Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
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Diese Arbeit wurde durch den Connaught Fund New Investigator Award an S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (Grants RGPIN-2015-05114 und RGPIN-2020-05881), University of Manchester und University of Toronto Joint Research Fund und University of Toronto XSeed Program unterstützt.

1. Zellsaatierung
HINWEIS: Das beschriebene Zellstreuprotokoll wurde mit embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus durchgeführt, die PH-Akt-GFP (ein fluoreszierender Marker für PIP3/PI(3,4)P2) exdrücken. Diese Zelllinie wurde durch die genomische Integration eines Expressionskonstrukts für PH-Akt-GFP (Addgene #21218) durch CRISPR-vermittelte Genbearbeitung erzeugt. In diesem Test können jedoch auch andere fluoreszierende Marker verwendet werden, die vorübergehend expri...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

Der beschriebene Zellstreutest ermöglicht die kontinuierliche Verfolgung morphologischer Veränderungen(z. B. Zellgröße und -form) und Zellkantenbewegungen(d. h. Vorsprunggeschwindigkeit und Rückzugshäufigkeit), die in den meisten Zellstreuprotokollen19,24fehlen. Während häufig verwendete Endpunktzellstreuungs-Assays die Bestimmung der Zellstreugeschwindigkeit ermöglichen, können diese Assays die zeitliche Dynamik von Zellkantenbewegung...

Lamellipodiale Vorsprünge sind prominente zytoskelettale Strukturen, die an der Vorderseite einer wandernden Zelle gebildet werden. In lamellipodien erzeugt die Polymerisation von Actin mit Hilfe des Arp2/3-Komplexes und der Formine ein schnell wachsendes verzweigtes Aktin-Netz, das gegen die Plasmamembran1,2drückt. Die schubsende Kraft, die durch das Aktin-Netz erzeugt wird, treibt die Zelle physisch nach vorne1,3,4,5. Erschöpfung des Arp2/3-Komplexes oder Störung der Signalwege, die für lamellipodiale Vorsprünge unerlässlich sind, beeinträchtigen häufig die Zellmigration6, 7. Obwohl die Migration von Lamellipodie-defiziden Zellen ebenfalls berichtet wurde8,9, ist die Bedeutung der Lamellipodie bei der Zellmigration offensichtlich, da die Erschöpfung dieser protrusiven Struktur die Fähigkeit der Zelle stört, sich durch komplexe biologische Mikroumgebungen zu bewegen6,10.
Ein großes Hindernis für das Verständnis der Regulation von Lamellipodie n. B. in wandernden Zellen ist die natürliche Variabilität in der lamellipodialen Protrusionskinetik, Größe und Form11,12,13,14. Darüber hinaus haben neuere Studien gezeigt, dass Lamellipodie komplexe protrusive Verhaltensweisen aufweisen, einschließlich schwankender, periodischer und beschleunigender Vorsprünge14,15. Im Vergleich zu den hochvariablen Lamellipodien der wandernden Zellen6,16sind Lamellipodien, die bei der Zellausbreitung gebildet werden, gleichmäßiger12. Da die protrusive Aktivität der Sichtung und Migration von Zellen durch identische makromolekulare Baugruppen angetrieben wird, die ein verzweigtes Aktin-Netzwerk, kontraktile Actomyosin-Bündel und integrinbasierte Zellmatrix-Adhäsionen17,18umfassen, wurden Streuzellen weithin als Modell für die Untersuchung der Regulation der Lamellipodie-Dynamik verwendet.
Zellstreuung ist ein dynamischer mechanochemischer Prozess, bei dem eine Zelle in Suspension zuerst durch integrinbasierte Adhäsionen17,19,20 an einem Substrat haftet und sich dann durch Verlängerung der aktinbasierten Vorsprünge21,22,23ausbreitet. Während der Ausbreitungsphase ragen Lamellipodieaus dem Zellkörper istisch und anhaltend heraus, ohne dass es sich um ein Zurückziehen oder Stocken12geht. Die am häufigsten verwendeten Zellstreuprotokolle sind Endpunkt-Assays, bei denen Streuzellen nach der Beschichtung19,24zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert werden. Diese Assays sind zwar schnell und einfach, aber in ihrer diagnostischen Leistungsfähigkeit begrenzt, um Veränderungen in den dynamischen Merkmalen der Lamellipodie zu erkennen. Um die molekularen Mechanismen zu bestimmen, die die Lamellipodie-Dynamik steuern, war die Sheetz-Gruppe Vorreiter bei der quantitativen Analyse von lebenden Streuzellen und deckte viele grundlegende Eigenschaften von Zellrandvorsprüngenauf 11,12,22. Diese Studien haben gezeigt, dass der Live-Zell-Verbreitungstest eine robuste und leistungsstarke Technik in der Werkzeugkiste eines Zellbiologielabors ist. Trotzdem sind ein detailliertes Protokoll und Ein-Quell-Rechentool für einen Live-Zell-Verbreitungstest derzeit für die Zellbiologie-Community nicht verfügbar. Zu diesem Zweck skizziert unser Protokoll die Verfahren zur Abbildung von lebenden Streuzellen und stellt ein automatisiertes Bildanalysetool zur Verfügung. Um diese Methode zu validieren, verwendeten wir die Arp2/3-Hemmung als experimentelle Behandlung und zeigten, dass die Hemmung der Funktion des Arp2/3-Komplexes die Zellausbreitung nicht festhielt, sondern eine signifikante Verringerung der Zellvorsprunggeschwindigkeit sowie die Stabilität von Zellkantenvorsprüngen verursachte, was zu gezackten Zellkanten führte. Diese Daten zeigen, dass die Kombination von Live-Zell-Bildgebung und automatisierter Bildanalyse ein nützliches Werkzeug ist, um die Zellkantendynamik zu analysieren und molekulare Komponenten zu identifizieren, die Lamellipodie regulieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

Die Zellstreuung ist ein dynamischer Prozess, bei dem eine in Medien aufgehängte Zelle an einem Substrat befestigt wird und sich von einer abgerundeten zu einer dünnen und ausgebreiteten Form abflacht. Nach der Zellsubstrat-Anhaftung bildet die Zelle ein dünnes Blatt Lamellipodie, das aus dem Zellkörper ausgeht. In der Lamellipodia polymerisieren kugelförmige Actin-Monomere (G-Actin) in ein dichtes fadenförmiges Actin-Netz (F-Actin), das gegen die Plasmamembran drückt und so die mechanischen Kräfte bereitstellt, die für die Ausbreitung der Zelle erforderlich sind. Insbesondere die molekularen Akteure, die die Actin-Polymerisation in Lamellipodien steuern, sind für viele andere zelluläre Prozesse, wie Zellmigration und Endozytose, von wesentlicher Bedeutung. 
Da sich streuende Zellen zu einer kontinuierlichen Lamellipodie bilden, die sich über die gesamte Zellperipherie erstrecken und sich dauerhaft nach außen ausdehnen, sind Zellstreuungstests zu einem effizienten Werkzeug geworden, um die Kinetik lamellipodischer Vorsprünge zu bewerten. Obwohl mehrere technische Implementierungen des Zellstreu-Assays entwickelt wurden, fehlt derzeit eine detaillierte Beschreibung des Workflows, die sowohl ein Schritt-für-Schritt-Protokoll als auch Rechenwerkzeuge für die Datenanalyse umfassen würde. Hier beschreiben wir die experimentellen Verfahren des Zellstreu-Assays und präsentieren ein Open-Source-Tool zur quantitativen und unvoreingenommenen Analyse der Zellkantendynamik während der Ausbreitung. In Kombination mit pharmakologischen Manipulationen und/oder Gen-Silencing-Techniken ist dieses Protokoll für einen groß angelegten Bildschirm von molekularen Akteuren zugänglich, die lamellipodiale Vorsprünge regulieren.

Das obige Protokoll beschreibt die experimentellen Verfahren zur Live-Zell-Bildgebung von Streuzellen und ein Rechenwerkzeug für die quantitative Analyse der Zellstreudynamik. Das Rechenwerkzeug kann in einem Format mit niedrigem oder hohem Durchsatz verwendet werden, um die molekularen Akteure zu identifizieren, die die Aktinpolymerisationsmaschinerie an der Zellvorderkante regulieren.
Die schematische Darstellung der experimentellen Verfahren ist in Abbildung 1...

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Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

In diesem Protokoll stellen wir die experimentellen Verfahren eines Zellstreu-Assays vor, der auf der Live-Zellmikroskopie basiert. Wir bieten ein Open-Source-Rechenwerkzeug für die unvoreingenommene Segmentierung fluoreszierend markierter Zellen und die quantitative Analyse der Lamellipodie-Dynamik während der Zellstreuung.

Quantitative Analyse der Zellkantendynamik während der Zellstreuung

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Das in diesem Video beschriebene Protokoll definiert die experimentellen Verfahren, die für die lebensgroße Bildgebung von Streuzellen und den Einsatz eines Rechenwerkzeugs erforderlich sind, das die Ausbreitungsdynamik von Zellen unvoreingenommen und automatisiert quantifiziert. Das Zellstreuungsvermögen ermöglicht die kontinuierliche Verfolgung der Zellkantenbewegung und morphologische Veränderungen während der Zellstreuung, was ein Merkmal ist, das in den meisten vorhandenen Zellstreuungstests fehlt. Darüber hinaus implementiert dieses Protokoll den Einsatz automatisierter Computerverarbeitung und -analyse und liefert Informationen über Zellzirkularität, Fläche und Vorzugsrückziehzyklen von Streuzellen.Eine solche automatisierte Verarbeitung reduziert Verzerrungen in der Datenanalyse und bietet eine robuste Methode zur Analyse der Zellstreudynamik für eine große Anzahl von Zellen. In Kombination mit medikamentösen Behandlungen oder Genwissenschaften und -techniken ist dieses Protokoll für große Geschwindigkeiten molekularer Akteure geeignet, die Zellvorsprünge regulieren. Für das gegebene Protokoll, Die verwendeten Zellen sind Maus embryonale Fibroblasten, die PH-Akt-GFP genetisch kodieren, die für die fluoreszierende Markierung der Plasmamembran ermöglicht.Vor dem Beginn des Zellstreuungsassays, Kultur eine Schale von Zellen zu 90%Konfluenz. Sobald die Zellen die richtige Konfluenz erreicht haben, entflammen Sie einen 22 mal 22 Millimeter großen Deckel und legen Sie ihn in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale. Beschichten Sie den Deckelschlupf mit Fibronectin, das in PBS auf eine Konzentration von 2,5 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt wurde.Legen Sie die Schale mit dem Deckel schlupfen in einen 37-Grad-Inkubator für eine Stunde. Nach einer Stunde das Fibronectin ansaugen, um sicherzustellen, dass der Deckelrutsch nicht mit der Pipettenspitze berührt wird. Waschen Sie die Schale mit PBS, indem Sie sanft um die Abdeckung rutschen zwei bis drei Mal.Für die Zellaussaat beginnen Sie mit der Ansaugung der Zellkulturmedien aus dem Teller der Zellen. Danach die Schale mit warmen PBS waschen. Fügen Sie 650 Mikroliter Trypsin EDTA in die Schale und neigen Sie die Schale, um das Enzym gleichmäßig zu verteilen.Legen Sie das Gericht mit dem Trypsin für eine Minute in den Inkubator. Nach der Inkubation müssen Sie zunächst 10 Milliliter Zellkulturmedien in ein Zentrifugenrohr geben. Als nächstes fügen Sie schnell weitere 10 Milliliter Medien in die Schale, um das Trypsin zu löschen.Um die Zellen, die auf den Deckel ausgesät werden, zu verdünnen, pipette einen Milliliter des Inhalts der Schale in das Zentrifugenrohr. Aus dem Rohr, Pipette etwa 500 bis 1.000 Mikroliter verdünnte Zellen in die Schale mit dem Deckel schlupf. Stellen Sie sicher, dass der Abdeckschlupf bei einer Konfluenz von 10 % oder 50 000 Zellen pro Milliliter liegt, und passen Sie das Volumen der verdünnten Zellen nach Bedarf an.Der Zweck dieser Zellen ist es, eine Ebene des Fokus während der Bildaufnahme zu etablieren. Mit den restlichen Zellen in der Schale, geben Sie ein Fünftel der Zellen in eine kleine Schale pro Behandlung. Dies sind die Zellen, die für die Verbreitung von Dynamik analysiert werden.Legen Sie die Durchgangsschüssel und die Deckschale acht bis 24 Stunden lang in einen Inkubator. Um die Bedeutung von Arp2/3 für die Zellstreuung zu testen, fügen Sie zunächst fünf Milliliter Zellkulturmedien in ein Kontroll- und ein Behandlungszentrifugenrohr ein. Als nächstes fügen Sie 20 Milliliter dmem, die Phenol rot fehlt in jedem der beiden größeren Zentrifugenrohre fehlt.Pipette entweder das Medikament CK-666, das ein Inhibitor des Arp2/3-Komplexes ist, oder die kontrollierte Behandlung wie DMSO in die kleinen und großen Schläuche. Um mit der pharmakologischen Behandlung der Zellen zu beginnen, entfernen Sie die Durchgangsgerichte, die über Nacht inkubiert wurden. Aspirieren Sie die Zellkulturmedien aus allen Gerichten und waschen Sie das Geschirr mit warmen PBS.Nehmen Sie die kleinen Röhren, die entweder CK-666 enthalten oder zusätzliche Medien steuern, und fügen Sie den Inhalt der entsprechenden Röhre in jedes der Durchgangsgeschirre ein. Etikettieren Sie jedes der Gerichte mit der richtigen medikamentösen Behandlung und legen Sie die Gerichte dann wieder in den Brutkasten für eine zusätzliche Stunde Nach einer Stunde Inkubation, aspirieren Sie das Medikament ergänzt Medien von jedem der Gerichte. Als nächstes fügen Sie warme PBS zu allen Gerichten hinzu, um alle verbleibenden phenolroten Medien gründlich zu entfernen.Fügen Sie 230 Mikroliter Trypsin EDTA hinzu und legen Sie das Geschirr für eine Minute in einen Brutkasten. Entfernen Sie die trypsinisierten Gerichte aus dem Inkubator und fahren Sie fort, fünf Milliliter des Medikaments ergänzt dmem, die Phenol rot in eine Röhre als Tube B bezeichnet fehlt hinzufügen. Dann fügen Sie weitere fünf Milliliter des gleichen Mediums in die entsprechende Schale, um das Trypsin zu löschen. Pipette die Medien auf und ab mehrmals, um alle Zellen von der Schale zu lösen.Übertragen Sie den gesamten Inhalt der Schale in ein anderes Rohr, das bereits als Rohr bezeichnet wurde, A.In um eine zellgebende Zellverdünnung vorzubereiten, einen Milliliter Zellen aus Tube A in Tube B zu übertragen. Wiederholen Sie alle Verdünnungsschritte für jede Behandlung. Legen Sie alle Röhren für 45 Minuten in den Inkubator, damit sich die Zellen von der Trypsinisierung erholen können. Stellen Sie sicher, dass alle Teile einer Zellmagnetkammer, die einen 22 mal 22 Millimeter großen Abdeckschlupf aufnehmen kann, vor dem Gebrauch gründlich gereinigt wurden.Entfernen Sie die Schale mit dem Deckelschlupf aus dem Inkubator. Die Zellkulturmedien ansaugen und den Deckelschlupf mit warmen PBS waschen. Entfernen Sie den Deckelschlupf mit einem Zangenpaar und legen Sie den Deckelschlupf vorsichtig auf die Bodenplatte der Magnetkammer.Als nächstes nehmen Sie die Silikondichtung auf und legen Sie sie auf den Deckelschlupf. Befestigen Sie den Hauptkörper der Magnetkammer an der Bodenplatte. Fügen Sie einen Milliliter des dmem fehlt Phenolrot entsprechend der entsprechenden Behandlung der Magnetkammer.Nehmen Sie ein fusselfreies Gewebe und tupferen Sie sorgfältig das Gehäuse zwischen dem Hauptkörper und der Bodenplatte, um auf Leckagen zu überprüfen. Um die magnetische Kammer zu vervollständigen, senken Sie die transparente Abdeckung auf den Hauptkörper. Wischen Sie schließlich den Boden des Deckels mit einem mit Wasser besprühten Gewebe und einem weiteren mit 70% Ethanol besprühten Gewebe ab.Den Bühnen-Top-Inkubator eines konfokalen Mikroskops auf 37 Grad vorheizen. Platzieren Sie die magnetische Kammer auf dem Objektiv. Bevor Sie die Ausbreitungsdynamik erfassen, richten Sie den Fokus auf die bereits polarisierten Zellen im grünen Fluoreszenzkanal.Dadurch wird sichergestellt, dass die Streuzellen im Fokus stehen, sobald sie sich am Deckbedeckungsschlupf anheften. Entfernen Sie die transparente Abdeckung der Magnetkammer und Pipette 500 Mikroliter aus Rohr B, das aus dem Inkubator entfernt wurde. Legen Sie die transparente Abdeckung wieder oben.Um Zellen zu identifizieren, die ideal für die Zellstreuanalyse sind, suchen Sie nach grünen Halos, die Zellen darstellen, die sich noch nicht an den Deckbedeckungsbeleg anheften müssen oder sich in den frühesten Phasen der Befestigung befinden. Erfassen Sie Bilder und speichern Sie die Dateien. Nachdem Sie die Bildaufnahme der Zellverteilung abgeschlossen haben, führen Sie zunächst eine kompatible Python-IDE wie Spyder aus.Für die Berechnungderanalyse der Zellstreudynamik, suchen und öffnen Sie die in den entsprechenden Skriptpaketen bereitgestellte GUI-Datei zum Verteilen von Zellen. Drücken Sie die Run-Taste, die das Analyse-GUI-Bedienfeld im Hintergrund öffnet. Die GUI enthält alle Einstellungen, die für die Analyse erforderlich sind.Um den Zellbereich und die Zirkularität zu analysieren, geben Sie die Erfassungsdatei und die erforderlichen Einstellungen auf der Registerkarte Zellstreubereich ein. Je nach Zelltyp und Bildaufnahmeparametern müssen Anpassungen vorgenommen werden. Nach dem Drücken der Ausführung erstellt das Skript eine Zellzirkularität und ein Flächendiagramm im Vergleich zum Zeitdiagramm für alle sich ausbreitenden Zellen.Für Kymographendaten drücken Sie den Kymographengenerator und die Registerkarte Analyse. Für diese Analyse müssen Eingabedateien zugeschnittene Einzelzellen-Bildstapel werden. Nach dem Einfügen aller Einstellungen und der Ausführung summiert sich das Skript mit mehreren Kymographen für die angegebene Zelle.Auf der linken Seite befinden sich repräsentative Zellen der DMSO- und CK-666-Behandlungen, die automatisch mit dem bereitgestellten Skript segmentiert werden. Im Gegensatz zur isotropen und hochkreisförmigen Morphologie, die von Kontrollzellen nachgewiesen wird, weisen Arp2/3-hemmende Zellen eine verminderte Zirkularität auf. Darüber hinaus bieten die automatisch generierten Kymographen eine zeitliche Auflösung, die für das Verständnis der Dynamik von Vorsprüngen entscheidend ist.Kontrollzellen ragen hartnäckig und ohne bis gar keine Rückzüge hervor. Im Gegensatz dazu stört die Arp2/3-Hemmung die Stabilität der Vorsprünge, wie die Zunahme der Rückzugsereignisse während der gesamten Ausbreitung zeigt. Diese Videos sollen Ihnen das Verständnis dafür vermitteln, wie Sie Zellen richtig aussät, pharmakologische Behandlungen durchführen und bildgebende und computergestützte Werkzeuge vorbereiten können, die für die Quantifizierung der Zellausbreitungsdynamik erforderlich sind.Dieses Protokoll kann weiter mit zytoskelett-fluoreszierenden Bildgebungs- und Migrationstests kombiniert werden, um die molekularen Akteure zu identifizieren, die Zellvorsprünge bestimmen. Vielen Dank für Das Zuschauen und viel Glück mit Ihren Experimenten.

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