Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskud RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund og University of Toronto XSeed Program.

1. Cellesåning
BEMÆRK: Den beskrevne cellespredningsprotokol blev udført ved hjælp af musefosfosiske fibroblaster (MEF'er), der udtrykker PH-Akt-GFP (en fluorescerende markør for PIP3/PI(3,4)P2). Denne cellelinje blev genereret ved genomisk at integrere en ekspressionskonstruktion til PH-Akt-GFP (Addgene #21218) ved CRISPR-medieret genredigering. Andre lysstofrør, der udtrykkes forbigående eller integreres i genomet, kan dog også bruges i denne analyse. For optimal ...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

Den beskrevne cellespredningsanalyse giver mulighed for kontinuerlig sporing af morfologiske ændringer(f.eks. cellestørrelse og -form) og cellekantbevægelser(dvs. fremspringshastighed og tilbagetrækningsfrekvens), som er funktioner, der mangler i de fleste cellespredningsprotokoller19,24. Mens almindeligt anvendte endepunkt celle sprede assays giver mulighed for bestemmelse af cellespredning hastighed, disse assays undlader at løse den tids...

Lamellipodial fremspring er fremtrædende cytoskeletale strukturer dannet på forsiden af en migrerende celle. I lamellipodia skaber polymerisering af actin ved hjælp af Arp2/3-komplekset og forminer et hurtigt voksende forgrenet actin meshwork, der skubber mod plasmamembranen1,2. Den skubbekraft , der genereres af det actin meshwork , driver fysisk cellen fremad1,3,4,5. Udtømning af Arp2/3-komplekset eller afbrydelse af signalveje , der er afgørende for lamellipodiale fremspring , forringer oftecellemigrationen 6, 7. Selv om migration af lamellipodia-mangelfulde celler også er blevet rapporteret8,9, betydningen af lamellipodi i celle migration er tydeligt som udtømning af denne fremspringende struktur gennemsyrer cellens evne til at bevæge sig gennem komplekse biologiske mikromiljøer6,10.
En væsentlig hindring for at forstå reguleringen af lamellipodi i migrerende celler er den naturlige variation i lamellipodial protrusion kinetik, størrelse og form11,12,13,14. Desuden har nylige undersøgelser vist, at lamellipodia udviser kompleks fremspringende adfærd, herunder svingende, periodiske og accelererende fremspring14,15. Sammenlignet med de meget variable lamellipodier af migrerende celler6,16, lamellipodia dannet under cellespredning er mereensartet 12. Da fremspringende aktivitet spredning og migrerende celler er drevet af identiske makromolekylære forsamlinger, som omfatter en forgrenet actin netværk, kontraktil actomyosin bundter, og integrin-baserede celle-matrix vedhæftninger17,18, sprede celler er blevet udbredt som en model for at undersøge reguleringen af lamellipodia dynamik.
Cellespredning er en dynamisk mekanokemisk proces , hvor en celle i suspension først klæber til et substrat gennem integrinbaserede vedhæftninger17,19,20 og derefter spredes ved at udvide actin-baserede fremspring21,22,23. Under spredningsfasen stikker lamellipodier, der stammer fra cellekroppen, isotropisk og vedvarende med lidt eller ingen tilbagetrækning eller hingst12. De mest anvendte cellespredningsprotokoller er endpoints assays, hvor spredning af celler rettes på forskellige tidspunkter efter plating19,24. Disse assays, selv om hurtig og enkel, er begrænset i deres diagnostiske magt til at opdage ændringer i de dynamiske funktioner i lamellipodia. For at bestemme de molekylære mekanismer, der styrer lamellipodiadynamik, var Sheetz-gruppen banebrydende for brugen af kvantitativ analyse af levende spredeceller og afdækkede mange grundlæggende egenskaber ved cellekantfremspring11,12,22. Disse undersøgelser har vist, at levende celle sprede analyse er en robust og kraftfuld teknik i værktøjskassen i en celle biologi laboratorium. På trods af dette er en detaljeret protokol og open source-beregningsværktøj til en spredning af levende celler i øjeblikket ikke tilgængeligt for cellebiologisamfundet. Til dette formål skitserer vores protokol procedurerne for billeddannelse af levende sprede celler og giver et automatiseret billedanalyseværktøj. For at validere denne metode brugte vi Arp2/3-hæmning som en eksperimentel behandling og viste, at hæmning af Arp2/3-kompleksets funktion ikke arresterede cellespredning, men forårsagede en betydelig reduktion i cellefremspringshastigheden samt stabiliteten af cellekantfremspring, hvilket gav anledning til takkede cellekanter. Disse data viser, at kombinationen af live-celle billeddannelse og automatiseret billedanalyse er et nyttigt værktøj til at analysere cellekant dynamik og identificere molekylære komponenter, der regulerer lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

Cellespredning er en dynamisk proces, hvor en celle, der er ophængt i medier, fastgøres til et substrat og samkopierer sig selv fra en afrundet til en tynd og spredt form. Efter celle-substrat vedhæftet fil, cellen danner et tyndt ark lamellipodia stammer fra cellekroppen. I lamellipodien polymeriseres kugleformede actin (G-actin) monomerer til et tæt filamentous actin (F-actin) meshwork, der skubber mod plasmamembranen, hvilket giver de mekaniske kræfter, der kræves for, at cellen kan sprede sig. Især de molekylære spillere, der styrer actin polymerisering i lamellipodia er afgørende for mange andre cellulære processer, såsom celle migration og endokytose. 
Da sprede celler danner kontinuerlig lamellipodi, der spænder over hele cellen periferien og vedvarende udvide udad, celle sprede assays er blevet et effektivt redskab til at vurdere kinetik lamellipodial fremspring. Selv om flere tekniske implementeringer af cellespredningsanalysen er blevet udviklet, mangler der i øjeblikket en detaljeret beskrivelse af arbejdsgangen, som vil omfatte både en trinvis protokol og beregningsværktøjer til dataanalyse. Her beskriver vi de eksperimentelle procedurer i cellespredningsanalysen og præsenterer et open source-værktøj til kvantitativ og upartisk analyse af cellekantdynamik under spredning. Når denne protokol kombineres med farmakologiske manipulationer og/eller genhæmningsteknikker, kan den tilpasses en storstilet skærm af molekylære afspillere, der regulerer lamellipodiale fremspring.

Ovenstående protokol beskriver de eksperimentelle procedurer for levende celle billeddannelse af sprede celler og et beregningsværktøj til kvantitativ analyse af cellespredning dynamik. Beregningsværktøjet kan bruges i et lav- eller højoverførselsformat til at identificere de molekylære spillere, der regulerer actin-polymeriseringsmaskineriet ved cellekanten.
Den skematiske repræsentation af forsøgsprocedurerne er vist i figur 1. Cellen sprede assay blev...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

I denne protokol præsenterer vi de eksperimentelle procedurer i en cellespredningsanalyse, der er baseret på levende cellemikroskopi. Vi leverer et open source beregningsværktøj til uvildig segmentering af fluorescerende mærkede celler og kvantitativ analyse af lamellipodia dynamik under cellespredning.

Kvantitativ analyse af cellekantdynamik under cellespredning

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Protokollen, der er beskrevet i denne video, definerer de eksperimentelle procedurer, der kræves til billeddannelse i naturlig størrelse af spredning af celler og brugen af et beregningsværktøj, der kvantificerer celler, der spreder dynamikken på en upartisk og automatiseret måde. Cellespredningsaktivet giver mulighed for kontinuerlig sporing af cellekantbevægelse og morfologiske ændringer under cellespredning, hvilket er en funktion, der mangler i de fleste eksisterende cellespredningsanalyser. Denne protokol implementerer også brugen af automatiseret computerbehandling og -analyse, der giver oplysninger om cellecirkulæritet, område- og fremspringsudtrækscyklusser for spredning af celler.En sådan automatiseret behandling reducerer bias i dataanalyse og giver en robust metode til at analysere cellespredningsdynamik for et stort antal celler. Når den kombineres med medicinske behandlinger eller genvidenskab og -teknikker, er denne protokol modtagelig for store hastigheder af molekylære spillere, der regulerer cellefremspring. For den givne protokol, De anvendte celler er mus embryonale fibroblaster, der genetisk indkode PH-Akt-GFP, som giver mulighed for fluorescerende tagging af plasmamembranen.Forud for begyndelsen af cellen sprede analyse, kultur en parabol af celler til 90% sammenløb. Når cellerne har opnået den rette sammenløb, flamme en 22 af 22 millimeter dække slip og læg den i en 35 millimeter cellekultur parabol. Dækslet skaledlerne belægges med fibronectin, der er fortyndet i PBS, til en koncentration på 2,5 mikrogram pr. milliliter.Placer skålen med dækslet glide ind i en 37 graders inkubator i en time. Efter en time indsugning af fibronectin og sørg for ikke at røre dækslet glide med pipette spidsen. Vask skålen med PBS ved forsigtigt at pipere rundt om dækslet to til tre gange.For celle såning, begynde med at aspirere cellekultur medier fra parabol af celler. Bagefter vaskes skålen med varm PBS. Tilsæt 650 mikroliter trypsin EDTA til skålen og vip skålen for at fordele enzymet jævnt.Placer skålen med trypsin i inkubatoren i et minut. Efter inkubation skal du først tilføje 10 milliliter cellekulturmedier i et centrifugerør. Derefter skal du hurtigt tilføje yderligere 10 milliliter medier i skålen for at slukke trypsin.For at fortynde de celler, der vil blive seedet på dækslet slip, pipette en milliliter af skålens indhold i centrifuge røret. Fra røret pipettes ca. 500 til 1.000 mikroliter af fortyndede celler i skålen med dækslet. Sørg for, at dækslet slip er på en 10% sammenløb eller 50.000 celler pr milliliter og justere mængden af fortyndede celler efter behov.Formålet med disse celler er at etablere et plan for fokus under billederhvervelse. Med de resterende celler i skålen, passage en femtedel af cellerne i en lille skål pr behandling. Disse vil være de celler, der vil blive analyseret for at sprede dynamik.Placer passage retter og dækslet slip parabol i en inkubator i otte til 24 timer. For at teste vigtigheden af Arp2/3 for cellespredning skal du først tilføje fem milliliter cellekulturmedier i en kontrol og et behandlingscentrifugerør. Derefter tilsættes 20 milliliter dmem, der mangler phenolrødt i hver af to større centrifugerør.Pipette enten stoffet CK-666, som er en hæmmer af Arp2/3 komplekset eller den kontrollerede behandling såsom DMSO i de små og store rør. For at begynde farmakologisk behandling af cellerne skal du fjerne de passageretter, der inkuberes natten over. Indsug cellekulturmedierne fra alle retterne, og vask opvasken med varm PBS.Tag de små rør, der indeholder enten CK-666 eller kontrol supplerede medier og tilsæt indholdet af det relevante rør i hver af passagen retter. Mærk hver af retterne med den korrekte lægemiddelbehandling, og placer derefter opvasken tilbage i inkubatoren i en ekstra time Efter en times inkubation supplerede stoffet medierne fra hver af retterne. Dernæst tilsættes varm PBS til alle retterne for grundigt at fjerne alle de resterende phenol røde medier.Tilsæt 230 mikroliter trypsin EDTA og læg opvasken i en inkubator i et minut. Fjern de trypsiniserede retter fra inkubatoren og fortsæt med at tilføje fem milliliter af lægemidlet suppleret dmem, der mangler phenol rød i et rør, der er udpeget som rør B.Derefter tilsættes yderligere fem milliliter af samme medie i den relevante skål for at slukke trypsin. Pipetter mediet op og ned flere gange for at fjerne alle cellerne fra skålen.Overfør alt indholdet af skålen til et andet rør, der allerede er udpeget som rør A.In for at forberede en cellefortynding, der er egnet til billeddannelse, overføre en milliliter celler fra rør A til rør B.Gentag alle fortyndingstrinnene for hver behandling. Placer alle rørene i inkubatoren i 45 minutter for at give cellerne mulighed for at komme sig efter trypsinisering. Sørg for, at alle dele af en celle magnetisk kammer, der kan rumme en 22 af 22 millimeter dække slip er blevet grundigt rengjort før brug.Fjern skålen med dækslet fra inkubatoren. Indsug cellekulturmediet, og vask dækslet med varm PBS. Fjern dækslet slip ved hjælp af et par pincet og forsigtigt lægge dækslet glide på bunden plade af det magnetiske kammer.Derefter afhente silikone pakning og læg den på toppen af dækslet slip. Fastgør hoveddelen af det magnetiske kammer på bundpladen. Der tilsættes en milliliter af dmem'en, der mangler phenolrød, svarende til den relevante behandling, til magnetkammeret.Tag et fnugfrit væv og dup forsigtigt kabinettet mellem hovedkroppen og bundpladen for at kontrollere eventuelle lækager. For at fuldføre det magnetiske kammer skal du sænke det gennemsigtige dæksel på hovedkroppen. Til sidst tørres bunden af dækslet med et væv sprøjtet med vand og en anden sprøjtes med 70% ethanol.Forvarm fase top inkubatoren af et konfokalt mikroskop til 37 grader. Placer det magnetiske kammer oven på målet. Før du erhverver spredningsdynamik, skal du sætte fokus på de allerede polariserede celler i den grønne fluorescerende kanal.Dette sikrer, at spredningscellerne vil være i fokus, når de fastgøres til dækslet. Fjern det gennemsigtige dæksel af det magnetiske kammer og pipetten 500 mikroliter fra rør B, der blev fjernet fra inkubatoren. Placer det gennemsigtige dæksel tilbage på toppen.At identificere celler, der er ideelle til cellespredningsanalyse, skal du søge efter grønne glorier, der repræsenterer celler, der endnu ikke er fastgjort til dækslet, eller som befinder sig i de tidligste stadier af den vedhæftede fil. Anskaf billeder, og gem filerne. Efter at have afsluttet billederhvervelsen af cellespredning, skal du begynde med at køre en kompatibel Python IDE som Spyder.Til beregningsanalyse af cellespredningsdynamik skal du finde og åbne den gui-fil til cellespredning, der findes i de relevante scriptpakker. Tryk på knappen Kør, som åbner panelet for analyse-GUI i baggrunden. Gui huser alle de indstillinger, der er nødvendige for analyse.Hvis du vil analysere celleområde og cirkularitet, skal du indtaste anskaffelsesfilen og de nødvendige indstillinger under fanen celleopslagsområde. Justeringer skal foretages afhængigt af celletype og billedopsamlingsparametre. Når du har trykket på kørslen, opretter scriptet en cellecirkulæritet og et område i forhold til tidsplottet for alle celler, der spredes.Tryk på kymographgeneratoren og analysefanen for kymograph-data. Denne analyse kræver, at inputfiler beskæres i enkeltcellebilledstakke. Når du har indsat alle indstillingerne og trykket på kørslen, opretter scriptet flere kymografier for den givne celle.Til venstre er repræsentative celler fra DMSO og CK-666 behandlinger, automatisk segmenteret ved hjælp af det medfølgende script. I modsætning til den isotropiske og meget cirkulære morfologi, som kontrolcellerne har påvist, udviser Arp2/3-hæmmede celler nedsat cirkularitet. Derudover giver de automatisk genererede kymographs tidsmæssig opløsning, der er afgørende for at forstå dynamikken i fremspring.Kontrolceller stikker vedvarende ud med lidt eller ingen tilbagetrækninger. I modsætning hertil forstyrrer Arp2/3-hæmning stabiliteten af fremspring som angivet ved stigningen i tilbagetrækningshændelser under spredning. Disse videoer skal give dig forståelse for, hvordan du korrekt frøceller, udføre farmakologiske behandlinger og forberede billeddannelse og beregningsmæssige værktøjer er nødvendige for kvantificering af cellespredning dynamik.Denne protokol kan yderligere kombineres med cytoskeleton fluorescerende billeddannelse og migration assays at identificere de molekylære spillere, der styrer celle fremspring. Tak for at se og held og lykke med dine eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative levende celler fluorescens-mikroskopi Analyse af Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ Fitness Analyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Bredspredning og immunfarvning af gærkromosomer

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høj opløsning Imaging og analyse af de enkelte Astral mikrotubulusdynamik i Spirende Gær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Linse-gratis Video mikroskopi for dynamiske og kvantitativ analyse af vedhængende cellekultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...