Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال جائزة المحقق الجديد لصندوق كونوت ل S.P. ، المؤسسة الكندية للابتكار ، برنامج منح اكتشاف NSERC (المنح RGPIN-2015-05114 و RGPIN-2020-05881) ، صندوق الأبحاث المشتركة لجامعة مانشستر وجامعة تورنتو ، وبرنامج جامعة تورونتو XSeed.

1. البذر الخلية
ملاحظة: تم تنفيذ بروتوكول نشر الخلية الموصوف باستخدام الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFs) التعبير PH-Akt-GFP (علامة الفلورسنت لبرنامج تطبيق السلام3/PI(3,4)P2). تم إنشاء خط الخلية هذا عن طريق دمج بناء تعبير عن PH-Akt-GFP (أدجين #21218) من خلال تحرير الجينات بوساطة CRISP...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

يسمح المقايسة المنتشرة للخلية الموصوفة بالتتبع المستمر للتغيرات المورفولوجية(على سبيل المثال ، حجم الخلية وشكلها) وحركات حافة الخلية(أي سرعة النتوء وتردد التراجع) ، وهي ميزات مفقودة في معظم بروتوكولات انتشار الخلايا19،24. في حين أن شائعة الاستخدا?...

نتوءات لاميليبوديال هي هياكل هيكلية خلوية بارزة تشكلت في الجزء الأمامي من الخلية المهاجرة. في lamellipodia، البلمرة من أكتين بمساعدة مجمع Arp2/3 وفورمين يخلق شبكة أكتين المتفرعة سريعة النمو التي تدفع ضد غشاء البلازما1،2. دفع القوة التي ولدتها شبكة actin يدفع جسديا الخلية إلى الأمام1،3،4،5. استنفاد Arp2/3 معقدة أو تعطيل مسارات الإشارات الضرورية لproprorusions lamellipodial غالبا ما يضعف هجرة الخلايا6، 7. علىالرغممن أن هجرة الخلايا اللاميلبوديا ناقصة كما تم الإبلاغ عن 8,9, أهمية lamellipodia في هجرة الخلايا واضح كما استنفاد هذا الهيكل النتوءي يبخل قدرة الخلية على التحرك من خلال البيئات الدقيقة البيولوجية المعقدة6,10.
عائق رئيسي لفهم تنظيم lamellipodia في الخلايا المهاجرة هو التغير الطبيعي في الحركية نتوء lamellipodial، وحجم، وشكل11،12،13،14. وعلاوة على ذلك، أظهرت الدراسات الحديثة أن lamellipodia يحمل السلوكيات النتوءية المعقدة، بما في ذلك النتوءات المتقلبة والدورية والمتسارعة14،15. بالمقارنة مع lamellipodia متغير للغاية من الخلايا المهاجرة6،16، lamellipodia شكلت خلال انتشار الخلية هي أكثر اتساقا12. منذ النشاط النتوءي للخلايا المنتشرة والمهاجرة مدفوعة بتجميعات الجزيئات الكلية المتطابقة ، والتي تشمل شبكة أكتين متفرعة ، وحزم أكتوميوسين انقباضية ، والتصاقات مصفوفة الخلايا القائمة على integrin17،18، فقد تم استخدام خلايا الانتشار على نطاق واسع كنموذج للتحقيق في تنظيم ديناميات اللاميلبوديا.
انتشار الخلية هو عملية ميكانيكية ديناميكية حيث تلتزم الخلية المعلقة أولا بركيزة من خلال التصاقات المستندة إلى integrin17و19و20 ثم تنتشر عن طريق توسيع نتوءات المستندة إلى أكتين21،22،23. خلال مرحلة الانتشار، lamellipodia المنبثقة من جسم الخلية تبرز isotropically وبإصرار مع تراجع ضئيلة أو معدومة أو المماطلة12. بروتوكولات انتشار الخلايا الأكثر استخداما هي المقايسات نقاط النهاية ، حيث يتم إصلاح خلايا الانتشار في أوقات مختلفة بعد طلاء19،24. هذه المقايسات، على الرغم من سريعة وبسيطة، محدودة في قدرتها التشخيصية للكشف عن التغيرات في الميزات الديناميكية للlamellipodia. لتحديد الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات اللاميلبوديا ، كانت مجموعة شيتز رائدة في استخدام التحليل الكمي للخلايا الحية المنتشرة وكشفت عن العديد من الخصائص الأساسية لنتوءات حافة الخلية11و12و22. وقد أظهرت هذه الدراسات أن الخلايا الحية نشر المقايسة هو تقنية قوية وقوية في صندوق أدوات مختبر بيولوجيا الخلية. وعلى الرغم من ذلك، فإن البروتوكول التفصيلي والأداة الحسابية مفتوحة المصدر لإجراء فحص للخلايا الحية المنتشرة غير متاحة حاليا لمجتمع بيولوجيا الخلايا. وتحقيقا لهذه الغاية، يحدد بروتوكولنا إجراءات تصوير خلايا الانتشار الحي ويوفر أداة تحليل تلقائي للصور. للتحقق من صحة هذه الطريقة، استخدمنا Arp2/3 تثبيط كعلاج تجريبي وأظهرت أن تثبيط وظيفة مجمع Arp2/3 لم يوقف انتشار الخلايا ولكن تسبب في انخفاض كبير في سرعة نتوء الخلية، فضلا عن استقرار نتوءات حافة الخلية، مما أدى إلى حواف الخلية خشنة. هذه البيانات تثبت أن الجمع بين التصوير بالخلايا الحية وتحليل الصور الآلي هو أداة مفيدة لتحليل ديناميات حافة الخلية وتحديد المكونات الجزيئية التي تنظم lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

انتشار الخلية هو عملية ديناميكية تعلق فيها الخلية المعلقة في الوسائط على الركيزة وتسطيح نفسها من شكل مدور إلى شكل رقيق ومنتشر. بعد مرفق ركيزة الخلية، تشكل الخلية ورقة رقيقة من اللاميليبوديا المنبثقة من جسم الخلية. في اللاميلبوديا ، يبوليمر أكتين كروي (G-actin) إلى شبكة أكتين خيوط كثيفة (F-actin) تدفع ضد غشاء البلازما ، وبالتالي توفير القوى الميكانيكية اللازمة للخلية للانتشار. وتجدر الإشارة إلى أن اللاعبين الجزيئيين الذين يتحكمون في بلمرة أكتين في اللاميلبوديا ضروريون للعديد من العمليات الخلوية الأخرى ، مثل هجرة الخلايا وداء الغدد الصماء. 
منذ انتشار الخلايا تشكل lamellipodia المستمر التي تمتد على محيط الخلية بأكملها والتوسع باستمرار إلى الخارج، أصبحت المقايسات انتشار الخلايا أداة فعالة لتقييم حركية نتوءات اللاميليبوديال. وعلى الرغم من وضع عدة تطبيقات تقنية للتشتيت الذي ينشر الخلية، فإن هناك نقصا في وصف مفصل لسير العمل، الذي سيشمل بروتوكولا تدريجيا وأدوات حسابية لتحليل البيانات. هنا، نقوم بوصف الإجراءات التجريبية للخلية التي تنشر المقايسة وتقديم أداة مفتوحة المصدر للتحليل الكمي وغير المتحيز لديناميكيات حافة الخلية أثناء الانتشار. عندما يقترن التلاعب الدوائي و / أو تقنيات إسكات الجينات ، وهذا البروتوكول قابلة لشاشة واسعة النطاق من اللاعبين الجزيئية التي تنظم نتوءات lamellipodial.

يصف البروتوكول أعلاه الإجراءات التجريبية لتصوير الخلايا الحية للخلايا المنتشرة وأداة حسابية للتحليل الكمي لديناميكيات انتشار الخلايا. يمكن استخدام الأداة الحاسوبية في شكل منخفض أو عالي الإنتاجية لتحديد اللاعبين الجزيئيين الذين ينظمون آلات البلمرة actin على الحافة الرائدة للخلية.
<p class...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

في هذا البروتوكول، نقدم الإجراءات التجريبية للخلية التي تنشر المقايسة التي تقوم على المجهر الحي الخلية. نحن نقدم أداة حسابية مفتوحة المصدر للتجزئة غير المتحيزة للخلايا المسماة بالفلورسنت والتحليل الكمي لديناميكيات اللاميلبوديا أثناء انتشار الخلايا.

التحليل الكمي لديناميكيات حافة الخلية أثناء انتشار الخلايا

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

يحدد البروتوكول الموصوف في هذا الفيديو الإجراءات التجريبية المطلوبة لتصوير الخلايا المنتشرة بالحجم الطبيعي واستخدام أداة حسابية تحدد كميا الخلايا التي تنشر الديناميكيات بطريقة غير متحيزة وآلية. تسمح أصول انتشار الخلية بالتتبع المستمر لحركة حافة الخلية والتغيرات المورفولوجية أثناء انتشار الخلايا ، وهي ميزة مفقودة في معظم المقايسات المنتشرة للخلايا الموجودة. كذلك، ينفذ هذا البروتوكول استخدام المعالجة الآلية للكمبيوتر وتحليله، وتوفير المعلومات عن تدوير الخلايا، ودورات تراجع المنطقة والنتوءات من الخلايا المنتشرة.هذه المعالجة الآلية يقلل من التحيز في تحليل البيانات ويوفر طريقة قوية لتحليل ديناميات انتشار الخلايا لعدد كبير من الخلايا. عندما يقترن العلاجات الدوائية أو علم الجينات والتقنيات، وهذا البروتوكول قابلة لسرعات واسعة النطاق من اللاعبين الجزيئية تنظيم نتوءات الخلايا. بالنسبة للبروتوكول المحدد ، فإن الخلايا المستخدمة هي الخلايا الليفية الجنينية الماوس التي ترميز وراثيا PH-Akt-GFP، والذي يسمح لوضع علامات الفلورسنت من غشاء البلازما.قبل بداية الخلية نشر المقايسة، والثقافة طبق من الخلايا إلى التقاء 90٪. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء السليم، لهب زلة غطاء 22 في 22 ملليمتر ووضعه في طبق ثقافة الخلية 35 ملليمتر. معطف زلة الغطاء مع فيبروكتين التي تم تخفيفها في برنامج تلفزيوني إلى تركيز 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر.ضع الطبق مع الغطاء زلة في حاضنة 37 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة تستنشق فيبروكتين التأكد من عدم لمس زلة الغطاء مع طرف ماصة. غسل الطبق مع برنامج تلفزيوني عن طريق pipetting بلطف حول زلة الغطاء مرتين إلى ثلاث مرات.لزرع الخلايا، تبدأ عن طريق التجسس وسائل الإعلام ثقافة الخلية من طبق من الخلايا. بعد ذلك، اغسل الطبق مع برنامج تلفزيوني دافئ. إضافة 650 ميكرولتر من التربسين EDTA إلى الطبق وإمالة الطبق لتوزيع بالتساوي الانزيم.ضع الطبق مع التريبسين في الحاضنة لمدة دقيقة واحدة. بعد الحضانة ستحتاج أولا إلى إضافة 10 ملليلتر من وسائط ثقافة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك ، أضف بسرعة 10 ملليلترات أخرى من الوسائط إلى الطبق من أجل إخماد التريبسين.لتمييع الخلايا التي سيتم بذرها على زلة الغطاء، ماصة ملليلتر واحد من محتويات الطبق في أنبوب الطرد المركزي. من الأنبوب، ماصة ما يقرب من 500 إلى 1، 000 ميكرولتر من الخلايا المخففة في الطبق مع زلة الغطاء. تأكد من أن زلة الغطاء تبلغ التقاء 10٪ أو 50,000 خلية لكل ملليلتر وضبط حجم الخلايا المخففة حسب الحاجة.الغرض من هذه الخلايا هو إنشاء مستوى من التركيز أثناء الحصول على الصورة. مع الخلايا المتبقية في الطبق، مرور خمس الخلايا إلى طبق واحد صغير لكل علاج. هذه ستكون الخلايا التي سيتم تحليلها لنشر الديناميكيات.ضع أطباق المرور وطبق زلة الغطاء في حاضنة لمدة ثماني إلى 24 ساعة. لاختبار أهمية Arp2/3 لانتشار الخلايا، أضف أولا خمسة ملليلترات من وسائط ثقافة الخلية إلى أنبوب تحكم ومطرد مركزي للعلاج. إضافة المقبل 20 ملليلتر من dmem التي تفتقر إلى فينول الأحمر في كل من اثنين من أنابيب الطرد المركزي أكبر.ماصة إما المخدرات CK-666 وهو مثبط للمجمع Arp2/3 أو العلاج الخاضعة للرقابة مثل DMSO في أنابيب صغيرة وكبيرة. لبدء العلاج الدوائي للخلايا ، قم بإزالة أطباق المرور التي كانت تحتضن بين عشية وضحاها. يستنشق وسائل الإعلام ثقافة الخلية من جميع الأطباق وغسل الأطباق مع برنامج تلفزيوني دافئ.خذ الأنابيب الصغيرة التي تحتوي على إما CK-666 أو التحكم في الوسائط التكميلية وإضافة محتويات الأنبوب ذي الصلة إلى كل من أطباق المرور. تسمية كل من الأطباق مع العلاج الدوائي الصحيح ومن ثم وضع الأطباق مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة ساعة إضافية بعد حضانة ساعة واحدة، يستنشق وسائل الإعلام المخدرات تكمل من كل من الأطباق. بعد ذلك ، أضف PBS الدافئ إلى جميع الأطباق من أجل إزالة جميع الوسائط الحمراء المتبقية من الفينول.إضافة 230 ميكرولتر من EDTA تريبسين ووضع الأطباق في حاضنة لمدة دقيقة واحدة. إزالة الأطباق جربسينED من الحاضنة والمضي قدما لإضافة خمسة ملليلتر من المخدرات تكمل dmem التي تفتقر إلى فينول الأحمر في أنبوب المعينة كما أنبوب B.Then إضافة خمسة ملليلترات أخرى من نفس وسائل الإعلام في الطبق ذات الصلة لإرواء التريبسين. ماصة وسائل الإعلام صعودا وهبوطا عدة مرات من أجل فصل جميع الخلايا من الطبق.نقل جميع محتويات الطبق إلى أنبوب آخر تم تعيينه بالفعل أنبوب A.In من أجل إعداد تخفيف الخلية التي هي مناسبة للتصوير، ونقل ملليلتر واحد من الخلايا من أنبوب A إلى أنبوب B.Repeat كل من خطوات التخفيف لكل علاج. ضع جميع الأنابيب في الحاضنة لمدة 45 دقيقة للسماح للخلايا بالتعافي من التربسين. تأكد من أن جميع أجزاء الغرفة المغناطيسية للخلايا التي يمكن أن تستوعب زلة غطاء 22 في 22 ملليمتر قد تم تنظيفها جيدا قبل الاستخدام.إزالة الطبق مع زلة الغطاء من الحاضنة. يستنشق وسائل الإعلام ثقافة الخلية وغسل زلة الغطاء مع برنامج تلفزيوني دافئ. إزالة زلة الغطاء باستخدام زوج من ملقط ووضع بلطف زلة الغطاء على لوحة أسفل الغرفة المغناطيسية.المقبل التقاط طوقا السيليكون ووضعه على رأس زلة الغطاء. إرفاق الجسم الرئيسي للغرفة المغناطيسية على لوحة أسفل. إضافة ملليلتر واحد من dmem تفتقر إلى فينول الأحمر المقابلة للعلاج ذات الصلة إلى الغرفة المغناطيسية.خذ أنسجة خالية من الوبر وداب بعناية الضميمة بين الجسم الرئيسي ولوحة أسفل من أجل التحقق من أي تسرب. لإكمال الغرفة المغناطيسية، خفض الغطاء الشفاف على الجسم الرئيسي. وأخيرا مسح الجزء السفلي من زلة الغطاء مع نسيج رش بالماء وآخر رش مع الإيثانول 70٪.سخني الحاضنة العليا للمرحلة من المجهر الكونفوجال إلى 37 درجة. ضع الغرفة المغناطيسية فوق الهدف. قبل اكتساب ديناميات الانتشار، قم بتعيين التركيز على الخلايا المستقطبة بالفعل في قناة الفلورسنت الخضراء.وهذا يضمن أن الخلايا المنتشرة ستكون في بؤرة التركيز بمجرد إرفاقها بزلة الغطاء. إزالة الغطاء الشفاف للغرفة المغناطيسية وماصة 500 ميكرولتر من الأنبوب B الذي تمت إزالته من الحاضنة. ضع الغطاء الشفاف مرة أخرى في الأعلى.لتحديد الخلايا المثالية لنشر الخلية تحليل البحث عن الهالات الخضراء التي تمثل الخلايا التي لم تعلق بعد على زلة الغطاء أو هي في المراحل الأولى من المرفق. الحصول على الصور وحفظ الملفات. بعد الانتهاء من الحصول على صورة من انتشار الخلية، تبدأ بتشغيل IDE بيثون متوافق مثل سبايدر.للتحليل الحسابي لديناميات انتشار الخلية، حدد موقع وفتح الخلية نشر ملف واجهة المستخدم الرسومية المقدمة في حزم البرنامج النصي ذات الصلة. اضغط على زر التشغيل الذي سيفتح لوحة واجهة المستخدم الرسومية للتحليل في الخلفية. واجهة المستخدم الرسومية تضم جميع الإعدادات اللازمة للتحليل.لتحليل مساحة الخلية والتعميم، أدخل ملف الامتلاك والإعدادات الضرورية في علامة التبويب منطقة انتشار الخلية. يجب إجراء التعديلات اعتمادا على نوع الخلية ومعلمات الحصول على الصورة. بعد الضغط على التشغيل، سيقوم البرنامج النصي بإنشاء دائرية الخلية والمنطقة مقابل رسم الوقت لجميع الخلايا المنتشرة.للحصول على بيانات كيموغراف، اضغط على مولد الكيموغراف وعلامة التبويب التحليل. يتطلب هذا التحليل إدخال الملفات إلى اقتصاص مكدسات صورة الخلية المفردة. بعد إدراج كافة الإعدادات والضغط على التشغيل، سيقوم البرنامج النصي بإنشاء عدة kymographs للخلية المحددة.على اليسار توجد خلايا تمثيلية من علاجات DMSO و CK-666 ، مجزأة تلقائيا باستخدام البرنامج النصي المقدم. على عكس المورفولوجيا الأيزوتروبيكية والتعميمية للغاية التي أظهرتها خلايا التحكم ، تظهر الخلايا المثبطة Arp2/3 دائرية انخفضت. بالإضافة إلى ذلك ، توفر kymographs التي تم إنشاؤها تلقائيا دقة زمنية حاسمة لفهم ديناميكيات النتوءات.تبرز خلايا التحكم باستمرار مع تراجعات قليلة أو معدومة. في المقابل، Arp2/3 تثبيط يعطل استقرار نتوءات كما هو مبين من خلال الزيادة في أحداث التراجع في جميع أنحاء انتشار. يجب أن توفر لك مقاطع الفيديو هذه فهما لكيفية زرع الخلايا بشكل صحيح ، وإجراء العلاجات الدوائية وإعداد أدوات التصوير والحساب اللازمة للقياس الكمي لديناميكيات انتشار الخلايا.يمكن دمج هذا البروتوكول بشكل أكبر مع التصوير الفلوري للهيكل الخلوي ومقاايسات الهجرة لتحديد اللاعبين الجزيئيين الذين يحكمون نتوءات الخلايا. شكرا لكم على مشاهدة وحظا سعيدا مع التجارب الخاصة بك.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

تعيش خلية التصوير والتحليل الكمي من الخلايا الظهارية في الجنينية القيطم المورق</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

تحديد عدد الخلايا خلال زراعة الخلايا باستخدام خلية مكافحة الصولجان

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

تحليل كمي لياقة سير العمل

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

سطح نشر والمناعية من الكروموسومات الخميرة

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

الفيديو خالية من عدسة مجهرية للدينامية والتحليل الكمي للثقافة الخلية ملتصقة

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...