Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן קונוט פרס חוקר חדש S.P., קרן קנדה לחדשנות, NSERC דיסקברי גרנט התוכנית (מענקים RGPIN-2015-05114 ו RGPIN-2020-05881), אוניברסיטת מנצ'סטר ואוניברסיטת טורונטו קרן מחקר משותף, ואוניברסיטת טורונטו XSeed תוכנית.

1. זריעת תאים
הערה: פרוטוקול התפשטות התא המתואר בוצע באמצעות פיברובלסטים עובריים של העכבר (MEFs) המבטאים PH-Akt-GFP (סמן פלואורסצנטי עבור PIP3/PI(3,4)P2). קו תא זה נוצר על ידי שילוב גנומי של מבנה ביטוי עבור PH-Akt-GFP (addgene #21218) על ידי עריכת גנים בתיווך CRISPR. עם זאת, סמנים פלואורסצנטיים ?...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

מבחני התפשטות התא המתוארים מאפשרים מעקב מתמשך אחר שינויים מורפולוגיים(למשל, גודל וצורה של תאים) ותנועות קצה תא(כלומר, מהירות בליטה ותדירות נסיגה), שהן תכונות חסרות ברוב הפרוטוקולים המתפשטים על ידי תאים19,24. בעוד תא סוף נפוץ מתפשט מבחנים מאפשרים קבי?...

בליטות Lamellipodial הם מבנים cytoskeletal בולטים שנוצרו בחזית תא נודד. ב lamellipodia, פולמריזציה של actin בעזרת קומפלקס Arp2/3 ו formins יוצר רשת actin מסועפת הגדלה במהירות שדוחפת נגד קרום הפלזמה1,2. הכוח הדוחף שנוצר על ידי רשת actin מניע פיזית את התא קדימה1,3,4,5. דלדול של Arp2/3 מורכב או שיבוש של נתיבי איתות חיוניים עבור בליטות lamellipodial לעתים קרובות לפגוע נדידת תאים6, 7. למרות ההגירה של תאים לקויים lamellipodia דווחה גם8,9, החשיבות של lamellipodia בנדידת תאים ניכרת כמו דלדול של מבנה זה protrusive מפריע ליכולתו של התא לנוע דרך microenvironments ביולוגי מורכב6,10.
מכשול מרכזי להבנת הרגולציה של lamellipodia בתאים נודדים הוא השונות הטבעית בקינטיקה בליטה lamellipodial, גודל, וצורה11,12,13,14. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי lamellipodia להפגין התנהגויות בולטות מורכבות, כולל תנודות, תקופתיות, והאצת בליטות14,15. בהשוואה lamellipodia משתנה מאוד של תאים נודדים6,16, lamellipodia נוצר במהלך התפשטות התא הם אחידים יותר12. מאז הפעילות הבולטת של הפצה והעברת תאים מונעת על ידי הרכבות מקרומולקולריות זהות, הכוללות רשת actin מסועפת, חבילות actomyosin התכווצות, הידבקויות מטריצת תאים מבוססי integrin17,18, תאים מתפשטים שימשו נרחב כמודל לחקירת הרגולציה של דינמיקה lamellipodia.
הפצת תאים היא תהליך מכני דינמי שבו תא בהשעיה תחילה דבק מצע באמצעות הידבקויות מבוססות אינגרין17,19,20 ולאחר מכן מתפשט על ידי הרחבת בליטות מבוססות actin21,22,23. במהלך שלב ההתפשטות, lamellipodia הנובעים מגוף התא בולטים isotropically בהתמדה עם מעט עד ללא נסיגה או השתהות12. הפרוטוקולים הנפוצים ביותר להפצת תאים הם מבחני קצה, שבהם תאים מתפשטים קבועים בזמנים שונים לאחר ציפוי19,24. מבחנים אלה, אם כי מהירים ופשוטים, מוגבלים בכוח האבחון שלהם כדי לזהות שינויים בתכונות הדינמיות של lamellipodia. כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים השולטים בדינמיקה של לאמליפודיה, קבוצת Sheetz הייתה חלוצה בשימוש בניתוח כמותי של תאים מתפשטים חיים וחשפה תכונות בסיסיות רבות של בליטות קצה התא11,12,22. מחקרים אלה הראו כי התסעפות המתפשטת של תאים חיים היא טכניקה חזקה ורבת עוצמה בארגז הכלים של מעבדה לביולוגיה של התא. למרות זאת, פרוטוקול מפורט וכלי חישובי בקוד פתוח לבדיקה מתפשטת של תאים חיים אינם זמינים כיום עבור הקהילה לביולוגיה של התא. למטרה זו, הפרוטוקול שלנו מתאר את ההליכים של הדמיה תאים מתפשטים חיים ומספק כלי ניתוח תמונה אוטומטי. כדי לאמת שיטה זו, השתמשנו בעיכוב Arp2/3 כטיפול ניסיוני והראינו כי עיכוב הפונקציה של קומפלקס Arp2/3 לא עצר את התפשטות התאים אלא גרם לירידה משמעותית במהירות בליטות התא, כמו גם ליציבות של בליטות קצה התא, מה שהוליד קצוות תא משוננים. נתונים אלה מראים כי השילוב של הדמיה של תאים חיים וניתוח תמונה אוטומטי הוא כלי שימושי לניתוח דינמיקה של קצה התא ולזיהוי רכיבים מולקולריים המווסתים lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

הפצת תאים היא תהליך דינמי שבו תא המושעה במדיה מתחבר למצע ומשטח את עצמו מצורה מעוגלת לצורה דקה ומתפשטת. בעקבות הקובץ המצורף למצע התא, התא יוצר גיליון דק של lamellipodia הנובע מגוף התא. ב lamellipodia, אקטין כדורי (G-actin) מונומרים polymerize לתוך אקטין סיבי צפוף (F-actin) רשת שדוחף נגד קרום הפלזמה, ובכך לספק את הכוחות המכניים הדרושים עבור התא להתפשט. יש לציין כי השחקנים המולקולריים השולטים בפולמורליזציה של האקטין ב- lamellipodia חיוניים לתהליכים תאיים רבים אחרים, כגון נדידת תאים ואנדוציטוזיס. 
מאז הפצת תאים טופס lamellipodia רציפה המשתרעת על פני הפריפריה התא כולו בהתמדה להתרחב כלפי חוץ, תא מתפשט מבחנים הפכו כלי יעיל כדי להעריך את הקינטיקה של בליטות lamellipodial. למרות מספר יישומים טכניים של התא מתפשט assay פותחו, תיאור מפורט של זרימת העבודה, אשר יכלול הן צעד אחר צעד פרוטוקול וכלים חישוביים לניתוח נתונים, חסר כעת. כאן אנו מתארים את ההליכים הניסיוניים של התא המתפשט ומציגים כלי קוד פתוח לניתוח כמותי ובלתי משוחד של דינמיקת קצה התא במהלך ההתפשטות. בשילוב עם מניפולציות תרופתיות ו/או טכניקות להשתקת גנים, פרוטוקול זה נוח למסך בקנה מידה גדול של שחקנים מולקולריים המסדירים בליטות lamellipodial.

הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליכים הניסיוניים להדמיית תאים חיים של תאים מתפשטים וכלי חישובי לניתוח כמותי של דינמיקת הפצת תאים. הכלי החישובי יכול לשמש בפורמט בעל תפוקה נמוכה או גבוהה כדי לזהות את השחקנים המולקולריים המסדירים את מכונות הפולמליזציה של האקטין בקצה המוביל של התא.
?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים הניסיוניים של בדיקה מתפשטת של תא המבוססת על מיקרוסקופיה של תאים חיים. אנו מספקים כלי חישובי קוד פתוח עבור פילוח משוחד של תאים בעלי תווית פלואורסצנטית וניתוח כמותי של דינמיקת lamellipodia במהלך התפשטות התא.

ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

הפרוטוקול המתואר בסרטון זה יגדיר את ההליכים הניסיוניים הנדרשים להדמיה בגודל טבעי של תאים מתפשטים ושימוש בכלי חישובי לכמת תאים המפיצים דינמיקה באופן לא משוחד ואוטומטי. הנכס המתפשט של התא מאפשר מעקב רציף אחר תנועת קצה התא ושינויים מורפולוגיים במהלך הפצת תאים, שהיא תכונה שחסרה ברוב מבחני התפשטות התאים הקיימים. כמו כן, פרוטוקול זה מיישם את השימוש בעיבוד וניתוח אוטומטיים של המחשב, ומספק מידע על מעגליות התא, מחזורי נסיגת האזור והבליטה של תאים מתפשטים.עיבוד אוטומטי כזה מפחית את ההטיה בניתוח נתונים ומספק שיטה איתנה לניתוח דינמיקה של הפצת תאים עבור מספר רב של תאים. בשילוב עם טיפולים תרופתיים או מדעי הגנים וטכניקות, פרוטוקול זה נוח למהירויות בקנה מידה גדול של שחקנים מולקולריים המסדירים בליטות תאים. עבור הפרוטוקול הנתון, התאים המשמשים הם פיברובלסטים עובריים של העכבר המקודדים גנטית PH-Akt-GFP, המאפשר תיוג פלואורסצנטי של קרום הפלזמה.לפני תחילת התא מתפשט assay, תרבות צלחת של תאים ל 90%confluency. לאחר שהתאים השיגו את המפגש הנכון, להבה 22 על 22 מילימטר לכסות להחליק ומניחים אותו לתוך צלחת תרבית תא 35 מילימטר. מעיל את כיסוי להחליק עם פיברונקטין כי כבר מדולל PBS לריכוז של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר.מניחים את המנה עם כיסוי להחליק לתוך אינקובטור 37 מעלות במשך שעה אחת. לאחר שעה אחת לשאוף את fibronectin הקפד לא לגעת להחליק את הכיסוי עם קצה פיפטה. לשטוף את המנה עם PBS על ידי צינור בעדינות סביב החלקת הכיסוי פעמיים עד שלוש פעמים.עבור זריעת תאים, להתחיל על ידי שאיפת התקשורת תרבות התא מצלחת התאים. לאחר מכן, לשטוף את המנה עם PBS חם. מוסיפים 650 מיקרוליטרים של טריפסין EDTA למנה ומטה את המנה כדי להפיץ את האנזים באופן שווה.מניחים את המנה עם טריפסין לתוך האינקובטור במשך דקה אחת. לאחר הדגירה תצטרך תחילה להוסיף 10 מיליליטר של מדיה תרבות התא לתוך צינור צנטריפוגה. לאחר מכן, במהירות להוסיף עוד 10 מיליליטר של מדיה לתוך המנה על מנת להרוות את טריפסין.כדי לדלל את התאים שייזרעו על החלקת הכיסוי, פיפטה מיליליטר אחד של תכולת המנה לתוך צינור הצנטריפוגה. מהצינור, פיפטה כ 500 כדי 1, 000 microliters של תאים מדוללים לתוך המנה עם להחליק את הכיסוי. ודא כי תלוש הכיסוי הוא ב 10%confluency או 50, 000 תאים למיליליטר ולהתאים את נפח התאים המדוללים לפי הצורך.מטרת תאים אלה היא ליצור מישור של מיקוד במהלך רכישת תמונה. עם התאים הנותרים בצלחת, מעבר חמישית מהתאים לתוך מנה אחת קטנה לכל טיפול. אלה יהיו התאים שינותחו להפצת דינמיקה.מניחים את מנות המעבר ואת צלחת להחליק את הכיסוי לתוך אינקובטור במשך שמונה עד 24 שעות. כדי לבדוק את החשיבות של Arp2/3 להתפשטות תאים, ראשית להוסיף חמישה מיליליטר של מדיה תרבות התא לתוך צינור צנטריפוגה טיפול. לאחר מכן להוסיף 20 מיליליטר של dmem כי הוא חסר פנול אדום לתוך כל אחד משני צינורות צנטריפוגה גדולים יותר.פיפטה או התרופה CK-666 שהוא מעכב של קומפלקס Arp2/3 או טיפול מבוקר כגון DMSO לתוך צינורות קטנים וגדולים. כדי להתחיל טיפול תרופתי של התאים, להסיר את מנות המעבר כי היו דגירה לילה. לשאוף את התקשורת תרבות התא מכל הכלים ולשטוף את הכלים עם PBS חם.קח את הצינורות הקטנים המכילים גם CK-666 או לשלוט במדיה בתוספת ולהוסיף את התוכן של הצינור הרלוונטי לתוך כל אחד מנות המעבר. מתייגים כל אחת מהמנות עם הטיפול התרופתי הנכון ולאחר מכן מניחים את הכלים בחזרה לאינקובטור למשך שעה נוספת לאחר דגירה של שעה, שואפים את המדיה בתוספת התרופה מכל אחת מהמנות. לאחר מכן, להוסיף PBS חם לכל הכלים על מנת להסיר ביסודיות את כל המדיה האדומה פנול הנותרים.מוסיפים 230 מיקרוליטרים של טריפסין EDTA ומניחים את הכלים באינקובטור למשך דקה אחת. הסר את הכלים טריפסיניזציה מן החממה ולהמשיך להוסיף חמישה מיליליטר של התרופה בתוספת dmem כי הוא חסר פנול אדום לתוך צינור המיועד צינור B.Then להוסיף עוד חמישה מיליליטר של אותה מדיה לתוך המנה הרלוונטית כדי להרוות את טריפסין. פיפטה התקשורת למעלה ולמטה מספר פעמים על מנת לנתק את כל התאים מהצלחת.מעבירים את כל תכולת המנה לצינור אחר שכבר הוגדר כצינור A.In על מנת להכין דילול תאים המתאים להדמיה, מעבירים מיליליטר אחד של תאים מצינור A לצינור B.Repeat את כל שלבי הדילול לכל טיפול. מניחים את כל הצינורות לתוך החממה במשך 45 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש טריפסיניזציה. ודא שכל חלקי התא המגנטי שיכול להכיל תלוש כיסוי של 22 על 22 מילימטר נוקו ביסודיות לפני השימוש.מוציאים את המנה עם החלקת הכיסוי מהחממה. שאפו את מדיית תרבות התאים ושטפו את פתק הכיסוי עם PBS חם. הסר את תלוש הכיסוי באמצעות זוג מלקחיים והנח בעדינות את החלקת הכיסוי על הלוח התחתון של התא המגנטי.לאחר מכן להרים את אטם הסיליקון ומניחים אותו על גבי תלוש הכיסוי. חבר את הגוף הראשי של התא המגנטי ללוח התחתון. הוסף מיליליטר אחד של dmem חסר פנול אדום המתאים לטיפול הרלוונטי לתא המגנטי.קח רקמה ללא מוך בזהירות לטבול את המתחם בין הגוף הראשי ואת הצלחת התחתונה על מנת לבדוק את כל דליפות. כדי להשלים את התא המגנטי, הורידו את הכיסוי השקוף על הגוף הראשי. לבסוף לנגב את החלק התחתון של להחליק את הכיסוי עם רקמה מרוססת במים ועוד ריסוס עם 70% אתנול.מחממים את החממה העליונה של מיקרוסקופ קונפוקל ל-37 מעלות. מניחים את התא המגנטי על גבי המטרה. לפני רכישת דינמיקה מתפשטת, הגדר את המוקד לתאים המקוטבים ממילא בערוץ הפלואורסצנטי הירוק.פעולה זו מבטיחה שהתאים המתפשטים יהיו בפוקוס ברגע שהם יתחברו לתעודת הכיסוי. הסר את הכיסוי השקוף של התא המגנטי ופיפט 500 מיקרוליטר מצינור B שהוסר מהחממה. הנח את המכסה השקוף בחזרה למעלה.כדי לזהות תאים אידיאליים לניתוח הפצת תאים, חפש הילות ירוקות המייצגות תאים שעדיין לא נקשרו לתעודת הכיסוי או נמצאים בשלבים המוקדמים ביותר של הקובץ המצורף. רכוש תמונות ושמור את הקבצים. לאחר השלמת רכישת התמונה של התפשטות תאים, להתחיל על ידי הפעלת IDE פייתון תואם כגון Spyder.לצורך ניתוח חישובי של דינמיקת הפצת תאים, אתר ופתח את קובץ ה- GUI המתפשט בתא המסופק בחבילות ה- Script הרלוונטיות. לחץ על לחצן ההפעלה שיפתח את לוח ממשק משתמש גרפי ברקע. ממשק משתמש גרפי מכיל את כל ההגדרות הדרושות לניתוח.כדי לנתח את אזור התא ואת המעגליות, הזן את קובץ הרכישה ואת ההגדרות הדרושות בכרטיסייה אזור התפשטות התא. יהיה צריכה להתבצע התאמות בהתאם לסוג התא ולפרמטרים של רכישת תמונה. לאחר הקשה על run, קובץ ה- Script ייצור מעגליות ושטח של תא לעומת התוויית זמן עבור כל התאים המתפשטים.לקבלת נתוני קימוגרף, הקש על מחולל הקימוגרף וכרטיסיית הניתוח. ניתוח זה מחייב חיתוך של קבצי קלט בערימות תמונה של תא בודד. לאחר הוספת כל ההגדרות והפעלת הקשה, קובץ ה- Script ייצור קימוגרפים מרובים עבור התא הנתון.בצד שמאל נמצאים תאים מייצגים מטיפולי DMSO ו- CK-666, המפולחים באופן אוטומטי באמצעות הסקריפט שסופק. בניגוד למורפולוגיה האיזוטרופית והמחוגית ביותר שהודגמה על ידי תאי בקרה, תאים מעוכבים Arp2/3 מפגינים מעגליות מופחתת. בנוסף, הקימוגרפים הנוצרים באופן אוטומטי מספקים רזולוציה זמנית החיונית להבנת הדינמיקה של בליטות.תאי בקרה בולטים בהתמדה עם נסיגות מועטות עד ללא נסיגות. לעומת זאת, עיכוב Arp2/3 משבש את היציבות של בליטות כפי שצוין על ידי הגידול באירועי נסיגה לאורך התפשטות. קטעי וידאו זה צריך לספק לך את ההבנה של איך כראוי זרע תאים, לבצע טיפולים תרופתיים ולהכין הדמיה וכלים חישוביים הדרושים לכימות של דינמיקה הפצת תאים.פרוטוקול זה יכול להיות משולב עוד יותר עם הדמיה פלואורסצנטית cytoskeleton ו מבחני הגירה כדי לזהות את השחקנים המולקולריים השולטים בליטות התא. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

העצרת, טוען, ואת המערך של תא ultracentrifuge אנליטית לדוגמא

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

קביעת מספר נייד במהלך תרבית תאים באמצעות מונה Cell שרביט השלטון

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...