Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Connaught Fund New Investigator Award til S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (tilskudd RGPIN-2015-05114 og RGPIN-2020-05881), University of Manchester og University of Toronto Joint Research Fund, og University of Toronto XSeed Program.

1. Celle såing
MERK: Den beskrevne cellespredningsprotokollen ble utført ved hjelp av musens embryonale fibroblaster (MEFer) som uttrykker PH-Akt-GFP (en fluorescerende markør for PIP3/PI(3,4)P2). Denne cellelinjen ble generert ved genomisk integrering av en uttrykkskonstruksjon for PH-Akt-GFP (Addgene #21218) ved CRISPR-mediert genredigering. Imidlertid kan andre fluorescerende markører som uttrykkes forbigående eller integrert i genomet også brukes i denne analysen....

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

Den beskrevne cellespredningsanalysen muliggjør kontinuerlig sporing av morfologiske endringer(f.eks. cellestørrelse og -form) og cellekantbevegelser (dvs. fremspringshastighet og tilbaketrekkingsfrekvens), som mangler i de fleste cellespredningsprotokoller19,24. Mens ofte brukte sluttpunktcellespredningsanalyser tillater bestemmelse av cellespredningshastighet, klarer ikke disse analysene å løse den tidsmessige dynamikken i cellekantbevegel...

Lamellipodiale fremspring er fremtredende cytoskeletale strukturer dannet på forsiden av en migrerende celle. I lamellipodia skaper polymerisering av aktin ved hjelp av Arp2/3-komplekset og formins et raskt voksende forgrenet aktinnettverk som skyver mot plasmamembranen1,2. Trykkkraften som genereres av aktinnettverket, driver fysisk cellen fremover1,3,4,5. Uttømming av Arp2/3-komplekset eller forstyrrelse av signalveier som er avgjørende for lamellipodiale fremspring, svekker ofte cellemigrasjon6, 7. Selv om migrasjon av lamellipodia-mangelfulle celler også har blitt rapportert8,9, er betydningen av lamellipodia i cellemigrasjon tydelig som uttømming av denne fremspringende strukturen perturberer cellens evne til å bevege seg gjennom komplekse biologiske mikromiljøet6,10.
En stor hindring for å forstå reguleringen av lamellipodia i migrerende celler er den naturlige variasjonen i lamellipodial fremspring kinetikk, størrelse og form11,12,13,14. Videre har nyere studier vist at lamellipodia viser kompleks fremspringende oppførsel, inkludert svingende, periodiske og akselererende fremspring14,15. Sammenlignet med den svært variable lamellipodia av migrerende celler6,16, er lamellipodia dannet under cellespredning mer ensartet12. Siden den fremspringende aktiviteten med å spre og migrere celler er drevet av identiske makromolekylære samlinger, som inkluderer et forgrenet aktinnettverk, sammentrekningsformede actomyosinbunter og integrinbaserte cellematriseadhesjoner17,18, har spredningsceller blitt mye brukt som modell for å undersøke reguleringen av lamellipodiadynamikk.
Cellespredning er en dynamisk mekanokjemisk prosess der en celle i suspensjon først holder seg til et substrat gjennom integrinbaserte adhesjoner17,19,20 og deretter sprer seg ved å utvide aktinbaserte fremspring21,22,23. Under spredningsfasen stikker lamellipodia ut fra cellekroppen isotropisk og vedvarende med liten eller ingen tilbaketrekning eller stalling12. De mest brukte cellespredningsprotokollene er endepunktanalyser, der spredning av celler er faste på forskjellige tidspunkter etter plating19,24. Disse analysene, selv om de er raske og enkle, er begrenset i sin diagnostiske kraft til å oppdage endringer i de dynamiske egenskapene til lamellipodia. For å bestemme de molekylære mekanismene som kontrollerer lamellipodiadynamikken, var Sheetz-gruppen en pioner innen bruk av kvantitativ analyse av levende spredningsceller og avdekket mange grunnleggende egenskaper ved cellekantprotrudering11,12,22. Disse studiene har vist at live-celle spredningsanalysen er en robust og kraftig teknikk i verktøykassen til et cellebiologisk laboratorium. Til tross for det er et detaljert protokoll- og åpen kildekode-beregningsverktøy for en live-celle spredningsanalyse for tiden utilgjengelig for cellebiologisamfunnet. For dette formål skisserer protokollen vår prosedyrene for avbildning av direkte spredningsceller og gir et automatisert bildeanalyseverktøy. For å validere denne metoden brukte vi Arp2/3-hemming som eksperimentell behandling og viste at hemming av funksjonen til Arp2/3-komplekset ikke arresterte cellespredning, men forårsaket en betydelig reduksjon i celleutstikkhastigheten, samt stabiliteten til cellekantutstikk, noe som ga opphav til hakkede cellekanter. Disse dataene viser at kombinasjonen av levende celleavbildning og automatisert bildeanalyse er et nyttig verktøy for å analysere cellekantdynamikk og identifisere molekylære komponenter som regulerer lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

Celleoppslag er en dynamisk prosess der en celle som er suspendert i medier, knyttes til et underlag og flater seg ut fra en avrundet til en tynn og spredt form. Etter celle-substratet danner cellen et tynt ark med lamellipodia som kommer fra cellekroppen. I lamellipodia polymeriserer kulefikale aktin (G-aktin) monomerer til et tett filamentøst aktin (F-aktin) maskearbeid som skyver mot plasmamembranen, og gir dermed de mekaniske kreftene som kreves for at cellen skal spre seg. Spesielt er de molekylære spillerne som kontrollerer aktinpolymeriseringen i lamellipodia avgjørende for mange andre cellulære prosesser, for eksempel cellemigrasjon og endokytose. 
Siden spredning av celler danner kontinuerlig lamellipodia som spenner over hele celleperiphery og vedvarende ekspanderer utover, har cellespredningsanalyser blitt et effektivt verktøy for å vurdere kinetikken til lamellipodiale fremspring. Selv om flere tekniske implementeringer av cellespredningsanalysen er utviklet, mangler det for tiden en detaljert beskrivelse av arbeidsflyten, som vil inkludere både en trinnvis protokoll og beregningsverktøy for dataanalyse. Her beskriver vi de eksperimentelle prosedyrene for cellespredningsanalysen og presenterer et åpen kildekodeverktøy for kvantitativ og objektiv analyse av cellekantdynamikk under spredning. Kombinert med farmakologiske manipulasjoner og/eller gen-silencing teknikker, er denne protokollen egnet til en storskala skjerm av molekylære spillere som regulerer lamellipodiale fremspring.

Protokollen ovenfor beskriver de eksperimentelle prosedyrene for live-celleavbildning av spredningsceller og et beregningsverktøy for kvantitativ analyse av cellespredningsdynamikk. Beregningsverktøyet kan brukes i et lav- eller høygjennomstrømningsformat for å identifisere molekylære aktører som regulerer aktinpolymeriseringsmaskineriet i celleforkanten.
Den skjematiske representasjonen av de eksperimentelle prosedyrene er avbildet i figur 1. Cellesprednin...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

I denne protokollen presenterer vi eksperimentelle prosedyrer for en cellespredningsanalyse som er basert på levende cellemikroskopi. Vi tilbyr et beregningsverktøy med åpen kildekode for objektiv segmentering av fluorescerende merkede celler og kvantitativ analyse av lamellipodiadynamikk under cellespredning.

Kvantitativ analyse av cellekantdynamikk under cellespredning

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Protokollen beskrevet i denne videoen vil definere de eksperimentelle prosedyrene som kreves for avbildning av spredningsceller i livsstørrelse og bruk av et beregningsverktøy som kvantifiserer celler som sprer dynamikk på en objektiv og automatisert måte. Cellespredningsressursen gjør det mulig å spore cellekantbevegelser kontinuerlig og morfologiske endringer under cellespredning, som er en funksjon som mangler i de fleste eksisterende cellespredningsanalyser. I tillegg implementerer denne protokollen bruk av automatisert databehandling og analyse, og gir informasjon om cellesirkularitet, areal- og fremsprings tilbaketrekkingssykluser for spredning av celler.Slik automatisert behandling reduserer skjevheter i dataanalyse og gir en robust metode for å analysere cellespredningsdynamikk for et stort antall celler. Når den kombineres med narkotikabehandlinger eller genvitenskap og teknikker, er denne protokollen egnet til store hastigheter av molekylære spillere som regulerer celleutstikk. For den gitte protokollen, Cellene som brukes er mus embryonale fibroblaster som genetisk koder PH-Akt-GFP, noe som muliggjør fluorescerende merking av plasmamembranen.Før begynnelsen av cellen sprer analyse, kultur en tallerken med celler til 90% samløp. Når cellene har oppnådd riktig samløp, flamme en 22 x 22 millimeter deksel slip og plassere den i en 35 millimeter celle kulturrett. Belegge dekselslippet med fibronektin som har blitt fortynnet i PBS til en konsentrasjon på 2,5 mikrogram per milliliter.Plasser retten med dekselet gli inn i en 37 graders inkubator i en time. Etter en time aspirerer du fibronectinet og sørger for ikke å berøre dekselslippet med pipettespissen. Vask fatet med PBS ved å pipetter forsiktig rundt dekselet slip to til tre ganger.For cellesåing begynner du med å aspirere cellekulturmediene fra parabolen av celler. Deretter vasker du parabolen med varm PBS. Tilsett 650 mikroliter trypsin EDTA i parabolen og vipp parabolen jevnt for å fordele enzymet jevnt.Plasser parabolen med trypsin i inkubatoren i ett minutt. Etter inkubasjon må du først legge til 10 milliliter cellekulturmedier i et sentrifugerør. Deretter legger du raskt til ytterligere 10 milliliter medier i parabolen for å slukke trypsin.For å fortynne cellene som skal frøs på dekselslippet, pipette en milliliter av parabolens innhold inn i sentrifugerøret. Fra røret, pipette ca 500 til 1000 mikroliter fortynnede celler inn i parabolen med dekselslippet. Forsikre deg om at dekselslippet er på 10% samløp eller 50.000 celler per milliliter og juster volumet av fortynnede celler etter behov.Hensikten med disse cellene er å etablere et fokusplan under bildeanskaffelse. Med de resterende cellene i parabolen, passerer du en femtedel av cellene i en liten tallerken per behandling. Dette vil være cellene som vil bli analysert for spredning av dynamikk.Plasser passasjerettene og dekselets glidefat i en inkubator i åtte til 24 timer. For å teste betydningen av Arp2/3 for cellespredning, legg først fem milliliter cellekulturmedier inn i en kontroll og et behandlingssentrifugerør. Deretter legger du til 20 milliliter dmem som mangler fenolrød i hvert av to større sentrifugerør.Pipette enten stoffet CK-666 som er en hemmer av Arp2/3-komplekset eller den kontrollerte behandlingen som DMSO i de små og store rørene. For å begynne farmakologisk behandling av cellene, fjern passasjerettene som inkuberer over natten. Aspirer cellekulturmediene fra alle rettene og vask oppvasken med varm PBS.Ta de små rørene som inneholder enten CK-666 eller kontrollsupplerte medier og legg til innholdet i det aktuelle røret i hver av passasjerettene. Merk hver av rettene med riktig legemiddelbehandling, og legg deretter oppvasken tilbake i inkubatoren i en ekstra time Etter en times inkubasjon aspirerer du stoffet supplert media fra hver av rettene. Deretter legger du til varm PBS til alle rettene for å fjerne alle de gjenværende fenolrøde mediene grundig.Tilsett 230 mikroliter trypsin EDTA og legg oppvasken i en inkubator i ett minutt. Fjern de trypsiniserte rettene fra inkubatoren og fortsett å legge til fem milliliter av stoffet supplert dmem som mangler fenolrød i et rør utpekt som rør B.Legg deretter ytterligere fem milliliter av samme medier inn i den aktuelle parabolen for å slukke trypsin. Pipette media opp og ned flere ganger for å løsne alle cellene fra parabolen.Overfør alt innholdet i parabolen til et annet rør som allerede er utpekt som rør A.In for å forberede en cellefortynning som passer for avbildning, overfør en milliliter celler fra rør A til rør B.Gjenta alle fortynningstrinnene for hver behandling. Plasser alle rørene i inkubatoren i 45 minutter for å la cellene komme seg etter trypsinisering. Sørg for at alle deler av et cellemagnetisk kammer som har plass til en 22 x 22 millimeter dekselsglidning, er grundig rengjort før bruk.Fjern fatet med dekselslippet fra inkubatoren. Aspirer cellekulturmediene og vask dekselslippet med varm PBS. Fjern dekselslippet med et par tang og legg forsiktig dekselslippet på bunnplaten på det magnetiske kammeret.Deretter plukker du opp silikonpakningen og legger den på toppen av dekselslippet. Fest hoveddelen av det magnetiske kammeret på bunnplaten. Tilsett en milliliter av dmemen som mangler fenolrød som tilsvarer den aktuelle behandlingen til det magnetiske kammeret.Ta et lofritt vev og forsiktig dab kabinettet mellom hoveddelen og bunnplaten for å se etter lekkasjer. For å fullføre det magnetiske kammeret, senk det gjennomsiktige dekselet på hoveddelen. Tørk til slutt bunnen av dekselslippet med et vev sprayet med vann og en annen sprayet med 70% etanol.Forvarm scenen topp inkubator av et konfokalt mikroskop til 37 grader. Plasser det magnetiske kammeret på toppen av målet. Før du kjøper spredningsdynamikk, sett fokus på de allerede polariserte cellene i den grønne fluorescerende kanalen.Dette sikrer at spredningscellene er i fokus når de festes til dekselslippet. Fjern det gjennomsiktige dekselet til magnetkammeret og pipetten 500 mikroliter fra rør B som ble fjernet fra inkubatoren. Plasser det gjennomsiktige dekselet på toppen igjen.For å identifisere celler som er ideelle for cellespredningsanalyse, søk etter grønne glorier som representerer celler som ennå ikke er festet til omslagsseddelen eller er i de tidligste stadiene av vedlegget. Hent bilder og lagre filene. Etter å ha fullført bildeanskaffelsen av cellespredning, begynner du med å kjøre en kompatibel Python IDE som Spyder.For beregningsanalyse av cellespredningsdynamikk, finn og åpne cellen som sprer GUI-filen som er gitt i de relevante skriptpakkene. Trykk på kjør-knappen som åpner analyse-GUI-panelet i bakgrunnen. GUI huser alle innstillingene som trengs for analyse.Hvis du vil analysere celleområde og sirkularitet, skriver du inn anskaffelsesfilen og de nødvendige innstillingene i kategorien celleoppslagsområde. Justeringer må gjøres avhengig av celletype og bildeanskaffelsesparametere. Etter å ha trykket på kjøringen, vil skriptet opprette en celle sirkularitet og areal kontra tidsplott for alle spredende celler.For kymografdata trykker du på kymografgeneratoren og analysefanen. Denne analysen krever at inndatafiler beskjæres enkeltcellede bildestakker. Etter å ha satt inn alle innstillingene og trykket på kjør, vil skriptet opprette flere kymografier for den gitte cellen.Til venstre er representative celler fra DMSO- og CK-666-behandlingene, automatisk segmentert ved hjelp av det medfølgende skriptet. I motsetning til den isotropiske og svært sirkulære morfologien demonstrert av kontrollceller, viser Arp2/3-hemmet celler redusert sirkularitet. I tillegg gir de automatisk genererte kymografiene timelig oppløsning som er avgjørende for å forstå dynamikken i fremspring.Kontrollceller stikker ut vedvarende med lite eller ingen tilbaketrekninger. Til sammenligning forstyrrer Arp2/3-hemming stabiliteten til fremspringene som indikert av økningen i tilbaketrekningshendelser gjennom spredning. Denne videoene skal gi deg forståelse for hvordan du skal frøceller riktig, utføre farmakologiske behandlinger og forberede avbildnings- og beregningsverktøy som er nødvendige for kvantifisering av cellespredningsdynamikk.Denne protokollen kan kombineres ytterligere med cytoskeleton fluorescerende avbildnings- og migrasjonsanalyser for å identifisere molekylære aktører som styrer celleutstikk. Takk for at du så på og lykke til med eksperimentene dine.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kvantitative Live-Cell fluorescens-mikroskopi Analyse av Fission gjær

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ fitnessanalyse Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Surface Sprer og Farging av gjær Kromosomer

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Objektivet-gratis Video mikroskopi for dynamisk og kvantitativ analyse av tilhenger cellekultur

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...