Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן קונוט פרס חוקר חדש S.P., קרן קנדה לחדשנות, NSERC דיסקברי גרנט התוכנית (מענקים RGPIN-2015-05114 ו RGPIN-2020-05881), אוניברסיטת מנצ'סטר ואוניברסיטת טורונטו קרן מחקר משותף, ואוניברסיטת טורונטו XSeed תוכנית.

1. זריעת תאים
הערה: פרוטוקול התפשטות התא המתואר בוצע באמצעות פיברובלסטים עובריים של העכבר (MEFs) המבטאים PH-Akt-GFP (סמן פלואורסצנטי עבור PIP3/PI(3,4)P2). קו תא זה נוצר על ידי שילוב גנומי של מבנה ביטוי עבור PH-Akt-GFP (addgene #21218) על ידי עריכת גנים בתיווך CRISPR. עם זאת, סמנים פלואורסצנטיים ?...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

מבחני התפשטות התא המתוארים מאפשרים מעקב מתמשך אחר שינויים מורפולוגיים(למשל, גודל וצורה של תאים) ותנועות קצה תא(כלומר, מהירות בליטה ותדירות נסיגה), שהן תכונות חסרות ברוב הפרוטוקולים המתפשטים על ידי תאים19,24. בעוד תא סוף נפוץ מתפשט מבחנים מאפשרים קבי?...

בליטות Lamellipodial הם מבנים cytoskeletal בולטים שנוצרו בחזית תא נודד. ב lamellipodia, פולמריזציה של actin בעזרת קומפלקס Arp2/3 ו formins יוצר רשת actin מסועפת הגדלה במהירות שדוחפת נגד קרום הפלזמה1,2. הכוח הדוחף שנוצר על ידי רשת actin מניע פיזית את התא קדימה1,3,4,5. דלדול של Arp2/3 מורכב או שיבוש של נתיבי איתות חיוניים עבור בליטות lamellipodial לעתים קרובות לפגוע נדידת תאים6, 7. למרות ההגירה של תאים לקויים lamellipodia דווחה גם8,9, החשיבות של lamellipodia בנדידת תאים ניכרת כמו דלדול של מבנה זה protrusive מפריע ליכולתו של התא לנוע דרך microenvironments ביולוגי מורכב6,10.
מכשול מרכזי להבנת הרגולציה של lamellipodia בתאים נודדים הוא השונות הטבעית בקינטיקה בליטה lamellipodial, גודל, וצורה11,12,13,14. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי lamellipodia להפגין התנהגויות בולטות מורכבות, כולל תנודות, תקופתיות, והאצת בליטות14,15. בהשוואה lamellipodia משתנה מאוד של תאים נודדים6,16, lamellipodia נוצר במהלך התפשטות התא הם אחידים יותר12. מאז הפעילות הבולטת של הפצה והעברת תאים מונעת על ידי הרכבות מקרומולקולריות זהות, הכוללות רשת actin מסועפת, חבילות actomyosin התכווצות, הידבקויות מטריצת תאים מבוססי integrin17,18, תאים מתפשטים שימשו נרחב כמודל לחקירת הרגולציה של דינמיקה lamellipodia.
הפצת תאים היא תהליך מכני דינמי שבו תא בהשעיה תחילה דבק מצע באמצעות הידבקויות מבוססות אינגרין17,19,20 ולאחר מכן מתפשט על ידי הרחבת בליטות מבוססות actin21,22,23. במהלך שלב ההתפשטות, lamellipodia הנובעים מגוף התא בולטים isotropically בהתמדה עם מעט עד ללא נסיגה או השתהות12. הפרוטוקולים הנפוצים ביותר להפצת תאים הם מבחני קצה, שבהם תאים מתפשטים קבועים בזמנים שונים לאחר ציפוי19,24. מבחנים אלה, אם כי מהירים ופשוטים, מוגבלים בכוח האבחון שלהם כדי לזהות שינויים בתכונות הדינמיות של lamellipodia. כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים השולטים בדינמיקה של לאמליפודיה, קבוצת Sheetz הייתה חלוצה בשימוש בניתוח כמותי של תאים מתפשטים חיים וחשפה תכונות בסיסיות רבות של בליטות קצה התא11,12,22. מחקרים אלה הראו כי התסעפות המתפשטת של תאים חיים היא טכניקה חזקה ורבת עוצמה בארגז הכלים של מעבדה לביולוגיה של התא. למרות זאת, פרוטוקול מפורט וכלי חישובי בקוד פתוח לבדיקה מתפשטת של תאים חיים אינם זמינים כיום עבור הקהילה לביולוגיה של התא. למטרה זו, הפרוטוקול שלנו מתאר את ההליכים של הדמיה תאים מתפשטים חיים ומספק כלי ניתוח תמונה אוטומטי. כדי לאמת שיטה זו, השתמשנו בעיכוב Arp2/3 כטיפול ניסיוני והראינו כי עיכוב הפונקציה של קומפלקס Arp2/3 לא עצר את התפשטות התאים אלא גרם לירידה משמעותית במהירות בליטות התא, כמו גם ליציבות של בליטות קצה התא, מה שהוליד קצוות תא משוננים. נתונים אלה מראים כי השילוב של הדמיה של תאים חיים וניתוח תמונה אוטומטי הוא כלי שימושי לניתוח דינמיקה של קצה התא ולזיהוי רכיבים מולקולריים המווסתים lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

הפצת תאים היא תהליך דינמי שבו תא המושעה במדיה מתחבר למצע ומשטח את עצמו מצורה מעוגלת לצורה דקה ומתפשטת. בעקבות הקובץ המצורף למצע התא, התא יוצר גיליון דק של lamellipodia הנובע מגוף התא. ב lamellipodia, אקטין כדורי (G-actin) מונומרים polymerize לתוך אקטין סיבי צפוף (F-actin) רשת שדוחף נגד קרום הפלזמה, ובכך לספק את הכוחות המכניים הדרושים עבור התא להתפשט. יש לציין כי השחקנים המולקולריים השולטים בפולמורליזציה של האקטין ב- lamellipodia חיוניים לתהליכים תאיים רבים אחרים, כגון נדידת תאים ואנדוציטוזיס. 
מאז הפצת תאים טופס lamellipodia רציפה המשתרעת על פני הפריפריה התא כולו בהתמדה להתרחב כלפי חוץ, תא מתפשט מבחנים הפכו כלי יעיל כדי להעריך את הקינטיקה של בליטות lamellipodial. למרות מספר יישומים טכניים של התא מתפשט assay פותחו, תיאור מפורט של זרימת העבודה, אשר יכלול הן צעד אחר צעד פרוטוקול וכלים חישוביים לניתוח נתונים, חסר כעת. כאן אנו מתארים את ההליכים הניסיוניים של התא המתפשט ומציגים כלי קוד פתוח לניתוח כמותי ובלתי משוחד של דינמיקת קצה התא במהלך ההתפשטות. בשילוב עם מניפולציות תרופתיות ו/או טכניקות להשתקת גנים, פרוטוקול זה נוח למסך בקנה מידה גדול של שחקנים מולקולריים המסדירים בליטות lamellipodial.

הפרוטוקול לעיל מתאר את ההליכים הניסיוניים להדמיית תאים חיים של תאים מתפשטים וכלי חישובי לניתוח כמותי של דינמיקת הפצת תאים. הכלי החישובי יכול לשמש בפורמט בעל תפוקה נמוכה או גבוהה כדי לזהות את השחקנים המולקולריים המסדירים את מכונות הפולמליזציה של האקטין בקצה המוביל של התא.
?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

בפרוטוקול זה, אנו מציגים את ההליכים הניסיוניים של בדיקה מתפשטת של תא המבוססת על מיקרוסקופיה של תאים חיים. אנו מספקים כלי חישובי קוד פתוח עבור פילוח משוחד של תאים בעלי תווית פלואורסצנטית וניתוח כמותי של דינמיקת lamellipodia במהלך התפשטות התא.

ניתוח כמותי של דינמיקת קצה התא במהלך הפצת תאים

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

הפרוטוקול המתואר בסרטון זה יגדיר את ההליכים הניסיוניים הנדרשים להדמיה בגודל טבעי של תאים מתפשטים ושימוש בכלי חישובי לכמת תאים המפיצים דינמיקה באופן לא משוחד ואוטומטי. הנכס המתפשט של התא מאפשר מעקב רציף אחר תנועת קצה התא ושינויים מורפולוגיים במהלך הפצת תאים, שהיא תכונה שחסרה ברוב מבחני התפשטות התאים הקיימים. כמו כן, פרוטוקול זה מיישם את השימוש בעיבוד וניתוח אוטומטיים של המחשב, ומספק מידע על מעגליות התא, מחזורי נסיגת האזור והבליטה של תאים מתפשטים.עיבוד אוטומטי כזה מפחית את ההטיה בניתוח נתונים ומספק שיטה איתנה לניתוח דינמיקה של הפצת תאים עבור מספר רב של תאים. בשילוב עם טיפולים תרופתיים או מדעי הגנים וטכניקות, פרוטוקול זה נוח למהירויות בקנה מידה גדול של שחקנים מולקולריים המסדירים בליטות תאים. עבור הפרוטוקול הנתון, התאים המשמשים הם פיברובלסטים עובריים של העכבר המקודדים גנטית PH-Akt-GFP, המאפשר תיוג פלואורסצנטי של קרום הפלזמה.לפני תחילת התא מתפשט assay, תרבות צלחת של תאים ל 90%confluency. לאחר שהתאים השיגו את המפגש הנכון, להבה 22 על 22 מילימטר לכסות להחליק ומניחים אותו לתוך צלחת תרבית תא 35 מילימטר. מעיל את כיסוי להחליק עם פיברונקטין כי כבר מדולל PBS לריכוז של 2.5 מיקרוגרם למיליליטר.מניחים את המנה עם כיסוי להחליק לתוך אינקובטור 37 מעלות במשך שעה אחת. לאחר שעה אחת לשאוף את fibronectin הקפד לא לגעת להחליק את הכיסוי עם קצה פיפטה. לשטוף את המנה עם PBS על ידי צינור בעדינות סביב החלקת הכיסוי פעמיים עד שלוש פעמים.עבור זריעת תאים, להתחיל על ידי שאיפת התקשורת תרבות התא מצלחת התאים. לאחר מכן, לשטוף את המנה עם PBS חם. מוסיפים 650 מיקרוליטרים של טריפסין EDTA למנה ומטה את המנה כדי להפיץ את האנזים באופן שווה.מניחים את המנה עם טריפסין לתוך האינקובטור במשך דקה אחת. לאחר הדגירה תצטרך תחילה להוסיף 10 מיליליטר של מדיה תרבות התא לתוך צינור צנטריפוגה. לאחר מכן, במהירות להוסיף עוד 10 מיליליטר של מדיה לתוך המנה על מנת להרוות את טריפסין.כדי לדלל את התאים שייזרעו על החלקת הכיסוי, פיפטה מיליליטר אחד של תכולת המנה לתוך צינור הצנטריפוגה. מהצינור, פיפטה כ 500 כדי 1, 000 microliters של תאים מדוללים לתוך המנה עם להחליק את הכיסוי. ודא כי תלוש הכיסוי הוא ב 10%confluency או 50, 000 תאים למיליליטר ולהתאים את נפח התאים המדוללים לפי הצורך.מטרת תאים אלה היא ליצור מישור של מיקוד במהלך רכישת תמונה. עם התאים הנותרים בצלחת, מעבר חמישית מהתאים לתוך מנה אחת קטנה לכל טיפול. אלה יהיו התאים שינותחו להפצת דינמיקה.מניחים את מנות המעבר ואת צלחת להחליק את הכיסוי לתוך אינקובטור במשך שמונה עד 24 שעות. כדי לבדוק את החשיבות של Arp2/3 להתפשטות תאים, ראשית להוסיף חמישה מיליליטר של מדיה תרבות התא לתוך צינור צנטריפוגה טיפול. לאחר מכן להוסיף 20 מיליליטר של dmem כי הוא חסר פנול אדום לתוך כל אחד משני צינורות צנטריפוגה גדולים יותר.פיפטה או התרופה CK-666 שהוא מעכב של קומפלקס Arp2/3 או טיפול מבוקר כגון DMSO לתוך צינורות קטנים וגדולים. כדי להתחיל טיפול תרופתי של התאים, להסיר את מנות המעבר כי היו דגירה לילה. לשאוף את התקשורת תרבות התא מכל הכלים ולשטוף את הכלים עם PBS חם.קח את הצינורות הקטנים המכילים גם CK-666 או לשלוט במדיה בתוספת ולהוסיף את התוכן של הצינור הרלוונטי לתוך כל אחד מנות המעבר. מתייגים כל אחת מהמנות עם הטיפול התרופתי הנכון ולאחר מכן מניחים את הכלים בחזרה לאינקובטור למשך שעה נוספת לאחר דגירה של שעה, שואפים את המדיה בתוספת התרופה מכל אחת מהמנות. לאחר מכן, להוסיף PBS חם לכל הכלים על מנת להסיר ביסודיות את כל המדיה האדומה פנול הנותרים.מוסיפים 230 מיקרוליטרים של טריפסין EDTA ומניחים את הכלים באינקובטור למשך דקה אחת. הסר את הכלים טריפסיניזציה מן החממה ולהמשיך להוסיף חמישה מיליליטר של התרופה בתוספת dmem כי הוא חסר פנול אדום לתוך צינור המיועד צינור B.Then להוסיף עוד חמישה מיליליטר של אותה מדיה לתוך המנה הרלוונטית כדי להרוות את טריפסין. פיפטה התקשורת למעלה ולמטה מספר פעמים על מנת לנתק את כל התאים מהצלחת.מעבירים את כל תכולת המנה לצינור אחר שכבר הוגדר כצינור A.In על מנת להכין דילול תאים המתאים להדמיה, מעבירים מיליליטר אחד של תאים מצינור A לצינור B.Repeat את כל שלבי הדילול לכל טיפול. מניחים את כל הצינורות לתוך החממה במשך 45 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש טריפסיניזציה. ודא שכל חלקי התא המגנטי שיכול להכיל תלוש כיסוי של 22 על 22 מילימטר נוקו ביסודיות לפני השימוש.מוציאים את המנה עם החלקת הכיסוי מהחממה. שאפו את מדיית תרבות התאים ושטפו את פתק הכיסוי עם PBS חם. הסר את תלוש הכיסוי באמצעות זוג מלקחיים והנח בעדינות את החלקת הכיסוי על הלוח התחתון של התא המגנטי.לאחר מכן להרים את אטם הסיליקון ומניחים אותו על גבי תלוש הכיסוי. חבר את הגוף הראשי של התא המגנטי ללוח התחתון. הוסף מיליליטר אחד של dmem חסר פנול אדום המתאים לטיפול הרלוונטי לתא המגנטי.קח רקמה ללא מוך בזהירות לטבול את המתחם בין הגוף הראשי ואת הצלחת התחתונה על מנת לבדוק את כל דליפות. כדי להשלים את התא המגנטי, הורידו את הכיסוי השקוף על הגוף הראשי. לבסוף לנגב את החלק התחתון של להחליק את הכיסוי עם רקמה מרוססת במים ועוד ריסוס עם 70% אתנול.מחממים את החממה העליונה של מיקרוסקופ קונפוקל ל-37 מעלות. מניחים את התא המגנטי על גבי המטרה. לפני רכישת דינמיקה מתפשטת, הגדר את המוקד לתאים המקוטבים ממילא בערוץ הפלואורסצנטי הירוק.פעולה זו מבטיחה שהתאים המתפשטים יהיו בפוקוס ברגע שהם יתחברו לתעודת הכיסוי. הסר את הכיסוי השקוף של התא המגנטי ופיפט 500 מיקרוליטר מצינור B שהוסר מהחממה. הנח את המכסה השקוף בחזרה למעלה.כדי לזהות תאים אידיאליים לניתוח הפצת תאים, חפש הילות ירוקות המייצגות תאים שעדיין לא נקשרו לתעודת הכיסוי או נמצאים בשלבים המוקדמים ביותר של הקובץ המצורף. רכוש תמונות ושמור את הקבצים. לאחר השלמת רכישת התמונה של התפשטות תאים, להתחיל על ידי הפעלת IDE פייתון תואם כגון Spyder.לצורך ניתוח חישובי של דינמיקת הפצת תאים, אתר ופתח את קובץ ה- GUI המתפשט בתא המסופק בחבילות ה- Script הרלוונטיות. לחץ על לחצן ההפעלה שיפתח את לוח ממשק משתמש גרפי ברקע. ממשק משתמש גרפי מכיל את כל ההגדרות הדרושות לניתוח.כדי לנתח את אזור התא ואת המעגליות, הזן את קובץ הרכישה ואת ההגדרות הדרושות בכרטיסייה אזור התפשטות התא. יהיה צריכה להתבצע התאמות בהתאם לסוג התא ולפרמטרים של רכישת תמונה. לאחר הקשה על run, קובץ ה- Script ייצור מעגליות ושטח של תא לעומת התוויית זמן עבור כל התאים המתפשטים.לקבלת נתוני קימוגרף, הקש על מחולל הקימוגרף וכרטיסיית הניתוח. ניתוח זה מחייב חיתוך של קבצי קלט בערימות תמונה של תא בודד. לאחר הוספת כל ההגדרות והפעלת הקשה, קובץ ה- Script ייצור קימוגרפים מרובים עבור התא הנתון.בצד שמאל נמצאים תאים מייצגים מטיפולי DMSO ו- CK-666, המפולחים באופן אוטומטי באמצעות הסקריפט שסופק. בניגוד למורפולוגיה האיזוטרופית והמחוגית ביותר שהודגמה על ידי תאי בקרה, תאים מעוכבים Arp2/3 מפגינים מעגליות מופחתת. בנוסף, הקימוגרפים הנוצרים באופן אוטומטי מספקים רזולוציה זמנית החיונית להבנת הדינמיקה של בליטות.תאי בקרה בולטים בהתמדה עם נסיגות מועטות עד ללא נסיגות. לעומת זאת, עיכוב Arp2/3 משבש את היציבות של בליטות כפי שצוין על ידי הגידול באירועי נסיגה לאורך התפשטות. קטעי וידאו זה צריך לספק לך את ההבנה של איך כראוי זרע תאים, לבצע טיפולים תרופתיים ולהכין הדמיה וכלים חישוביים הדרושים לכימות של דינמיקה הפצת תאים.פרוטוקול זה יכול להיות משולב עוד יותר עם הדמיה פלואורסצנטית cytoskeleton ו מבחני הגירה כדי לזהות את השחקנים המולקולריים השולטים בליטות התא. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

quantitative-analysis-of-cell-edge-dynamics-during-cell-spreading

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

קביעת מספר נייד במהלך תרבית תאים באמצעות מונה Cell שרביט השלטון

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

משטח הפצת וImmunostaining של כרומוזומים שמרים

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.