Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Connaught Fund New Investigator Award aan S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (subsidies RGPIN-2015-05114 en RGPIN-2020-05881), University of Manchester en University of Toronto Joint Research Fund en University of Toronto XSeed Program.

1. Cel zaaien
OPMERKING: Het beschreven celverspreidingsprotocol werd uitgevoerd met behulp van embryonale fibroblasten (MEF's) van muizen die PH-Akt-GFP (een fluorescerende marker voor PIP3/PI(3,4)P2) uitdrukken. Deze cellijn werd gegenereerd door genomisch een expressieconstructie voor PH-Akt-GFP (Addgene #21218) te integreren door CRISPR-gemedieerde genbewerking. Andere fluorescerende markers die tijdelijk worden uitgedrukt of geïntegreerd in het genoom kunnen echter oo...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

De beschreven celspreidingstest maakt het mogelijk om continu morfologische veranderingen(bijv. celgrootte en -vorm) en celrandbewegingen(d.w.z. uitsteeksnelheid en intrekfrequentie) te volgen, die kenmerken zijn die ontbreken in de meeste celspreidingsprotocollen19,24. Hoewel veelgebruikte eindpuntcelspreidingstesten de bepaling van de celspreidingssnelheid mogelijk maken, slagen deze assays er niet in om de temporele dynamiek van celrandbewegi...

Lamellipodiale uitsteeksels zijn prominente cytoskeletstructuren gevormd aan de voorkant van een migrerende cel. In lamellipodia creëert polymerisatie van actine met behulp van het Arp2/3-complex en formines een snelgroeiend vertakt actinegaaswerk dat tegen het plasmamembraanduwt 1,2. De duwkracht die door het actinenetwerk wordtgegenereerd,drijft de cel fysiek naar voren1,3,4,5. Uitputting van het Arp2/3-complex of verstoring van signaleringsroutes die essentieel zijn voor lamellipodiële uitsteeksels, tasten vaak de celmigratie aan6, 7. Hoewel migratie van lamellipodia-deficiënte cellen ook is gemeld8,9, is het belang van lamellipodie bij celmigratie duidelijk , aangezien uitputting van deze uitstekende structuur het vermogen van de cel om zich door complexe biologische micromilieus te bewegen6,10verstoort .
Een belangrijke belemmering voor het begrijpen van de regulatie van lamellipodia in migrerende cellen is de natuurlijke variabiliteit in lamellipodiële uitsteekkinetiek, grootte en vorm11,12,13,14. Bovendien hebben recente studies aangetoond dat lamellipodia complex uitstekend gedrag vertonen, waaronder fluctuerende, periodieke en versnellende uitsteeksels14,15. In vergelijking met de zeer variabele lamellipodia van migrerende cellen6,16, zijn lamellipodia gevormd tijdens celverspreiding uniformer12. Aangezien de uitstekende activiteit van het verspreiden en migreren van cellen wordt aangedreven door identieke macromoleculaire assemblages, waaronder een vertakt actinenetwerk, contractiele actomyosinebundels en op integrin gebaseerde celmatrixadhesie17,18, zijn spreidcellen veel gebruikt als model voor het onderzoeken van de regulatie van lamellipodiadynamiek.
Celspreiding is een dynamisch mechanochemisch proces waarbij een cel in suspensie zich eerst aan een substraat hecht door adhesies op basis van integrin17,19,20 en vervolgens verspreidt door actinegebaseerde uitsteeksels21,22,23uit te breiden . Tijdens de verspreidingsfase steken lamellipodia afkomstig van het cellichaam isotropisch en aanhoudend uit met weinig tot geen intrekking of vertraging12. De meest gebruikte celverspreidingsprotocollen zijn eindpunttesten, waarbij spreidcellen op verschillende tijdstippen na plating19,24worden gefixeerd . Deze tests, hoewel snel en eenvoudig, zijn beperkt in hun diagnostische vermogen om veranderingen in de dynamische kenmerken van lamellipodia te detecteren. Om de moleculaire mechanismen te bepalen die de lamellipodiedynamiek beheersen, pionierde de Sheetz-groep met het gebruik van kwantitatieve analyse van levende verspreidingscellen en ontdekte veel fundamentele eigenschappen van celranduitsteeksels11,12,22. Deze studies hebben aangetoond dat de levende celspreidingstest een robuuste en krachtige techniek is in de gereedschapskist van een celbiologisch laboratorium. Desondanks zijn een gedetailleerd protocol en een open-source computationele tool voor een live-cell spreading assay momenteel niet beschikbaar voor de celbiologiegemeenschap. Hiertoe schetst ons protocol de procedures voor het weergeven van levende verspreidingscellen en biedt het een geautomatiseerde tool voor beeldanalyse. Om deze methode te valideren, gebruikten we Arp2/3-remming als een experimentele behandeling en toonden we aan dat het remmen van de functie van het Arp2/3-complex de celspreiding niet arresteerde, maar een aanzienlijke vermindering van de uitsteeksnelheid van cellen veroorzaakte, evenals de stabiliteit van celranduitsteeksels, waardoor gekartelde celranden ontstonden. Deze gegevens tonen aan dat de combinatie van live-cell imaging en geautomatiseerde beeldanalyse een nuttig hulpmiddel is voor het analyseren van celranddynamica en het identificeren van moleculaire componenten die lamellipodia reguleren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

Celspreiding is een dynamisch proces waarbij een cel die in media is opgehangen zich hecht aan een substraat en zichzelf afvlakt van een afgeronde naar een dunne en uitgespreide vorm. Na de aanhechting tussen cel en substraat vormt de cel een dun vel lamellipodie dat uit het cellichaam komt. In de lamellipodia polymeriseren bolvormige actine (G-actine) monomeren tot een dicht filamenteus actine (F-actine) gaaswerk dat tegen het plasmamembraan duwt, waardoor de mechanische krachten worden geleverd die nodig zijn om de cel te verspreiden. Met name de moleculaire spelers die de actinepolymerisatie in lamellipodia beheersen, zijn essentieel voor veel andere cellulaire processen, zoals celmigratie en endocytose. 
Sinds het verspreiden van cellen continue lamellipodie vormt die de hele celperiferie overspannen en voortdurend naar buiten uitzetten, zijn celspreidingstesten een efficiënt hulpmiddel geworden om de kinetiek van lamellipodiële uitsteeksels te beoordelen. Hoewel verschillende technische implementaties van de celverspreidingstest zijn ontwikkeld, ontbreekt momenteel een gedetailleerde beschrijving van de workflow, die zowel een stapsgewijs protocol als rekentools voor gegevensanalyse zou bevatten. Hier beschrijven we de experimentele procedures van de celverspreidingstest en presenteren we een open-source tool voor kwantitatieve en onbevooroordeide analyse van celranddynamiek tijdens het verspreiden. In combinatie met farmacologische manipulaties en/of gen-dempingstechnieken is dit protocol vatbaar voor een grootschalig scherm van moleculaire spelers die lamellipodiële uitsteeksels reguleren.

Het bovenstaande protocol beschrijft de experimentele procedures voor de live-cell imaging van spreading cells en een computational tool voor de kwantitatieve analyse van celspreidingsdynamiek. De computationele tool kan worden gebruikt in een formaat met lage of hoge doorvoer om de moleculaire spelers te identificeren die de actinepolymerisatiemachines aan de voorrand van de cel reguleren.
De schematische weergave van de experimentele procedures is weergegeven in figuur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

In dit protocol presenteren we de experimentele procedures van een celverspreidende test die is gebaseerd op live-cell microscopie. We bieden een open-source computationele tool voor de onbevooroordeede segmentatie van fluorescerend gelabelde cellen en kwantitatieve analyse van lamellipodiadynamiek tijdens celverspreiding.

Kwantitatieve analyse van celranddynamiek tijdens celspreiding

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Het protocol dat in deze video wordt beschreven, definieert de experimentele procedures die nodig zijn voor de levensgrote beeldvorming van spreidcellen en het gebruik van een computationele tool die cellen kwantificeert die dynamiek op een onbevooroordeide en geautomatiseerde manier verspreiden. Het celverspreidende activum maakt het mogelijk om de beweging van de celrand en morfologische veranderingen tijdens het verspreiden van cellen continu bij te houden, wat een kenmerk is dat ontbreekt in de meeste bestaande celverspreidingstesten. Dit protocol implementeert ook het gebruik van geautomatiseerde computerverwerking en -analyse, met informatie over celcirculaire, gebieds- en uitsteekcycli van spreidcellen.Een dergelijke geautomatiseerde verwerking vermindert bias in gegevensanalyse en biedt een robuuste methode voor het analyseren van celverspreidingsdynamiek voor een groot aantal cellen. In combinatie met medicamenteuze behandelingen of genwetenschap en -technieken is dit protocol vatbaar voor grootschalige snelheden van moleculaire spelers die celuitsteeksels reguleren. Voor het gegeven protocol, De gebruikte cellen zijn muis embryonale fibroblasten die ph-akt-GFP genetisch coderen, die de fluorescerende tagging van het plasmamembraan mogelijk maakt.Vóór het begin van de celverspreidingstest, kweek een schaal van cellen tot 90%samenvloeiing. Zodra de cellen de juiste samenvloeiing hebben bereikt, vlam een 22 bij 22 millimeter afdekslip en plaats deze in een 35 millimeter celkweekschaal. Bedek de afdeklip met fibronectine dat in PBS is verdund tot een concentratie van 2,5 microgram per milliliter.Plaats de schaal met de dekselslip een uur in een incubator van 37 graden. Na een uur aspireren de fibronectine ervoor te zorgen dat u de afdekslip niet aanraakt met de pipetpunt. Was de schaal met PBS door de afdekstrip twee tot drie keer voorzichtig rond de afdeklip te gieten.Voor het zaaien van cellen begint u met het aspireren van de celkweekmedia uit de schaal van cellen. Was daarna de schaal met warme PBS. Voeg 650 microliter trypsine EDTA toe aan de schaal en kantel de schaal om het enzym gelijkmatig te verdelen.Plaats de schaal met de trypsine een minuut in de incubator. Na incubatie moet u eerst 10 milliliter celkweekmedia toevoegen aan een centrifugebuis. Voeg vervolgens snel nog eens 10 milliliter media toe aan de schaal om de trypsine te doven.Om de cellen die op de afdekstrook worden gezaaid te verdunnen, spuit u een milliliter van de inhoud van de schaal in de centrifugebuis. Pipetteer vanuit de buis ongeveer 500 tot 1.000 microliter verdunde cellen in de schaal met de afdekslip. Zorg ervoor dat de afdekstrook 10% samenvloeit of 50.000 cellen per milliliter en pas het volume verdunde cellen zo nodig aan.Het doel van deze cellen is om een scherpstelvlak te creëren tijdens het verkrijgen van afbeeldingen. Met de resterende cellen in de schaal, passage een vijfde van de cellen in een kleine schaal per behandeling. Dit zijn de cellen die worden geanalyseerd voor het verspreiden van dynamiek.Plaats de doorgangsschalen en de afdekschaal acht tot 24 uur in een incubator. Om het belang van Arp2/3 voor celverspreiding te testen, voegt u eerst vijf milliliter celkweekmedia toe aan een controle- en een behandelingscentrifugebuis. Voeg vervolgens 20 milliliter dmem zonder fenolrood toe aan elk van de twee grotere centrifugebuizen.Pipetteer ofwel het medicijn CK-666 dat een remmer is van het Arp2/3-complex of de gecontroleerde behandeling zoals DMSO in de kleine en grote buizen. Om te beginnen met de farmacologische behandeling van de cellen, verwijdert u de passageschotels die 's nachts werden geïncubeerd. Aspireer de celkweekmedia uit alle gerechten en was de afwas met warme PBS.Neem de kleine buisjes met CK-666 of bedien aangevulde media en voeg de inhoud van de betreffende buis toe aan elk van de passageschalen. Etiketeer elk van de gerechten met de juiste medicamenteuze behandeling en plaats de gerechten vervolgens een extra uur terug in de incubator Na een uur incubatie, aspireer het medicijn aangevulde media uit elk van de gerechten. Voeg vervolgens warme PBS toe aan alle gerechten om alle resterende fenolrode media grondig te verwijderen.Voeg 230 microliter trypsine EDTA toe en doe de gerechten een minuut in een incubator. Verwijder de trypsinized gerechten uit de incubator en ga verder met het toevoegen van vijf milliliter van het medicijn aangevuld dmem dat fenolrood mist in een buis die is aangeduid als buis B.Voeg vervolgens nog eens vijf milliliter van hetzelfde medium toe aan de relevante schaal om de trypsine te doven. Pipetteer de media meerdere keren op en neer om alle cellen van de schaal los te maken.Breng alle inhoud van de schaal over in een andere buis die al is aangewezen als buis A.In om een celverdunning te bereiden die geschikt is voor beeldvorming, breng een milliliter cellen over van buis A naar buis B.Herhaal alle verdunningsstappen voor elke behandeling. Plaats alle buizen gedurende 45 minuten in de incubator om cellen te laten herstellen van trypsinisatie. Zorg ervoor dat alle delen van een celmagnetische kamer die geschikt zijn voor een afdekkingsslip van 22 bij 22 millimeter voor gebruik grondig zijn gereinigd.Verwijder de schaal met de afdekstrip uit de incubator. Aspireer de celkweekmedia en was de afdekstrip met warme PBS. Verwijder de afdekslip met een tang en leg de afdekstrip voorzichtig op de bodemplaat van de magneetkamer.Pak vervolgens de siliconen pakking op en plaats deze bovenop de afdekslip. Bevestig het hoofdlichaam van de magnetische kamer op de bodemplaat. Voeg een milliliter dmem zonder fenolrood toe die overeenkomt met de relevante behandeling in de magnetische kamer.Neem een pluisvrij weefsel en dep de behuizing voorzichtig tussen het hoofdlichaam en de bodemplaat om te controleren op eventuele lekken. Om de magnetische kamer te voltooien, laat u het transparante deksel op het hoofdlichaam zakken. Veeg ten slotte de bodem van de afdekstrip af met een tissue besproeid met water en een andere besproeid met 70% ethanol.Verwarm de stage top incubator van een confocale microscoop voor op 37 graden. Plaats de magneetkamer bovenop het doel. Voordat u de spreaddynamiek verwerft, stelt u de focus op de reeds gepolariseerde cellen in het groene fluorescerende kanaal.Dit zorgt ervoor dat de spreidcellen scherp zijn zodra ze zich aan de afdekstrip hechten. Verwijder het transparante deksel van de magnetische kamer en pipet 500 microliter uit buis B die uit de incubator is verwijderd. Plaats de transparante hoes er weer bovenop.Om cellen te identificeren die ideaal zijn voor celverspreidingsanalyse, zoekt u naar groene halo's die cellen vertegenwoordigen die zich nog aan de afdekstrook moeten hechten of zich in de vroegste stadia van aanhechting bevinden. Verzamel afbeeldingen en sla de bestanden op. Nadat u de beeldverwerving van celverspreiding hebt voltooid, begint u met het uitvoeren van een compatibele Python IDE zoals Spyder.Voor de berekeningsanalyse van de dynamiek van celverspreiding zoekt en opent u het GUI-bestand voor celverspreiding in de relevante scriptpakketten. Druk op de run-knop die het analyse-GUI-paneel op de achtergrond opent. De GUI bevat alle instellingen die nodig zijn voor analyse.Als u het celgebied en de circulariteit wilt analyseren, voert u het acquisitiebestand en de benodigde instellingen in op het tabblad celspreidingsgebied. Aanpassingen moeten worden uitgevoerd afhankelijk van het celtype en de parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen. Nadat u op uitvoeren hebt gedrukt, wordt een celcirculaire en gebied versus tijdplot gemaakt voor alle spreidcellen.Voor kymografische gegevens drukt u op de kymografische generator en het analysetabblad. Voor deze analyse moeten invoerbestanden worden bijgesneden met afbeeldingsstapels met één cel. Nadat alle instellingen zijn ingevoegd en op uitvoeren is gedrukt, maakt het script meerdere kymografieën voor de opgegeven cel.Aan de linkerkant bevinden zich representatieve cellen van de DMSO- en CK-666-behandelingen, automatisch gesegmenteerd met behulp van het meegeleverde script. In tegenstelling tot de isotrope en zeer circulaire morfologie die door controlecellen wordt aangetoond, vertonen Arp2/3 geremde cellen een verminderde circulariteit. Bovendien bieden de automatisch gegenereerde kymografieën een tijdelijke resolutie die van cruciaal belang is voor het begrijpen van de dynamiek van uitsteeksels.Controlecellen steken hardnekkig uit met weinig tot geen intrekingen. Arp2/3-remming verstoort daarentegen de stabiliteit van uitsteeksels, zoals blijkt uit de toename van retractiegebeurtenissen tijdens de verspreiding. Deze video's moeten u inzicht geven in hoe u cellen op de juiste manier kunt zaaien, farmacologische behandelingen kunt uitvoeren en beeldvormings- en rekentools kunt voorbereiden die nodig zijn voor de kwantificering van de celverspreidingsdynamiek.Dit protocol kan verder worden gecombineerd met cytoskelet fluorescerende beeldvorming en migratietesten om de moleculaire spelers te identificeren die celuitsteeksels besturen. Bedankt voor het kijken en veel succes met je experimenten.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Montage, laden, en uitlijning van een Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell imaging en kwantitatieve analyse van de embryonale epitheelcellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Het bepalen van het aantal cellen tijdens de celdeling Cultuur met de Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Een kwantitatieve analyse Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Surface Het verspreiden en Immunokleuring van Gist Chromosomen

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Lens-gratis videomicroscopie voor de dynamiek en de kwantitatieve analyse van aanhangend celkweek

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...