Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal Connaught Fund New Investigator Award a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (sovvenzioni RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.

1. Semina cellulare
NOTA: Il protocollo di diffusione cellulare descritto è stato eseguito utilizzando fibroblasti embrionali di topo (MEF) che esprimono PH-Akt-GFP (un marcatore fluorescente per PIP3/PI(3,4)P2). Questa linea cellulare è stata generata integrando genomicamente un costrutto di espressione per PH-Akt-GFP (Addgene #21218) mediante editing genico mediato da CRISPR. Tuttavia, altri marcatori fluorescenti che sono espressi transitoriamente o integrati nel genom...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

Il saggio di diffusione cellulare descritto consente il tracciamento continuodei cambiamenti morfologici (ad esempio, dimensione e forma delle cellule)e dei movimenti del bordo cellulare (cioè velocità di protrusione e frequenza di retrazione), che sono caratteristiche mancanti nella maggior parte dei protocolli di diffusione cellulare19,24. Mentre i test di diffusione delle cellule del punto finale comunemente usati consentono la determinazio...

Le sporgenze lamellipodiali sono strutture citoscheletriche prominenti formate nella parte anteriore di una cellula migratare. In lamellipodia, la polimerizzazione dell'actina con l'aiuto del complesso Arp2/3 e delle forme crea una rete actina ramificata in rapida crescita che spinge contro la membranaplasmatica 1,2. La forza di spinta generata dalla meshwork actin spinge fisicamente la cella inavanti 1,3,4,5. L'esaurimento del complesso Arp2/3 o l'interruzione delle vie di segnalazione essenziali per le sporgenze lamellipodiali spesso compromettono la migrazionecellulare 6, 7. Sebbene sia stata segnalata anche la migrazione di cellule carenti di lamellipodia8,9, l'importanza della lamellipodia nella migrazione cellulare è evidente in quanto l'esaurimento di questa struttura protrusiva perturba la capacità della cellula di muoversi attraverso complessi microambientatibiologici 6,10.
Uno dei principali ostacoli alla comprensione della regolazione della lamellipodia nelle cellule migratrici è la variabilità naturale nella cinetica, nelle dimensioni e nella forma della protrusione lamellipodale11,12,13,14. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che i lamellipodia mostrano comportamenti protrusivi complessi, tra cui sporgenze fluttuanti, periodiche e acceleranti14,15. Rispetto alla lamellipodia altamente variabile delle cellule migratrici6,16,lamellipodia formata durante la diffusione cellulare sono piùuniformi 12. Poiché l'attività protrusiva di diffusione e migrazione delle cellule è guidata da assiemi macromolecolari identici, che includono una rete actina ramificata, fasci di actomiosina contrattili e aderenze a matrice cellulare a base di integrina17,18, le cellule di diffusione sono state ampiamente utilizzate come modello per indagare la regolazione della dinamica della lamellipodia.
La diffusione cellulare è un processo meccanochimico dinamico in cui una cellula in sospensione aderisce prima a un substrato attraverso aderenze a base di integrina17,19,20 e poi si diffonde estendendo le sporgenze a base di actina21,22,23. Durante la fase di diffusione, lamellipodia che emana dal corpo cellulare sporge isotropicamente e persistentemente con poca o nessuna retrazione o stallo12. I protocolli di diffusione cellulare più comunemente utilizzati sono test di endpoint, in cui le cellule di diffusione sono fissate in vari momenti dopo laplaccatura 19,24. Questi test, sebbene rapidi e semplici, sono limitati nel loro potere diagnostico per rilevare i cambiamenti nelle caratteristiche dinamiche della lamellipodia. Per determinare i meccanismi molecolari che controllano la dinamica lamellipodia, il gruppo Sheetz ha aperto la strada all'uso dell'analisi quantitativa delle cellule di diffusione dal vivo e ha scoperto molte proprietà fondamentali delle sporgenze dei bordi cellulari11,12,22. Questi studi hanno dimostrato che il saggio di diffusione delle cellule vive è una tecnica robusta e potente nella cassetta degli attrezzi di un laboratorio di biologia cellulare. Nonostante ciò, un protocollo dettagliato e uno strumento computazionale open source per un saggio di diffusione di cellule vive non sono attualmente disponibili per la comunità della biologia cellulare. A tal fine, il nostro protocollo delinea le procedure di imaging delle cellule di diffusione dal vivo e fornisce uno strumento automatizzato di analisi delle immagini. Per convalidare questo metodo, abbiamo usato l'inibizione dell'Arp2/3 come trattamento sperimentale e abbiamo dimostrato che inibire la funzione del complesso Arp2/3 non ha arrestato la diffusione cellulare ma ha causato una significativa riduzione della velocità di protrusione cellulare, così come la stabilità delle sporgenze del bordo cellulare, dando origine a bordi cellulari frastagliati. Questi dati dimostrano che la combinazione di imaging a cellule vive e analisi automatizzata delle immagini è uno strumento utile per analizzare la dinamica dei bordi delle cellule e identificare componenti molecolari che regolano lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

La diffusione cellulare è un processo dinamico in cui una cellula sospesa nel supporto si attacca a un substrato e si appiattisce da una forma arrotondata a una sottile e distribuita. Seguendo l'attacco cellula-substrato, la cellula forma un sottile foglio di lamellipodia che emana dal corpo cellulare. Nella lamellipodia, i monomeri dell'actina globulare (G-actina) polimerizzano in una fitta rete ad actina filamentosa (F-actin) che spinge contro la membrana plasmatica, fornendo così le forze meccaniche necessarie per la diffusione della cellula. In particolare, i giocatori molecolari che controllano la polimerizzazione dell'actina nella lamellipodia sono essenziali per molti altri processi cellulari, come la migrazione cellulare e l'endocitosi. 
Poiché le cellule di diffusione formano lamellipodi continue che attraversano l'intera periferia cellulare e si espandono persistentemente verso l'esterno, i test di diffusione cellulare sono diventati uno strumento efficiente per valutare la cinetica delle sporgenze lamellipodiali. Sebbene siano state sviluppate diverse implementazioni tecniche del test di diffusione delle celle, attualmente manca una descrizione dettagliata del flusso di lavoro, che includerebbe sia un protocollo passo-passo che strumenti computazionali per l'analisi dei dati. Qui descriviamo le procedure sperimentali del saggio di diffusione cellulare e presentiamo uno strumento open source per l'analisi quantitativa e imparziale della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione. Se combinato con manipolazioni farmacologiche e/o tecniche di silenziamento genico, questo protocollo è suscettibile a uno schermo su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze lamellipodiali.

Il protocollo di cui sopra descrive le procedure sperimentali per l'imaging a cellule vive di cellule di diffusione e uno strumento computazionale per l'analisi quantitativa della dinamica di diffusione cellulare. Lo strumento computazionale può essere utilizzato in un formato a bassa o alta produttività per identificare i lettori molecolari che regolano i macchinari di polimerizzazione dell'actina all'avanguardia cellulare.
La rappresentazione schematica delle procedure sperimentali è illu...

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Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

In questo protocollo, presentiamo le procedure sperimentali di un saggio di diffusione cellulare basato sulla microscopia a cellule vive. Forniamo uno strumento computazionale open source per la segmentazione imparziale di cellule etichettate fluorescentmente e l'analisi quantitativa della dinamica lamellipodia durante la diffusione cellulare.

Analisi quantitativa della dinamica dei bordi cellulari durante la diffusione cellulare

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Il protocollo descritto in questo video definirà le procedure sperimentali necessarie per l'imaging a grandezza naturale delle cellule di diffusione e l'uso di uno strumento computazionale che quantifica le dinamiche di diffusione delle cellule in modo imparziale e automatizzato. La risorsa di diffusione cellulare consente il tracciamento continuo del movimento del bordo cellulare e dei cambiamenti morfologici durante la diffusione cellulare, che è una caratteristica che manca nella maggior parte dei test di diffusione cellulare esistenti. Anche questo protocollo implementa l'uso dell'elaborazione e dell'analisi automatizzata del computer, fornendo informazioni sulla circolarità cellulare, sui cicli di retrazione dell'area e della sporgenza delle cellule di diffusione.Tale elaborazione automatizzata riduce la distorsione nell'analisi dei dati e fornisce un metodo robusto per analizzare la dinamica di diffusione delle cellule per un gran numero di celle. Se combinato con trattamenti farmacologici o scienze e tecniche geniche, questo protocollo è suscettibile a velocità su larga scala di lettori molecolari che regolano le sporgenze cellulari. Per il protocollo specificato, Le cellule utilizzate sono fibroblasti embrionali di topo che codificano geneticamente PH-Akt-GFP, che consente l'etichettatura fluorescente della membrana plasmatica.Prima dell'inizio del test di diffusione della cellula, coltura di un piatto di cellule al 90% di confluenza. Una volta che le cellule hanno raggiunto la corretta confluenza, fiammare uno scivolo di copertura di 22 per 22 millimetri e posizionarlo in un piatto di coltura cellulare di 35 millimetri. Rivestire il coperchio con fibronectina che è stata diluita in PBS a una concentrazione di 2,5 microgrammi per millilitro.Posizionare il piatto con il coperchio scivolare in un incubatore di 37 gradi per un'ora. Dopo un'ora aspirare la fibronectina assicurandosi di non toccare lo scivolo del coperchio con la punta della pipetta. Lavare il piatto con PBS tubazione delicatamente intorno al coperchio scivolare da due a tre volte.Per la semina cellulare, iniziare aspirando il supporto di coltura cellulare dal piatto delle cellule. Successivamente, lavare il piatto con PBS caldo. Aggiungere 650 microlitri di tripside EDTA al piatto e inclinare il piatto per distribuire uniformemente l'enzima.Posizionare il piatto con la triptina nell'incubatrice per un minuto. Dopo l'incubazione dovrai prima aggiungere 10 millilitri di mezzi di coltura cellulare in un tubo di centrifuga. Successivamente, aggiungere rapidamente altri 10 millilitri di supporto nel piatto per temprare la triptina.Per diluire le cellule che verranno seminate sullo scivolo di copertura, pipettare un millilitro del contenuto del piatto nel tubo di centrifuga. Dal tubo, pipettare circa 500 a 1.000 microlitri di cellule diluite nel piatto con lo scivolo di copertura. Assicurarsi che lo slittamento del coperchio sia a una confluenza del 10% o 50.000 celle per millilitro e regolare il volume delle celle diluite in base alle esigenze.Lo scopo di queste celle è quello di stabilire un piano di messa a fuoco durante l'acquisizione dell'immagine. Con le cellule rimanenti nel piatto, passare un quinto delle cellule in un piccolo piatto per trattamento. Queste saranno le cellule che verranno analizzate per diffondere la dinamica.Posizionare i piatti di passaggio e la piastra di copertura in un'incubatrice per otto-24 ore. Per testare l'importanza dell'Arp2/3 per la diffusione cellulare, aggiungere prima cinque millilitri di mezzi di coltura cellulare in un tubo di controllo e centrifuga di trattamento. Aggiungere quindi 20 millilitri di dmem che manca di rosso fenolo in ciascuno dei due tubi di centrifuga più grandi.Pipetta o il farmaco CK-666 che è un inibitore del complesso Arp2/3 o il trattamento controllato come DMSO nei tubi piccoli e grandi. Per iniziare il trattamento farmacologico delle cellule, rimuovere i piatti di passaggio che stavano incubando durante la notte. Aspirare i mezzi di coltura cellulare da tutti i piatti e lavare i piatti con PBS caldo.Prendere i piccoli tubi contenenti CK-666 o controllare i supporti integrati e aggiungere il contenuto del tubo pertinente in ciascuna delle stoviglie di passaggio. Etichettare ciascuno dei piatti con il corretto trattamento farmacologico e quindi riposizionare i piatti nell'incubatrice per un'ora aggiuntiva Dopo un'ora di incubazione, aspirare il farmaco supporti integrati da ciascuno dei piatti. Quindi, aggiungere PBS caldo a tutti i piatti per rimuovere accuratamente tutti i restanti mezzi rosso fenolo.Aggiungere 230 microlitri di tripside EDTA e posizionare i piatti in un'incubatrice per un minuto. Rimuovere i piatti tripsinici dall'incubatrice e procedere ad aggiungere cinque millilitri del farmaco integrato dmem che manca di rosso fenolo in un tubo designato come tubo B.Quindi aggiungere altri cinque millilitri dello stesso supporto nel piatto pertinente per temprare la tripanoina. Pipettare il supporto su e giù più volte per staccare tutte le cellule dal piatto.Trasferire tutto il contenuto del piatto in un altro tubo che è già stato designato come tubo A.In modo da preparare una diluizione cellulare appropriata per l'imaging, trasferire un millilitro di cellule dal tubo A nel tubo B.Ripetere tutte le fasi di diluizione per ogni trattamento. Posizionare tutti i tubi nell'incubatore per 45 minuti per consentire alle cellule di riprendersi dalla tripsiinizzazione. Assicurarsi che tutte le parti di una camera magnetica cellulare in grado di ospitare uno slittamento di copertura di 22 per 22 millimetri siano state accuratamente pulite prima dell'uso.Rimuovere il piatto con la lapsus dall'incubatrice. Aspirare il supporto di coltura cellulare e lavare la lapsus con PBS caldo. Rimuovere lo slittamento del coperchio utilizzando un paio di forcep e posare delicatamente il coperchio sulla piastra inferiore della camera magnetica.Quindi prendi la guarnizione in silicone e posizionala sopra la slitta di copertura. Attaccare il corpo principale della camera magnetica sulla piastra inferiore. Aggiungere un millilitro del dmem privo di rosso fenolo corrispondente al trattamento pertinente alla camera magnetica.Prendi un tessuto privo di pelucchi e tampona con cura l'involucro tra il corpo principale e la piastra inferiore per verificare eventuali perdite. Per completare la camera magnetica, abbassare il coperchio trasparente sul corpo principale. Infine pulire il fondo del coperchio scivolare con un tessuto spruzzato con acqua e un altro spruzzato con 70% di etanolo.Preriscaldare l'incubatore superiore dello stadio di un microscopio confocale a 37 gradi. Posizionare la camera magnetica sopra l'obiettivo. Prima di acquisire dinamiche di diffusione, mettere a fuoco le cellule già polarizzate nel canale fluorescente verde.Ciò garantisce che le cellule di diffusione siano a fuoco una volta attaccate allo slittamento del coperchio. Rimuovere il coperchio trasparente della camera magnetica e dei microlitri pipetta 500 dal tubo B che è stato rimosso dall'incubatore. Riposizionare il coperchio trasparente sopra.Per identificare le cellule ideali per l'analisi della diffusione cellulare cercare aloni verdi che rappresentano cellule che devono ancora attaccarsi allo slittamento di copertura o che si trovano nelle prime fasi di attacco. Acquisire immagini e salvare i file. Dopo aver completato l'acquisizione dell'immagine della diffusione delle celle, inizia eseguendo un IDE Python compatibile come Spyder.Per l'analisi computazionale della dinamica di diffusione delle celle, individuare e aprire il file GUI di diffusione delle celle fornito nei pacchetti di script pertinenti. Premere il pulsante Esegui che aprirà il pannello GUI di analisi in background. La GUI ospita tutte le impostazioni necessarie per l'analisi.Per analizzare l'area delle celle e la circolarità, inserire il file di acquisizione e le impostazioni necessarie nella scheda area di diffusione cella. Le regolazioni dovranno essere effettuate a seconda del tipo di cella e dei parametri di acquisizione dell'immagine. Dopo aver premuto esegui, lo script creerà una circolarità cellulare e un grafico di area rispetto al tempo per tutte le celle di diffusione.Per i dati del kymograph, premere il generatore di kymograph e la scheda di analisi. Questa analisi richiede che i file di input siano ritagliati in stack di immagini a cella singola. Dopo aver inserito tutte le impostazioni e premuto esegui, lo script creerà più cimografi per la cella data.A sinistra ci sono cellule rappresentative dei trattamenti DMSO e CK-666, segmentate automaticamente utilizzando lo script fornito. A differenza della morfologia isotropa e altamente circolare dimostrata dalle cellule di controllo, le cellule inibite Arp2/3 mostrano una diminuzione della circolarità. Inoltre, i cimografi generati automaticamente forniscono una risoluzione temporale fondamentale per comprendere la dinamica delle sporgenze.Le celle di controllo sporgono persistentemente con piccole o nessuna retrazione. Al contrario, l'inibizione dell'Arp2/3 interrompe la stabilità delle sporgenze come indicato dall'aumento degli eventi di retrazione durante la diffusione. Questi video dovrebbero fornirti la comprensione di come seminare correttamente le cellule, eseguire trattamenti farmacologici e preparare strumenti di imaging e computazionali necessari per la quantificazione della dinamica di diffusione cellulare.Questo protocollo può essere ulteriormente combinato con l'imaging fluorescente del citoscheletro e i test di migrazione per identificare i lettori molecolari che governano le sporgenze cellulari. Grazie per la visione e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

quantitative-analysis-of-cell-edge-dynamics-during-cell-spreading

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Ricerca

Biologia

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Determinazione del numero delle cellule durante coltura cellulare utilizzando il contatore di cellule Scettro

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Diffondere superfici e Immunostaining di cromosomi del lievito

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Vivere la microscopia di fluorescenza delle cellule per osservare i processi essenziali durante la crescita delle cellule microbiche

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Lente-free Video microscopia per la dinamica e analisi quantitativa della coltura delle cellule aderenti

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.