Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
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이 작품은 S.P.에 Connaught 기금 새로운 조사상에 의해 지원되었다, 혁신을위한 캐나다 재단, NSERC 디스커버리 보조금 프로그램 (보조금 RGPIN-2015-05114 및 RGPIN-2020-05881), 맨체스터 대학과 토론토 대학 공동 연구 기금, 토론토 XSeed 프로그램 대학.

1. 셀 시드
참고: 기술된 세포 확산 프로토콜은 PH-Akt-GFP를 발현하는 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)를 사용하여 수행되었다(PIP3/PI(3,4)P2용형광 마커). 이러한 세포주들은 CRISPR 중재 유전자 편집에 의해 PH-Akt-GFP(Addgene #21218)에 대한 발현 구조를 genomically 통합하여 생성하였다. 그러나, 게놈에서 일시적으로 표현되거나 통합되는 그밖 형광 마커는 또한 이 분석에서 이?...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

설명된 세포 확산 분석법은 대부분의 세포 확산프로토콜(19,24)에서누락된 특징인 형태학적 변화(예를들어, 세포 크기 및 형상) 및 세포 에지운동(즉, 돌출 속도 및 회수 주파수)의 지속적인 추적을 허용한다. 일반적으로 사용되는 종점 세포 확산 은 세포 확산 속도의 측정을 허용하지만, 이러한 아사약은 셀 에지 운동의 시간 역학을 해결하?...

Lamellipodial 돌출은 마이그레이션 셀의 전면에 형성된 눈에 띄는 사이토켈레탈 구조입니다. 라멜리포디아에서는 Arp2/3 복합체 및 포르민의 도움으로 액틴의 중합화가 플라즈마 멤브레인1,2에밀어내는 빠르게 성장하는 분기 액틴 메쉬워크를 생성한다. 액틴 메쉬워크에 의해 생성된 푸시 력은셀을1,3,4,5로물리적으로추진한다. Arp2/3 복잡하고 라멜리포성 돌출에 필수적인 신호 경로의 중단은 종종 세포 마이그레이션6, 7을손상시합니다. 라멜레포디아 결핍 세포의 이동도8,9,세포 이동에서 라멜리포디아의 중요성은 이러한 돌출 구조의 고갈로 명백하다 는 것은 세포의 복잡한 생물학적 미세환경6,10을통해 이동하는 세포의 능력을 퍼튜브한다.
이동 세포에서 라멜리포디아의 조절을 이해하는 주요 장애물은 라미포리 포성 돌출 운동, 크기 및 모양11,12,13,14의자연적인 가변성이다. 더욱이, 최근 연구는 라멜리포디아가 변동, 주기적, 가속돌출14,15를포함하여 복잡한 돌출행동을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 이동 세포의 고가변 라멜리포디아에 비해6,16,세포 확산 시 형성된 라멜리포디아는 더 균일한12이다. 세포 확산 및 이동세포의 돌출활성은 분지액망, 수축성 아토묘신 번들, 및 통합계 세포매트릭스접착(17,18)을포함하는 동일한 거시분자 어셈블리에 의해 구동되기 때문에, 확산세포는 라멜리포디아역학의 조절을 조사하기 위한 모델로 널리 사용되고 있다.
세포확산은 현탁액내 세포가 먼저 정립기반 접착착(17,19,20)을 통해 기판에 부착한 다음 액틴기반돌출21,22,23을연장하여 확산되는 동적 메카노케미컬 공정이다. 확산 단계에서, 세포 체에서 방출되는 라멜리포디아는 거의 또는 전혀 후퇴또는 실속없이 이소열대및 지속적으로 돌출된다12. 가장 일반적으로 사용되는 세포 확산 프로토콜은19,24를도금한 후 확산 세포가 여러 번에 고정되는 엔드포인트 분석입니다. 이 assays는 빠르고 간단하지만 라멜리포디아의 동적 기능의 변화를 감지하기 위해 진단 능력이 제한됩니다. 라멜리포디아 역학을 제어하는 분자 메커니즘을 결정하기 위해, 시트츠 그룹은 살아있는 확산 세포의 정량적 분석의 사용을 개척하고 세포 가장자리 돌출의 많은 기본 특성을 발견11,12,22. 이러한 연구는 살아있는 세포 확산 분석이 세포 생물학 실험실의 도구 상자에 강력하고 강력한 기술임을 입증했다. 그럼에도 불구하고, 살아있는 세포 확산 분석에 대한 상세한 프로토콜 및 오픈 소스 계산 도구는 현재 세포 생물학 커뮤니티에 사용할 수 없습니다. 이를 위해 당사의 프로토콜은 라이브 확산 세포를 이미징하는 절차를 설명하고 자동화된 이미지 분석 도구를 제공합니다. 이러한 방법을 검증하기 위해 Arp2/3 억제를 실험적 치료법으로 사용했으며, Arp2/3 복합체의 기능을 억제하는 것은 세포 확산을 억제하지 는 않았지만 세포 돌출 속도의 안정성뿐만 아니라 세포 가장자리 돌출의 안정성뿐만 아니라 들쭉날쭉한 세포 가장자리를 야기하는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 라이브 셀 이미징과 자동화된 이미지 분석의 조합이 세포 가장자리 역학을 분석하고 lamellipodia를 조절하는 분자 구성 요소를 식별하는 데 유용한 도구임을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

세포 확산은 매체에 매달려 있는 셀이 기판에 부착되어 둥근 모양에서 얇고 확산된 모양으로 자신을 평평하게 하는 동적 프로세스입니다. 세포 기판 부착에 따라, 세포는 세포 체에서 방출되는 라멜리포디아의 얇은 시트를 형성한다. 라멜리포디아에서, 구형 액틴(G-actin) 단량체는 플라즈마 멤브레인에 밀어 넣는 조밀한 필라멘트 액틴(F-actin) 메쉬워크로 중합하여 세포가 퍼지는 데 필요한 기계적 힘을 제공한다. 특히, 라멜리포디아에서 액틴 중합화를 제어하는 분자 플레이어는 세포 이동 및 내분비증과 같은 많은 다른 세포 공정에 필수적입니다. 
확산 세포는 전체 세포 주변을 가로 지르고 지속적으로 바깥쪽으로 확장 연속 라멜리포디아를 형성하기 때문에 세포 확산 분석은 lamellipodial 돌출의 운동을 평가하는 효율적인 도구가되었습니다. 셀 확산 분석의 여러 기술적 구현이 개발되었지만 단계별 프로토콜과 데이터 분석을 위한 계산 도구가 모두 포함된 워크플로우에 대한 자세한 설명은 현재 부족합니다. 여기서, 우리는 세포 확산 분석의 실험 절차를 설명하고 확산 하는 동안 세포 가장자리 역학의 정량적이고 편견 없는 분석을 위한 오픈 소스 도구를 제시. 약리학적 조작 및/또는 유전자 침묵 기술과 결합될 때, 이 프로토콜은 적각돌출을 조절하는 분자 플레이어의 대규모 스크린에 순종적입니다.

위의 프로토콜은 확산 세포의 라이브 셀 이미징에 대한 실험 절차와 세포 확산 역학의 정량적 분석을위한 계산 도구를 설명합니다. 상기 계산 도구는 낮은 또는 고처리량 형식으로 사용될 수 있으며, 세포 앞가장자리에서 액틴 중합 기계류를 조절하는 분자 플레이어를 식별할 수 있다.
실험 절차의 회로도 표현은 도 1에묘사된다. 세포 확산 분석은<sup cla...

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Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

이 프로토콜에서, 우리는 살아있는 세포 현미경 검사법을 기반으로 하는 세포 퍼지는 분석의 실험 절차를 제시합니다. 당사는 형광으로 표지된 세포의 편견없는 세분화와 세포 확산 중 라멜리포디아 역학의 정량적 분석을 위한 오픈 소스 계산 도구를 제공합니다.

셀 확산 시 셀 엣지 역학의 정량적 분석

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

이 비디오에 설명된 프로토콜은 확산 세포의 실물 크기 이미징및 분산되는 세포가 편견없고 자동화된 방식으로 역학을 전파하는 것을 정량화하는 계산 도구의 사용에 필요한 실험 적 절차를 정의합니다. 세포 확산 자산은 세포 확산 시 세포 가장자리 이동 및 형태학적 변화를 지속적으로 추적할 수 있으며, 이는 대부분의 기존 세포 확산 작용에서 누락된 기능입니다. 또한 이 프로토콜은 자동화된 컴퓨터 처리 및 분석을 구현하여 확산 셀의 세포 순환, 영역 및 돌출 회수 주기에 대한 정보를 제공합니다.이러한 자동화된 처리는 데이터 분석의 바이어스를 줄이고 많은 수의 셀에 대한 세포 확산 역학을 분석하는 강력한 방법을 제공합니다. 약물 치료 또는 유전자 과학 및 기술과 결합될 때, 이 프로토콜은 세포 돌출을 조절하는 분자 선수의 대규모 속도에 순종합니다. 주어진 프로토콜을 위해, 사용된 세포는 유전으로 플라즈마 막의 형광 태깅을 허용하는 PH-Akt-GFP를 인코딩하는 마우스 배아 섬유아세포입니다.세포 확산 분석의 시작 에 앞서, 90 %의 수렴에 세포의 접시를 배양. 세포가 적절한 합류를 달성하면 22 by 22 밀리미터 커버 슬립을 화염화하여 35mm 세포 배양 접시에 넣습니다. PBS에서 희석된 섬유네틴으로 커버 슬립을 밀리리터당 2.5 마이크로그램의 농도로 코팅합니다.커버 슬립으로 접시를 37도 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 1 시간 후 피펫 끝으로 커버 슬립을 만지지 않도록 섬유 네틴을 흡인. 커버 주위에 부드럽게 파이프를 돌리면 PBS로 접시를 2~3번 씻어냅니다.세포 파종의 경우, 세포의 접시에서 세포 배양 배지를 흡입하여 시작합니다. 그 후 따뜻한 PBS로 접시를 씻으십시오. 접시에 트립신 EDTA 650 마이크로 리터를 추가하고 균등하게 효소를 배포하는 접시를 기울입니다.트립신과 함께 접시를 인큐베이터에 1분간 넣습니다. 인큐베이션 후 먼저 원심분리기 튜브에 세포 배양 배지 10 밀리리터를 추가해야합니다. 다음으로 트립신을 담금질하기 위해 10 밀리리터의 미디어를 접시에 빠르게 추가합니다.커버 슬립에 씨를 뿌릴 세포를 희석시키기 위해 접시 내용물의 1밀리리터를 원심분리기 튜브에 넣습니다. 튜브에서 파이펫 약 500 ~ 1, 000 마이크로 리터의 희석 된 세포가 커버 슬립으로 접시에 넣습니다. 커버 슬립이 밀리리터당 10%의 인플루언서 또는 50, 000세포에 있는지 확인하고 필요에 따라 희석된 세포의 부피를 조절합니다.이러한 세포의 목적은 이미지 수집 중에 초점 평면을 설정하는 것입니다. 나머지 세포가 접시에 들어오면 세포의 5분의 1을 치료당 하나의 작은 접시로 통과시다. 이들은 역학을 퍼뜨리기 위해 분석될 세포일 것입니다.통로 요리와 커버 슬립 접시를 인큐베이터에 8~24시간 동안 넣습니다. 세포 확산을 위한 Arp2/3의 중요성을 시험하기 위하여는, 먼저 대조군 및 처리 원심분리기 관에 세포 배양 매체의 5밀리리터를 추가합니다. 다음으로 두 개의 큰 원심분리기 튜브각각에 페놀 레드가 부족한 20 밀리리터의 dmem을 추가합니다.파이펫은 Arp2/3 복합체의 억제제 또는 DMSO와 같은 통제된 치료법인 약물 CK-666을 크고 큰 튜브로 한다. 세포의 약리학적 치료를 시작하려면 하룻밤 동안 배양된 통로 요리를 제거하십시오. 모든 접시에서 세포 배양 매체를 흡인하고 따뜻한 PBS로 설거지를 씻으세요.CK-666을 포함하는 작은 튜브를 가져 가거나 보충 된 미디어를 제어하고 관련 튜브의 내용을 각 통로 접시에 추가하십시오. 각 요리에 올바른 약물 치료로 라벨을 붙인 다음 1시간 동안 배양 한 시간 후에 추가 시간 동안 인큐베이터에 다시 접시를 넣고 각 요리에서 약물 보충 매체를 흡인시합니다. 다음으로, 나머지 페놀 레드 미디어를 모두 철저히 제거하기 위해 모든 요리에 따뜻한 PBS를 추가합니다.트립신 EDTA 230 마이크로리터를 넣고 1분간 인큐베이터에 요리를 넣습니다. 인큐베이터에서 트립시네이징 된 접시를 제거하고 튜브 B로 지정된 튜브에 페놀 레드가 부족한 약물 보충 dmem의 5 밀리리터를 추가한 다음 트립신을 담금질하기 위해 동일한 미디어의 5 밀리리터를 관련 접시에 추가합니다. 접시에서 모든 세포를 분리하기 위해 미디어를 여러 번 위아래로 피펫합니다.이미 튜브로 지정된 다른 튜브로 접시의 모든 내용을 전송 A.In 화상 진찰에 적합한 세포 희석을 준비하는 순서, 튜브 A에서 튜브 B.반복 각 치료에 대한 희석 단계를 모두 반복. 모든 튜브를 45분 동안 인큐베이터에 넣고 세포가 트립시화에서 회복할 수 있도록 합니다. 22 mm 22mm 커버 슬립을 수용 할 수있는 세포 자기 챔버의 모든 부분이 사용하기 전에 철저히 청소되었는지 확인하십시오.인큐베이터에서 덮개 슬립으로 접시를 제거합니다. 세포 배양 매체를 흡인하고 따뜻한 PBS로 커버 슬립을 씻으세요. 한 쌍의 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거하고 커버를 자기 챔버의 하단 플레이트에 부드럽게 놓습니다.그런 다음 실리콘 개스킷을 들고 덮개 슬립 위에 놓습니다. 자기 챔버의 본체를 하단 플레이트에 부착합니다. 자기 챔버에 관련 치료에 대응하는 페놀 레드가 부족한 dmem의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다.보풀이 없는 조직을 가지고 조심스럽게 누출을 확인하기 위해 본체와 하단 플레이트 사이의 인클로저를 두드려. 자기 챔버를 완료하려면 투명 커버를 본체에 낮춥춥시다. 마지막으로 물로 분사된 조직과 70%에탄올로 살포된 티슈로 커버 슬립의 바닥을 닦아냅니다.공초점 현미경의 스테이지 탑 인큐베이터를 37도로 예열합니다. 자기 챔버를 목표 위에 놓습니다. 확산 역학을 획득하기 전에 녹색 형광 채널에서 이미 편광 된 세포에 초점을 설정합니다.이렇게 하면 퍼지는 세포가 커버 슬립에 부착하면 초점이 맞춰집니다. 인큐베이터에서 제거된 튜브 B에서 자기 챔버 및 파이펫 500 마이크로리터의 투명 커버를 제거합니다. 투명 커버를 맨 위에 다시 놓습니다.세포 확산 분석에 이상적인 세포를 식별하려면 아직 커버 슬립에 부착하지 않았거나 부착의 초기 단계에있는 세포를 나타내는 녹색 후광을 검색합니다. 이미지를 획득하고 파일을 저장합니다. 셀 확산의 이미지 수집을 완료 한 후, Spyder와 같은 호환 파이썬 IDE를 실행하여 시작합니다.셀 확산 역학의 계산 분석을 위해 관련 스크립트 패키지에 제공된 GUI 파일을 확산하는 셀을 찾아 엽니다. 백그라운드에서 분석 GUI 패널을 여는 실행 버튼을 누릅니다. GUI에는 분석에 필요한 모든 설정이 있습니다.셀 영역 및 순환을 분석하려면 셀 스프레드 영역 탭에서 획득 파일 및 필요한 설정을 입력합니다. 셀 유형 및 이미지 수집 매개 변수에 따라 조정해야 합니다. 실행을 누른 후 스크립트는 모든 확산 셀에 대한 셀 원형 및 영역 대 시간 플롯을 만듭니다.kymograph 데이터의 경우 kymograph 생성기 및 분석 탭을 누릅니다. 이 분석을 위해서는 입력 파일을 단일 셀 이미지 스택을 잘라야 합니다. 모든 설정을 삽입하고 실행을 누른 후 스크립트는 지정된 셀에 대해 여러 kymographs를 생성합니다.왼쪽에는 DMSO 및 CK-666 처리의 대표 셀이 제공되며 제공된 스크립트를 사용하여 자동으로 분할됩니다. 대조군 세포에 의해 입증된 등위및 고원형태와는 반대로, Arp2/3 억제된 세포는 감소된 순환을 나타낸다. 또한 자동으로 생성된 kymographs는 돌출의 역학을 이해하는 데 중요한 시간적 해상도를 제공합니다.제어 셀은 거의 또는 전혀 후퇴없이 지속적으로 돌출. 대조적으로, Arp2/3 억제는 확산을 통해 후퇴 이벤트의 증가에 의해 표시된 돌출의 안정성을 방해합니다. 이 비디오는 세포를 올바르게 종자하고, 약리학적 치료를 수행하고, 세포 확산 역학의 정량화에 필요한 이미징 및 계산 도구를 준비하는 방법에 대한 이해를 제공해야합니다.이 프로토콜은 세포 돌출을 지배하는 분자 플레이어를 확인하기 위해 세포 골격 형광 화상 진찰 및 이주 분석과 더 결합 될 수 있습니다. 당신의 실험으로 보고 행운을 주셔서 감사합니다.

quantitative-analysis-of-cell-edge-dynamics-during-cell-spreading

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

형광등을 통해 F - 굴지 역학 라이브 셀 이미징은 현미경을 스페클 (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

연구

생물학

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

샙터 셀 카운터를 사용하여 세포 배양 동안 휴대폰 번호를 결정

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

양적 휘트니스 분석 워크플로우

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

표면 확산과 효모 염색체의 면역 염색

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.