget 90 grader medurs för att låsa upp stången. Tryck försiktigt in stången i kärlet så att den styrda banan upprätthåller rätt färdväg mot provhotellet. Sätt långsamt in överföringsblocket i hotellet med hjälp av videoflödet som visas på skärmen för vägledning, så att blockpositionsikonen på pekskärmen aktiveras.När det är aktiverat roterar du handtaget 180 grader moturs för att frigöra överföringsblocket och dra ut stången ur kärlet. När handtaget är helt indraget vrider du handtaget 90 grader moturs för att låsa stången. Tryck på stäng-knappen för att stänga vakuumventilen för slutstationen och ventilera utrymmet mellan skytteln och fartyget till atmosfärstryck.Ta bort skytteln när luftslussdisplayen visar status ok för att lossa. Returnera skytteln till CTS-badet och tryck på Open Shuttle Valve för att evakuera skytteln innan du laddar nästa provblock. När trafikljuset är grönt och meddelandet OK att flytta stång visas, kan nästa överföringsblock introduceras till skytteln.För att förbereda nästa överföringsblock, rotera blockpucken inuti badet. Tryck ner den inbyggda rotationsknappen på toppen av akryllocket i låset i mitten av blockpucken. Medan du håller den nere vrider du på nyckeln för att placera önskat överföringsblock i upphämtningspositionen.När alla block har överförts, se till att skyttelventilen är öppen, tryck på Bake-knappen på pekskärmen, välj både Bath och Shuttle och tryck sedan på Start Bake. Den makromolekylära kristallografistrålen med lång våglängd vid Diamond Light Source kan komma åt absorptionskanterna hos element av hög biologisk betydelse, såsom kalcium, kalium, klor, svavel och fosfor, vilket ger förbättrad avvikande signal som kan användas för att fasa eller lokalisera dessa element inom makromolekyler. Diffraktionsdata samlades in från en enda thaumatin kristall vid våglängd 2,75 angstrom, valt som en kompromiss mellan ökad avvikande signal och prov absorption effekter vid längre våglängder.Vakuuminställningen säkerställer att endast röntgenstrålar som sprids av provet når detektorn, vilket ger låg bakgrund runt Bragg-reflektionerna. Data uppsättningen gav mycket stark avvikande signal, vilket underlättade strukturlösningen genom den automatiska fasningspipelinen CRANK2. Den höga kvaliteten på den resulterande elektrontäthetskartan möjliggjorde framgångsrik automatisk modellbyggnad, med korrekt placering för 100% av aminosyrasekvensen av thaumatin.De 16 cysteinresterna inom thaumatin bildar åtta disulfidbroar, som alla är tydligt synliga i elektrontäthetskartan. Eftersom proteinkristallografi i vakuum med lång våglängd är ett nytt område har vi utvecklat nya verktyg och utrustning för provhantering. Detta protokoll vägleder användare i att säkert överföra prover till vakuumstationen på beamline I23 vid Diamond Light Source.Vakuummiljön öppnar unika möjligheter att utföra diffraktionsexperiment i ett våglängdsområde som inte är tillgängligt vid andra strållinjer. Långvågig röntgenkristallografi möjliggör experimentell infasning av makromolekyler direkt från inhemska kristaller. Det möjliggör också otvetydig identifiering av joner som är bundna till molekylerna.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Beredning och leverans av protein mikrokristaller i lipida kubiska fasen för Serial Femtosecond Kristallografi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biokemiska och strukturell karaktärisering av den kolhydrat Transport substrat-bindande-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

En allt-i-ett-provhållare för makro molekyl ära röntgenkristallografi med minimal bakgrunds spridning

Macromolecular X-ray crystallography (MX) is the most prominent method to obtain high-resolution three-dimensional knowledge of biological macromolecules. ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Analys av SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution och Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimera tillväxten av endotiapepsinkristaller för seriella kristallografiexperiment

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisering och strukturell bestämning av ett enzym:Substratkomplex genom seriell kristallografi i ett mångsidigt mikrofluidiskt chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Arbetsflöde och verktyg för kristallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En provförberedande pipeline för mikrokritaler vid VMXm Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Förbereda lameller från glaskroppsbiologiska prover med hjälp av ett dubbelstråleskanningselektronmikroskop för kryoelektrontomografi

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...