Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal Connaught Fund New Investigator Award a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (sovvenzioni RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.

1. Semina cellulare
NOTA: Il protocollo di diffusione cellulare descritto è stato eseguito utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) che esprimono PH-Akt-GFP (un marcatore fluorescente per PIP3/PI(3,4)P2). Questa linea cellulare è stata generata integrando genomicamente un costrutto di espressione per PH-Akt-GFP (Addgene #21218) mediante editing genico mediato da CRISPR. Tuttavia, altri marcatori fluorescenti che sono espressi transitoriamente o integrati nel genom...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

Il saggio di diffusione cellulare descritto consente il tracciamento continuodei cambiamenti morfologici (ad esempio, dimensione e forma delle cellule)e dei movimenti del bordo cellulare (cioè velocità di protrusione e frequenza di retrazione), che sono caratteristiche mancanti nella maggior parte dei protocolli di diffusione cellulare19,24. Mentre i test di diffusione delle cellule del punto finale comunemente usati consentono la determinazio...

Le sporgenze lamellipodiali sono strutture citoscheletriche prominenti formate nella parte anteriore di una cellula migratare. In lamellipodia, la polimerizzazione dell'actina con l'aiuto del complesso Arp2/3 e delle forme crea una rete actina ramificata in rapida crescita che spinge contro la membranaplasmatica 1,2. La forza di spinta generata dalla meshwork actin spinge fisicamente la cella inavanti 1,3,4,5. L'esaurimento del complesso Arp2/3 o l'interruzione delle vie di segnalazione essenziali per le sporgenze lamellipodiali spesso compromettono la migrazionecellulare 6, 7. Sebbene sia stata segnalata anche la migrazione di cellule carenti di lamellipodia8,9, l'importanza della lamellipodia nella migrazione cellulare è evidente in quanto l'esaurimento di questa struttura protrusiva perturba la capacità della cellula di muoversi attraverso complessi microambientatibiologici 6,10.
Uno dei principali ostacoli alla comprensione della regolazione della lamellipodia nelle cellule migratrici è la variabilità naturale nella cinetica, nelle dimensioni e nella forma della protrusione lamellipodale11,12,13,14. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che i lamellipodia mostrano comportamenti protrusivi complessi, tra cui sporgenze fluttuanti, periodiche e acceleranti14,15. Rispetto alla lamellipodia altamente variabile delle cellule migratrici6,16,lamellipodia formata durante la diffusione cellulare sono piùuniformi 12. Poiché l'attività protrusiva di diffusione e migrazione delle cellule è guidata da assiemi macromolecolari identici, che includono una rete actina ramificata, fasci di actomiosina contrattili e aderenze a matrice cellulare a base di integrina17,18, le cellule di diffusione sono state ampiamente utilizzate come modello per indagare la regolazione della dinamica della lamellipodia.
La diffusione cellulare è un processo meccanochimico dinamico in cui una cellula in sospensione aderisce prima a un substrato attraverso aderenze a base di integrina17,19,20 e poi si diffonde estendendo le sporgenze a base di actina21,22,23. Durante la fase di diffusione, lamellipodia che emana dal corpo cellulare sporge isotropicamente e persistentemente con poca o nessuna retrazione o stallo12. I protocolli di diffusione cellulare più comunemente utilizzati sono test di endpoint, in cui le cellule di diffusione sono fissate in vari momenti dopo laplaccatura 19,24. Questi test, sebbene rapidi e semplici, sono limitati nel loro potere diagnostico per rilevare i cambiamenti nelle caratteristiche dinamiche della lamellipodia. Per determinare i meccanismi molecolari che controllano la dinamica lamellipodia, il gruppo Sheetz ha aperto la strada all'uso dell'analisi quantitativa delle cellule di diffusione dal vivo e ha scoperto molte proprietà fondamentali delle sporgenze dei bordi cellulari11,12,22. Questi studi hanno dimostrato che il saggio di diffusione delle cellule vive è una tecnica robusta e potente nella cassetta degli attrezzi di un laboratorio di biologia cellulare. Nonostante ciò, un protocollo dettagliato e uno strumento computazionale open source per un saggio di diffusione di cellule vive non sono attualmente disponibili per la comunità della biologia cellulare. A tal fine, il nostro protocollo delinea le procedure di imaging delle cellule di diffusione dal vivo e fornisce uno strumento automatizzato di analisi delle immagini. Per convalidare questo metodo, abbiamo usato l'inibizione dell'Arp2/3 come trattamento sperimentale e abbiamo dimostrato che inibire la funzione del complesso Arp2/3 non ha arrestato la diffusione cellulare ma ha causato una significativa riduzione della velocità di protrusione cellulare, così come la stabilità delle sporgenze del bordo cellulare, dando origine a bordi cellulari frastagliati. Questi dati dimostrano che la combinazione di imaging a cellule vive e analisi automatizzata delle immagini è uno strumento utile per analizzare la dinamica dei bordi delle cellule e identificare componenti molecolari che regolano lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

La diffusione cellulare è un processo dinamico in cui una cellula sospesa nel supporto si attacca a un substrato e si appiattisce da una forma arrotondata a una sottile e distribuita. Seguendo l'attacco cellula-substrato, la cellula forma un sottile foglio di lamellipodia che emana dal corpo cellulare. Nella lamellipodia, i monomeri dell'actina globulare (G-actina) polimerizzano in una fitta rete ad actina filamentosa (F-actin) che spinge contro la membrana plasmatica, fornendo così le forze meccaniche necessarie per la diffusione della cellula. In particolare, i giocatori molecolari che controllano la polimerizzazione dell'actina nella lamellipodia sono essenziali per molti altri processi cellulari, come la migrazione cellulare e l'endocitosi. 
Poiché le cellule di diffusione formano lamellipodi continue che attraversano l'intera periferia cellulare e si espandono persistentemente verso l'esterno, i test di diffusione cellulare sono diventati uno strumento efficiente per valutare la cinetica delle sporgenze lamellipodiali. Sebbene siano state sviluppate diverse implementazioni tecniche del test di diffusione delle celle, attualmente manca una descrizione dettagliata del flusso di lavoro, che includerebbe sia un protocollo passo-passo che strumenti computazionali per l'analisi dei dati. Qui descriviamo le procedure sperimentali del saggio di diffusione cellulare e presentiamo uno strumento open source per l'analisi quantitativa e imparziale della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione. Se combinato con manipolazioni farmacologiche e/o tecniche di silenziamento genico, questo protocollo è suscettibile a uno schermo su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze lamellipodiali.

Il protocollo di cui sopra descrive le procedure sperimentali per l'imaging a cellule vive di cellule di diffusione e uno strumento computazionale per l'analisi quantitativa della dinamica di diffusione cellulare. Lo strumento computazionale può essere utilizzato in un formato a bassa o alta produttività per identificare i lettori molecolari che regolano i macchinari di polimerizzazione dell'actina all'avanguardia cellulare.
La rappresentazione schematica delle procedure sperimentali è illu...

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Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

In questo protocollo, presentiamo le procedure sperimentali di un saggio di diffusione cellulare basato sulla microscopia a cellule vive. Forniamo uno strumento computazionale open source per la segmentazione imparziale di cellule etichettate fluorescentmente e l'analisi quantitativa della dinamica lamellipodia durante la diffusione cellulare.

Analisi quantitativa della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione cellulare

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Il protocollo descritto in questo video definirà le procedure sperimentali necessarie per l'imaging a grandezza naturale delle cellule di diffusione e l'uso di uno strumento computazionale che quantifica le dinamiche di diffusione delle cellule in modo imparziale e automatizzato. La risorsa di diffusione cellulare consente il tracciamento continuo del movimento del bordo cellulare e dei cambiamenti morfologici durante la diffusione cellulare, che è una caratteristica che manca nella maggior parte dei test di diffusione cellulare esistenti. Anche questo protocollo implementa l'uso dell'elaborazione e dell'analisi automatizzata del computer, fornendo informazioni sulla circolarità cellulare, sui cicli di retrazione dell'area e della sporgenza delle cellule di diffusione.Tale elaborazione automatizzata riduce la distorsione nell'analisi dei dati e fornisce un metodo robusto per analizzare la dinamica di diffusione delle cellule per un gran numero di celle. Se combinato con trattamenti farmacologici o scienze e tecniche geniche, questo protocollo è suscettibile a velocità su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze cellulari. Per il protocollo specificato, Le cellule utilizzate sono fibroblasti embrionali di topo che codificano geneticamente PH-Akt-GFP, che consente l'etichettatura fluorescente della membrana plasmatica.Prima dell'inizio del test di diffusione della cellula, coltura di un piatto di cellule al 90% di confluenza. Una volta che le cellule hanno raggiunto la corretta confluenza, fiammare uno scivolo di copertura di 22 per 22 millimetri e posizionarlo in un piatto di coltura cellulare di 35 millimetri. Rivestire il coperchio con fibronectina che è stata diluita in PBS a una concentrazione di 2,5 microgrammi per millilitro.Posizionare il piatto con il coperchio scivolare in un incubatore di 37 gradi per un'ora. Dopo un'ora aspirare la fibronectina assicurandosi di non toccare lo scivolo del coperchio con la punta della pipetta. Lavare il piatto con PBS tubazione delicatamente intorno al coperchio scivolare da due a tre volte.Per la semina cellulare, iniziare aspirando il supporto di coltura cellulare dal piatto delle cellule. Successivamente, lavare il piatto con PBS caldo. Aggiungere 650 microlitri di tripside EDTA al piatto e inclinare il piatto per distribuire uniformemente l'enzima.Posizionare il piatto con la triptina nell'incubatrice per un minuto. Dopo l'incubazione dovrai prima aggiungere 10 millilitri di mezzi di coltura cellulare in un tubo di centrifuga. Successivamente, aggiungere rapidamente altri 10 millilitri di supporto nel piatto per temprare la triptina.Per diluire le cellule che verranno seminate sullo scivolo di copertura, pipettare un millilitro del contenuto del piatto nel tubo di centrifuga. Dal tubo, pipettare circa 500 a 1.000 microlitri di cellule diluite nel piatto con lo scivolo di copertura. Assicurarsi che lo slittamento del coperchio sia a una confluenza del 10% o 50.000 celle per millilitro e regolare il volume delle celle diluite in base alle esigenze.Lo scopo di queste celle è quello di stabilire un piano di messa a fuoco durante l'acquisizione dell'immagine. Con le cellule rimanenti nel piatto, passare un quinto delle cellule in un piccolo piatto per trattamento. Queste saranno le cellule che verranno analizzate per diffondere la dinamica.Posizionare i piatti di passaggio e la piastra di copertura in un'incubatrice per otto-24 ore. Per testare l'importanza dell'Arp2/3 per la diffusione cellulare, aggiungere prima cinque millilitri di mezzi di coltura cellulare in un tubo di controllo e centrifuga di trattamento. Aggiungere quindi 20 millilitri di dmem che manca di rosso fenolo in ciascuno dei due tubi di centrifuga più grandi.Pipetta o il farmaco CK-666 che è un inibitore del complesso Arp2/3 o il trattamento controllato come DMSO nei tubi piccoli e grandi. Per iniziare il trattamento farmacologico delle cellule, rimuovere i piatti di passaggio che stavano incubando durante la notte. Aspirare i mezzi di coltura cellulare da tutti i piatti e lavare i piatti con PBS caldo.Prendere i piccoli tubi contenenti CK-666 o controllare i supporti integrati e aggiungere il contenuto del tubo pertinente in ciascuna delle stoviglie di passaggio. Etichettare ciascuno dei piatti con il corretto trattamento farmacologico e quindi riposizionare i piatti nell'incubatrice per un'ora aggiuntiva Dopo un'ora di incubazione, aspirare il farmaco supporti integrati da ciascuno dei piatti. Quindi, aggiungere PBS caldo a tutti i piatti per rimuovere accuratamente tutti i restanti mezzi rosso fenolo.Aggiungere 230 microlitri di tripside EDTA e posizionare i piatti in un'incubatrice per un minuto. Rimuovere i piatti tripsinici dall'incubatrice e procedere ad aggiungere cinque millilitri del farmaco integrato dmem che manca di rosso fenolo in un tubo designato come tubo B.Quindi aggiungere altri cinque millilitri dello stesso supporto nel piatto pertinente per temprare la tripanoina. Pipettare il supporto su e giù più volte per staccare tutte le cellule dal piatto.Trasferire tutto il contenuto del piatto in un altro tubo che è già stato designato come tubo A.In modo da preparare una diluizione cellulare appropriata per l'imaging, trasferire un millilitro di cellule dal tubo A nel tubo B.Ripetere tutte le fasi di diluizione per ogni trattamento. Posizionare tutti i tubi nell'incubatore per 45 minuti per consentire alle cellule di riprendersi dalla tripsiinizzazione. Assicurarsi che tutte le parti di una camera magnetica cellulare in grado di ospitare uno slittamento di copertura di 22 per 22 millimetri siano state accuratamente pulite prima dell'uso.Rimuovere il piatto con la lapsus dall'incubatrice. Aspirare il supporto di coltura cellulare e lavare la lapsus con PBS caldo. Rimuovere lo slittamento del coperchio utilizzando un paio di forcep e posare delicatamente il coperchio sulla piastra inferiore della camera magnetica.Quindi prendi la guarnizione in silicone e posizionala sopra la slitta di copertura. Attaccare il corpo principale della camera magnetica sulla piastra inferiore. Aggiungere un millilitro del dmem privo di rosso fenolo corrispondente al trattamento pertinente alla camera magnetica.Prendi un tessuto privo di pelucchi e tampona con cura l'involucro tra il corpo principale e la piastra inferiore per verificare eventuali perdite. Per completare la camera magnetica, abbassare il coperchio trasparente sul corpo principale. Infine pulire il fondo del coperchio scivolare con un tessuto spruzzato con acqua e un altro spruzzato con 70% di etanolo.Preriscaldare l'incubatore superiore dello stadio di un microscopio confocale a 37 gradi. Posizionare la camera magnetica sopra l'obiettivo. Prima di acquisire dinamiche di diffusione, mettere a fuoco le cellule già polarizzate nel canale fluorescente verde.Ciò garantisce che le cellule di diffusione siano a fuoco una volta attaccate allo slittamento del coperchio. Rimuovere il coperchio trasparente della camera magnetica e dei microlitri pipetta 500 dal tubo B che è stato rimosso dall'incubatore. Riposizionare il coperchio trasparente sopra.Per identificare le cellule ideali per l'analisi della diffusione cellulare cercare aloni verdi che rappresentano cellule che devono ancora attaccarsi allo slittamento di copertura o che si trovano nelle prime fasi di attacco. Acquisire immagini e salvare i file. Dopo aver completato l'acquisizione dell'immagine della diffusione delle celle, inizia eseguendo un IDE Python compatibile come Spyder.Per l'analisi computazionale della dinamica di diffusione delle celle, individuare e aprire il file GUI di diffusione delle celle fornito nei pacchetti di script pertinenti. Premere il pulsante Esegui che aprirà il pannello GUI di analisi in background. La GUI ospita tutte le impostazioni necessarie per l'analisi.Per analizzare l'area delle celle e la circolarità, inserire il file di acquisizione e le impostazioni necessarie nella scheda area di diffusione cella. Le regolazioni dovranno essere effettuate a seconda del tipo di cella e dei parametri di acquisizione dell'immagine. Dopo aver premuto esegui, lo script creerà una circolarità cellulare e un grafico di area rispetto al tempo per tutte le celle di diffusione.Per i dati del kymograph, premere il generatore di kymograph e la scheda di analisi. Questa analisi richiede che i file di input siano ritagliati in stack di immagini a cella singola. Dopo aver inserito tutte le impostazioni e premuto esegui, lo script creerà più cimografi per la cella data.A sinistra ci sono cellule rappresentative dei trattamenti DMSO e CK-666, segmentate automaticamente utilizzando lo script fornito. A differenza della morfologia isotropa e altamente circolare dimostrata dalle cellule di controllo, le cellule inibite Arp2/3 mostrano una diminuzione della circolarità. Inoltre, i cimografi generati automaticamente forniscono una risoluzione temporale fondamentale per comprendere la dinamica delle sporgenze.Le celle di controllo sporgono persistentemente con piccole o nessuna retrazione. Al contrario, l'inibizione dell'Arp2/3 interrompe la stabilità delle sporgenze come indicato dall'aumento degli eventi di retrazione durante la diffusione. Questi video dovrebbero fornirti la comprensione di come seminare correttamente le cellule, eseguire trattamenti farmacologici e preparare strumenti di imaging e computazionali necessari per la quantificazione della dinamica di diffusione cellulare.Questo protocollo può essere ulteriormente combinato con l'imaging fluorescente del citoscheletro e i test di migrazione per identificare i lettori molecolari che governano le sporgenze cellulari. Grazie per la visione e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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