Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch den Connaught Fund New Investigator Award an S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (Grants RGPIN-2015-05114 und RGPIN-2020-05881), University of Manchester und University of Toronto Joint Research Fund und University of Toronto XSeed Program unterstützt.

1. Zellsaatierung
HINWEIS: Das beschriebene Zellstreuprotokoll wurde mit embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus durchgeführt, die PH-Akt-GFP (ein fluoreszierender Marker für PIP3/PI(3,4)P2) exdrücken. Diese Zelllinie wurde durch die genomische Integration eines Expressionskonstrukts für PH-Akt-GFP (Addgene #21218) durch CRISPR-vermittelte Genbearbeitung erzeugt. In diesem Test können jedoch auch andere fluoreszierende Marker verwendet werden, die vorübergehend expri...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

Der beschriebene Zellstreutest ermöglicht die kontinuierliche Verfolgung morphologischer Veränderungen(z. B. Zellgröße und -form) und Zellkantenbewegungen(d. h. Vorsprunggeschwindigkeit und Rückzugshäufigkeit), die in den meisten Zellstreuprotokollen19,24fehlen. Während häufig verwendete Endpunktzellstreuungs-Assays die Bestimmung der Zellstreugeschwindigkeit ermöglichen, können diese Assays die zeitliche Dynamik von Zellkantenbewegung...

Lamellipodiale Vorsprünge sind prominente zytoskelettale Strukturen, die an der Vorderseite einer wandernden Zelle gebildet werden. In lamellipodien erzeugt die Polymerisation von Actin mit Hilfe des Arp2/3-Komplexes und der Formine ein schnell wachsendes verzweigtes Aktin-Netz, das gegen die Plasmamembran1,2drückt. Die schubsende Kraft, die durch das Aktin-Netz erzeugt wird, treibt die Zelle physisch nach vorne1,3,4,5. Erschöpfung des Arp2/3-Komplexes oder Störung der Signalwege, die für lamellipodiale Vorsprünge unerlässlich sind, beeinträchtigen häufig die Zellmigration6, 7. Obwohl die Migration von Lamellipodie-defiziden Zellen ebenfalls berichtet wurde8,9, ist die Bedeutung der Lamellipodie bei der Zellmigration offensichtlich, da die Erschöpfung dieser protrusiven Struktur die Fähigkeit der Zelle stört, sich durch komplexe biologische Mikroumgebungen zu bewegen6,10.
Ein großes Hindernis für das Verständnis der Regulation von Lamellipodie n. B. in wandernden Zellen ist die natürliche Variabilität in der lamellipodialen Protrusionskinetik, Größe und Form11,12,13,14. Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass Lamellipodie komplexe protrusive Verhaltensweisen aufweisen, einschließlich schwankender, periodischer und beschleunigender Vorsprünge14,15. Im Vergleich zu den hochvariablen Lamellipodien der wandernden Zellen6,16sind Lamellipodien, die bei der Zellausbreitung gebildet werden, gleichmäßiger12. Da die protrusive Aktivität der Sichtung und Migration von Zellen durch identische makromolekulare Baugruppen angetrieben wird, die ein verzweigtes Aktin-Netzwerk, kontraktile Actomyosin-Bündel und integrinbasierte Zellmatrix-Adhäsionen17,18umfassen, wurden Streuzellen weithin als Modell für die Untersuchung der Regulation der Lamellipodie-Dynamik verwendet.
Zellstreuung ist ein dynamischer mechanochemischer Prozess, bei dem eine Zelle in Suspension zuerst durch integrinbasierte Adhäsionen17,19,20 an einem Substrat haftet und sich dann durch Verlängerung der aktinbasierten Vorsprünge21,22,23ausbreitet. Während der Ausbreitungsphase ragen Lamellipodieaus dem Zellkörper istisch und anhaltend heraus, ohne dass es sich um ein Zurückziehen oder Stocken12geht. Die am häufigsten verwendeten Zellstreuprotokolle sind Endpunkt-Assays, bei denen Streuzellen nach der Beschichtung19,24zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert werden. Diese Assays sind zwar schnell und einfach, aber in ihrer diagnostischen Leistungsfähigkeit begrenzt, um Veränderungen in den dynamischen Merkmalen der Lamellipodie zu erkennen. Um die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die die Lamellipodie-Dynamik steuern, war die Sheetz-Gruppe Vorreiter bei der quantitativen Analyse von lebenden Streuzellen und deckte viele grundlegende Eigenschaften von Zellrandvorsprüngenauf 11,12,22. Diese Studien haben gezeigt, dass der Live-Zell-Verbreitungstest eine robuste und leistungsstarke Technik in der Werkzeugkiste eines Zellbiologielabors ist. Trotzdem sind ein detailliertes Protokoll und Ein-Quell-Rechentool für einen Live-Zell-Verbreitungstest derzeit für die Zellbiologie-Community nicht verfügbar. Zu diesem Zweck skizziert unser Protokoll die Verfahren zur Abbildung von lebenden Streuzellen und stellt ein automatisiertes Bildanalysetool zur Verfügung. Um diese Methode zu validieren, verwendeten wir die Arp2/3-Hemmung als experimentelle Behandlung und zeigten, dass die Hemmung der Funktion des Arp2/3-Komplexes die Zellausbreitung nicht festhielt, sondern eine signifikante Verringerung der Zellvorsprunggeschwindigkeit sowie die Stabilität von Zellkantenvorsprüngen verursachte, was zu gezackten Zellkanten führte. Diese Daten zeigen, dass die Kombination von Live-Zell-Bildgebung und automatisierter Bildanalyse ein nützliches Werkzeug ist, um die Zellkantendynamik zu analysieren und molekulare Komponenten zu identifizieren, die Lamellipodie regulieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

Die Zellstreuung ist ein dynamischer Prozess, bei dem eine in Medien aufgehängte Zelle an einem Substrat befestigt wird und sich von einer abgerundeten zu einer dünnen und ausgebreiteten Form abflacht. Nach der Zellsubstrat-Anhaftung bildet die Zelle ein dünnes Blatt Lamellipodie, das aus dem Zellkörper ausgeht. In der Lamellipodia polymerisieren kugelförmige Actin-Monomere (G-Actin) in ein dichtes fadenförmiges Actin-Netz (F-Actin), das gegen die Plasmamembran drückt und so die mechanischen Kräfte bereitstellt, die für die Ausbreitung der Zelle erforderlich sind. Insbesondere die molekularen Akteure, die die Actin-Polymerisation in Lamellipodien steuern, sind für viele andere zelluläre Prozesse, wie Zellmigration und Endozytose, von wesentlicher Bedeutung. 
Da sich streuende Zellen zu einer kontinuierlichen Lamellipodie bilden, die sich über die gesamte Zellperipherie erstrecken und sich dauerhaft nach außen ausdehnen, sind Zellstreuungstests zu einem effizienten Werkzeug geworden, um die Kinetik lamellipodischer Vorsprünge zu bewerten. Obwohl mehrere technische Implementierungen des Zellstreu-Assays entwickelt wurden, fehlt derzeit eine detaillierte Beschreibung des Workflows, die sowohl ein Schritt-für-Schritt-Protokoll als auch Rechenwerkzeuge für die Datenanalyse umfassen würde. Hier beschreiben wir die experimentellen Verfahren des Zellstreu-Assays und präsentieren ein Open-Source-Tool zur quantitativen und unvoreingenommenen Analyse der Zellkantendynamik während der Ausbreitung. In Kombination mit pharmakologischen Manipulationen und/oder Gen-Silencing-Techniken ist dieses Protokoll für einen groß angelegten Bildschirm von molekularen Akteuren zugänglich, die lamellipodiale Vorsprünge regulieren.

Das obige Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren zur Live-Zell-Bildgebung von Streuzellen und ein Rechenwerkzeug für die quantitative Analyse der Zellstreudynamik. Das Rechenwerkzeug kann in einem Format mit niedrigem oder hohem Durchsatz verwendet werden, um die molekularen Akteure zu identifizieren, die die Aktinpolymerisationsmaschinerie an der Zellvorderkante regulieren.
Die schematische Darstellung der experimentellen Verfahren ist in Abbildung 1...

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Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

In diesem Protokoll stellen wir die experimentellen Verfahren eines Zellstreu-Assays vor, der auf der Live-Zellmikroskopie basiert. Wir bieten ein Open-Source-Rechenwerkzeug für die unvoreingenommene Segmentierung fluoreszierend markierter Zellen und die quantitative Analyse der Lamellipodie-Dynamik während der Zellstreuung.

Quantitative Analyse der Zellkantendynamik während der Zellstreuung

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Das in diesem Video beschriebene Protokoll definiert die experimentellen Verfahren, die für die lebensgroße Bildgebung von Streuzellen und den Einsatz eines Rechenwerkzeugs erforderlich sind, das die Ausbreitungsdynamik von Zellen unvoreingenommen und automatisiert quantifiziert. Das Zellstreuungsvermögen ermöglicht die kontinuierliche Verfolgung der Zellkantenbewegung und morphologische Veränderungen während der Zellstreuung, was ein Merkmal ist, das in den meisten vorhandenen Zellstreuungstests fehlt. Darüber hinaus implementiert dieses Protokoll den Einsatz automatisierter Computerverarbeitung und -analyse und liefert Informationen über Zellzirkularität, Fläche und Vorzugsrückziehzyklen von Streuzellen.Eine solche automatisierte Verarbeitung reduziert Verzerrungen in der Datenanalyse und bietet eine robuste Methode zur Analyse der Zellstreudynamik für eine große Anzahl von Zellen. In Kombination mit medikamentösen Behandlungen oder Genwissenschaften und -techniken ist dieses Protokoll für große Geschwindigkeiten molekularer Akteure geeignet, die Zellvorsprünge regulieren. Für das gegebene Protokoll, Die verwendeten Zellen sind Maus embryonale Fibroblasten, die PH-Akt-GFP genetisch kodieren, die für die fluoreszierende Markierung der Plasmamembran ermöglicht.Vor dem Beginn des Zellstreuungsassays, Kultur eine Schale von Zellen zu 90%Konfluenz. Sobald die Zellen die richtige Konfluenz erreicht haben, entflammen Sie einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckel und legen Sie ihn in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale. Beschichten Sie den Deckelschlupf mit Fibronectin, das in PBS auf eine Konzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt wurde.Legen Sie die Schale mit dem Deckel schlupfen in einen 37-Grad-Inkubator für eine Stunde. Nach einer Stunde das Fibronectin ansaugen, um sicherzustellen, dass der Deckelrutsch nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Waschen Sie die Schale mit PBS, indem Sie sanft um die Abdeckung rutschen zwei bis drei Mal.Für die Zellaussaat beginnen Sie mit der Ansaugung der Zellkulturmedien aus dem Teller der Zellen. Danach die Schale mit warmen PBS waschen. Fügen Sie 650 Mikroliter Trypsin EDTA in die Schale und neigen Sie die Schale, um das Enzym gleichmäßig zu verteilen.Legen Sie das Gericht mit dem Trypsin für eine Minute in den Inkubator. Nach der Inkubation müssen Sie zunächst 10 Milliliter Zellkulturmedien in ein Zentrifugenrohr geben. Als nächstes fügen Sie schnell weitere 10 Milliliter Medien in die Schale, um das Trypsin zu löschen.Um die Zellen, die auf den Deckel ausgesät werden, zu verdünnen, pipette einen Milliliter des Inhalts der Schale in das Zentrifugenrohr. Aus dem Rohr, Pipette etwa 500 bis 1.000 Mikroliter verdünnte Zellen in die Schale mit dem Deckel schlupf. Stellen Sie sicher, dass der Abdeckschlupf bei einer Konfluenz von 10 % oder 50 000 Zellen pro Milliliter liegt, und passen Sie das Volumen der verdünnten Zellen nach Bedarf an.Der Zweck dieser Zellen ist es, eine Ebene des Fokus während der Bildaufnahme zu etablieren. Mit den restlichen Zellen in der Schale, geben Sie ein Fünftel der Zellen in eine kleine Schale pro Behandlung. Dies sind die Zellen, die für die Verbreitung von Dynamik analysiert werden.Legen Sie die Durchgangsschüssel und die Deckschale acht bis 24 Stunden lang in einen Inkubator. Um die Bedeutung von Arp2/3 für die Zellstreuung zu testen, fügen Sie zunächst fünf Milliliter Zellkulturmedien in ein Kontroll- und ein Behandlungszentrifugenrohr ein. Als nächstes fügen Sie 20 Milliliter dmem, die Phenol rot fehlt in jedem der beiden größeren Zentrifugenrohre fehlt.Pipette entweder das Medikament CK-666, das ein Inhibitor des Arp2/3-Komplexes ist, oder die kontrollierte Behandlung wie DMSO in die kleinen und großen Schläuche. Um mit der pharmakologischen Behandlung der Zellen zu beginnen, entfernen Sie die Durchgangsgerichte, die über Nacht inkubiert wurden. Aspirieren Sie die Zellkulturmedien aus allen Gerichten und waschen Sie das Geschirr mit warmen PBS.Nehmen Sie die kleinen Röhren, die entweder CK-666 enthalten oder zusätzliche Medien steuern, und fügen Sie den Inhalt der entsprechenden Röhre in jedes der Durchgangsgeschirre ein. Etikettieren Sie jedes der Gerichte mit der richtigen medikamentösen Behandlung und legen Sie die Gerichte dann wieder in den Brutkasten für eine zusätzliche Stunde Nach einer Stunde Inkubation, aspirieren Sie das Medikament ergänzt Medien von jedem der Gerichte. Als nächstes fügen Sie warme PBS zu allen Gerichten hinzu, um alle verbleibenden phenolroten Medien gründlich zu entfernen.Fügen Sie 230 Mikroliter Trypsin EDTA hinzu und legen Sie das Geschirr für eine Minute in einen Brutkasten. Entfernen Sie die trypsinisierten Gerichte aus dem Inkubator und fahren Sie fort, fünf Milliliter des Medikaments ergänzt dmem, die Phenol rot in eine Röhre als Tube B bezeichnet fehlt hinzufügen. Dann fügen Sie weitere fünf Milliliter des gleichen Mediums in die entsprechende Schale, um das Trypsin zu löschen. Pipette die Medien auf und ab mehrmals, um alle Zellen von der Schale zu lösen.Übertragen Sie den gesamten Inhalt der Schale in ein anderes Rohr, das bereits als Rohr bezeichnet wurde, A.In um eine zellgebende Zellverdünnung vorzubereiten, einen Milliliter Zellen aus Tube A in Tube B zu übertragen. Wiederholen Sie alle Verdünnungsschritte für jede Behandlung. Legen Sie alle Röhren für 45 Minuten in den Inkubator, damit sich die Zellen von der Trypsinisierung erholen können. Stellen Sie sicher, dass alle Teile einer Zellmagnetkammer, die einen 22 mal 22 Millimeter großen Abdeckschlupf aufnehmen kann, vor dem Gebrauch gründlich gereinigt wurden.Entfernen Sie die Schale mit dem Deckelschlupf aus dem Inkubator. Die Zellkulturmedien ansaugen und den Deckelschlupf mit warmen PBS waschen. Entfernen Sie den Deckelschlupf mit einem Zangenpaar und legen Sie den Deckelschlupf vorsichtig auf die Bodenplatte der Magnetkammer.Als nächstes nehmen Sie die Silikondichtung auf und legen Sie sie auf den Deckelschlupf. Befestigen Sie den Hauptkörper der Magnetkammer an der Bodenplatte. Fügen Sie einen Milliliter des dmem fehlt Phenolrot entsprechend der entsprechenden Behandlung der Magnetkammer.Nehmen Sie ein fusselfreies Gewebe und tupferen Sie sorgfältig das Gehäuse zwischen dem Hauptkörper und der Bodenplatte, um auf Leckagen zu überprüfen. Um die magnetische Kammer zu vervollständigen, senken Sie die transparente Abdeckung auf den Hauptkörper. Wischen Sie schließlich den Boden des Deckels mit einem mit Wasser besprühten Gewebe und einem weiteren mit 70% Ethanol besprühten Gewebe ab.Den Bühnen-Top-Inkubator eines konfokalen Mikroskops auf 37 Grad vorheizen. Platzieren Sie die magnetische Kammer auf dem Objektiv. Bevor Sie die Ausbreitungsdynamik erfassen, richten Sie den Fokus auf die bereits polarisierten Zellen im grünen Fluoreszenzkanal.Dadurch wird sichergestellt, dass die Streuzellen im Fokus stehen, sobald sie sich am Deckbedeckungsschlupf anheften. Entfernen Sie die transparente Abdeckung der Magnetkammer und Pipette 500 Mikroliter aus Rohr B, das aus dem Inkubator entfernt wurde. Legen Sie die transparente Abdeckung wieder oben.Um Zellen zu identifizieren, die ideal für die Zellstreuanalyse sind, suchen Sie nach grünen Halos, die Zellen darstellen, die sich noch nicht an den Deckbedeckungsbeleg anheften müssen oder sich in den frühesten Phasen der Befestigung befinden. Erfassen Sie Bilder und speichern Sie die Dateien. Nachdem Sie die Bildaufnahme der Zellverteilung abgeschlossen haben, führen Sie zunächst eine kompatible Python-IDE wie Spyder aus.Für die Berechnungderanalyse der Zellstreudynamik, suchen und öffnen Sie die in den entsprechenden Skriptpaketen bereitgestellte GUI-Datei zum Verteilen von Zellen. Drücken Sie die Run-Taste, die das Analyse-GUI-Bedienfeld im Hintergrund öffnet. Die GUI enthält alle Einstellungen, die für die Analyse erforderlich sind.Um den Zellbereich und die Zirkularität zu analysieren, geben Sie die Erfassungsdatei und die erforderlichen Einstellungen auf der Registerkarte Zellstreubereich ein. Je nach Zelltyp und Bildaufnahmeparametern müssen Anpassungen vorgenommen werden. Nach dem Drücken der Ausführung erstellt das Skript eine Zellzirkularität und ein Flächendiagramm im Vergleich zum Zeitdiagramm für alle sich ausbreitenden Zellen.Für Kymographendaten drücken Sie den Kymographengenerator und die Registerkarte Analyse. Für diese Analyse müssen Eingabedateien zugeschnittene Einzelzellen-Bildstapel werden. Nach dem Einfügen aller Einstellungen und der Ausführung summiert sich das Skript mit mehreren Kymographen für die angegebene Zelle.Auf der linken Seite befinden sich repräsentative Zellen der DMSO- und CK-666-Behandlungen, die automatisch mit dem bereitgestellten Skript segmentiert werden. Im Gegensatz zur isotropen und hochkreisförmigen Morphologie, die von Kontrollzellen nachgewiesen wird, weisen Arp2/3-hemmende Zellen eine verminderte Zirkularität auf. Darüber hinaus bieten die automatisch generierten Kymographen eine zeitliche Auflösung, die für das Verständnis der Dynamik von Vorsprüngen entscheidend ist.Kontrollzellen ragen hartnäckig und ohne bis gar keine Rückzüge hervor. Im Gegensatz dazu stört die Arp2/3-Hemmung die Stabilität der Vorsprünge, wie die Zunahme der Rückzugsereignisse während der gesamten Ausbreitung zeigt. Diese Videos sollen Ihnen das Verständnis dafür vermitteln, wie Sie Zellen richtig aussät, pharmakologische Behandlungen durchführen und bildgebende und computergestützte Werkzeuge vorbereiten können, die für die Quantifizierung der Zellausbreitungsdynamik erforderlich sind.Dieses Protokoll kann weiter mit zytoskelett-fluoreszierenden Bildgebungs- und Migrationstests kombiniert werden, um die molekularen Akteure zu identifizieren, die Zellvorsprünge bestimmen. Vielen Dank für Das Zuschauen und viel Glück mit Ihren Experimenten.

quantitative-analysis-of-cell-edge-dynamics-during-cell-spreading

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Forschung

Biologie

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Oberfläche Verbreitung und Immunfärbung von Hefechromosomen

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Live Cell Fluoreszenzmikroskopie um wesentliche Vorgänge während der mikrobiellen Zellwachstum beobachten

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Objektiv-kostenlose Videomikroskopie für die Dynamik und Quantitative Analyse der adhärente Zellkultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.