Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelo Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (bolsas RGPIN-2015-05114 e RGPIN-2020-05881), University of Manchester and University of Toronto Joint Research Fund e University of Toronto XSeed Program.

1. Semeadura celular
NOTA: O protocolo de disseminação de células descrito foi realizado utilizando fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) expressando PH-Akt-GFP (um marcador fluorescente para PIP3/PI(3,4)P2). Esta linha celular foi gerada pela integração genomicamente de uma construção de expressão para PH-Akt-GFP (Addgene #21218) pela edição de genes mediada pelo CRISPR. No entanto, outros marcadores fluorescentes que são expressos transitoriamente ou...

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	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

O ensaio de disseminação de células descrito permite o rastreamento contínuo de alterações morfológicas (por exemplo, tamanho e forma da célula) e movimentos de borda celular(ou seja, velocidade de saliência e frequência de retração), que são características ausentes na maioria dos protocolos de disseminaçãocelular 19,24. Embora os ensaios de disseminação de células de ponto final comumente usados permitam a determinação da ...

As saliências lamellipodias são estruturas citoesqueléticos proeminentes formadas na frente de uma célula migratória. Em lamellipodia, a polimerização do actin com o auxílio do complexo Arp2/3 e formins cria um trabalho de malha de actina ramificada de rápido crescimento que empurra contra a membrana plasmática1,2. A força de empurrão gerada pelo trabalho de malha de actina impulsiona fisicamente a célula para a frente1,3,4,5. Esgotamento do complexo Arp2/3 ou interrupção de vias de sinalização essenciais para saliências lamellipodias muitas vezes prejudicam a migração celular6, 7. Embora a migração de células deficientes de lamellipodia também tenha sido relatada8,9, a importância da lamellipodia na migração celular é evidente como o esgotamento dessa estrutura protrusiva perturba a capacidade da célula de se mover através de microambientes biológicos complexos6,10.
Um grande empecilho para entender a regulação da lamellipodia em células migratórias é a variabilidade natural na cinética de protrusão lamellipodial, tamanho e forma11,12,13,14. Além disso, estudos recentes demonstraram que a lamellipodia apresenta comportamentos salitivos complexos, incluindo saliências flutuantes, periódicas e aceleradas14,15. Em comparação com a lamellipodia altamente variável das células migratórias6,16, a lamellipodia formada durante a disseminação celular são mais uniformes12. Uma vez que a atividade strusiva de células disseminadas e migratórias é impulsionada por conjuntos macromoleculares idênticos, que incluem uma rede de actina ramificada, feixes de actomyosina contracttil e aderências de matriz celular baseada em integrin17,18, células disseminadas têm sido amplamente utilizadas como modelo para investigar a regulação da dinâmica da lamellipodia.
A disseminação celular é um processo mecanoquímico dinâmico onde uma célula em suspensão primeiro adere a um substrato através de aderências baseadas em integrin17,19,20 e, emseguida,se espalha estendendo as saliências baseadas em actina21,22,23. Durante a fase de disseminação, a lamellipodia emanando do corpo celular protuberante e persistentemente com pouca ou nenhuma retração ou paralisação12. Os protocolos de disseminação de células mais usados são os ensaios de pontos finais, onde as células de disseminação são fixadas em vários momentos após o revestimento19,24. Estes ensaios, embora rápidos e simples, são limitados em seu poder de diagnóstico para detectar alterações nas características dinâmicas da lamellipodia. Para determinar os mecanismos moleculares que controlam a dinâmica da lamellipodia, o grupo Sheetz foi pioneiro no uso da análise quantitativa de células vivas e descobriu muitas propriedades fundamentais das saliências de borda celular11,12,22. Esses estudos demonstraram que o ensaio de disseminação de células vivas é uma técnica robusta e poderosa na caixa de ferramentas de um laboratório de biologia celular. Apesar disso, um protocolo detalhado e uma ferramenta computacional de código aberto para um ensaio de espalhamento de células vivas estão atualmente indisponíveis para a comunidade de biologia celular. Para isso, nosso protocolo descreve os procedimentos de imagens ao vivo espalhando células e fornece uma ferramenta automatizada de análise de imagens. Para validar este método, utilizamos a inibição de Arp2/3 como tratamento experimental e mostramos que inibir a função do complexo Arp2/3 não dedundo a propagação celular, mas causou uma redução significativa na velocidade de saliência celular, bem como a estabilidade das saliências da borda celular, dando origem a bordas celulares irregulares. Esses dados demonstram que a combinação de imagens de células vivas e análise automatizada de imagens é uma ferramenta útil para analisar a dinâmica das bordas celulares e identificar componentes moleculares que regulam a lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

A disseminação celular é um processo dinâmico no qual uma célula suspensa em mídia se conecta a um substrato e se achata de uma forma arredondada para uma forma fina e espalhada. Seguindo o acessório de substrato celular, a célula forma uma fina folha de lamellipodia emanando do corpo celular. Na lamellipodia, os monômeros globulares (G-actin) polimerizam-se em uma densa malha de ato desordenada (F-actin) que empurra contra a membrana plasmática, fornecendo assim as forças mecânicas necessárias para que a célula se espalhe. Notavelmente, os atores moleculares que controlam a polimerização de actina na lamellipodia são essenciais para muitos outros processos celulares, como migração celular e endocitose. 
Uma vez que a disseminação de células forma lamellipodia contínua que abrange toda a periferia celular e se expande persistentemente para fora, ensaios de disseminação celular tornaram-se uma ferramenta eficiente para avaliar a cinética das protrusões lamellipodial. Embora várias implementações técnicas do ensaio de disseminação de células tenham sido desenvolvidas, uma descrição detalhada do fluxo de trabalho, que incluiria um protocolo passo a passo e ferramentas computacionais para análise de dados, está atualmente em falta. Aqui, descrevemos os procedimentos experimentais do ensaio de disseminação celular e apresentamos uma ferramenta de código aberto para análise quantitativa e imparcial da dinâmica da borda celular durante a disseminação. Quando combinado com manipulações farmacológicas e/ou técnicas de silenciamento de genes, este protocolo é favorável a uma tela em larga escala de jogadores moleculares que regulam saliências lamellipodiais.

O protocolo acima descreve os procedimentos experimentais para a imagem de células vivas de células disseminadas e uma ferramenta computacional para a análise quantitativa da dinâmica de disseminação celular. A ferramenta computacional pode ser usada em um formato de baixo ou alto rendimento para identificar os atores moleculares que regulam o maquinário de polimerização de actina na borda principal da célula.
A representação esquemática dos procedimentos experimentais é retratad...

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Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Neste protocolo, apresentamos os procedimentos experimentais de um ensaio de difusão celular que é baseado em microscopia de células vivas. Fornecemos uma ferramenta computacional de código aberto para a segmentação imparcial de células fluorescentes rotuladas e análise quantitativa da dinâmica da lamellipodia durante a disseminação celular.

Análise quantitativa da dinâmica da borda celular durante a disseminação celular

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

O protocolo descrito neste vídeo definirá os procedimentos experimentais necessários para a imagem em tamanho real das células disseminadas e o uso de uma ferramenta computacional que quantifica as células espalhando dinâmicas de forma imparcial e automatizada. O ativo de disseminação de células permite o rastreamento contínuo do movimento da borda celular e alterações morfológicas durante a disseminação celular, que é uma característica que está faltando na maioria dos ensaios de propagação de células existentes. Além disso, este protocolo implementa o uso de processamento e análise automatizada de computadores, fornecendo informações sobre circularidade celular, ciclos de retração de área e saliência de células disseminantes.Esse processamento automatizado reduz o viés na análise de dados e fornece um método robusto de analisar a dinâmica de disseminação celular para um grande número de células. Quando combinado com tratamentos medicamentosos ou ciência genética e técnicas, este protocolo é favorável a velocidades em larga escala de jogadores moleculares que regulam as saliências celulares. Para o protocolo dado, as células utilizadas são fibroblastos embrionários de camundongos que codificam geneticamente PH-Akt-GFP, o que permite a marcação fluorescente da membrana plasmática.Antes do início do ensaio de propagação celular, cultura um prato de células para 90% de confluência. Uma vez que as células tenham atingido a confluência adequada, flame um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros e colocá-lo em um prato de cultura celular de 35 milímetros. Cubra o deslizamento com fibronectina que foi diluída em PBS a uma concentração de 2,5 microgramas por mililitro.Coloque o prato com a tampa deslize em uma incubadora de 37 graus por uma hora. Após uma hora aspirar a fibronectina certificando-se de não tocar no deslizamento da tampa com a ponta da pipeta. Lave o prato com PBS, em pipetando suavemente ao redor da tampa, deslize duas a três vezes.Para semeadura celular, comece aspirando a mídia de cultura celular a partir do prato das células. Depois, lave o prato com PBS quente. Adicione 650 microliters de trippsina EDTA ao prato e incline o prato para distribuir uniformemente a enzima.Coloque o prato com o trypsin na incubadora por um minuto. Após a incubação, você precisará primeiro adicionar 10 mililitros de mídia de cultura celular em um tubo de centrífuga. Em seguida, adicione rapidamente mais 10 mililitros de mídia no prato, a fim de saciar o trypsin.Para diluir as células que serão semeadas no deslizamento da tampa, pipeta um mililitro do conteúdo do prato no tubo centrífuga. Do tubo, pipeta aproximadamente 500 a 1.000 microliters de células diluídas no prato com o deslizamento de cobertura. Certifique-se de que o deslizamento da tampa está em uma confluência de 10% ou 50.000 células por mililitro e ajuste o volume de células diluídas conforme necessário.O objetivo dessas células é estabelecer um plano de foco durante a aquisição de imagens. Com as células restantes no prato, passar um quinto das células em um prato pequeno por tratamento. Estas serão as células que serão analisadas para difundir dinâmicas.Coloque os pratos de passagem e o prato de deslizamento de cobertura em uma incubadora por oito a 24 horas. Para testar a importância do Arp2/3 para a disseminação celular, primeiro adicione cinco mililitros de mídia de cultura celular em um controle e um tubo de centrífuga de tratamento. Em seguida, adicione 20 mililitros de dmem que está faltando vermelho fenol em cada um dos dois tubos de centrífuga maiores.Pipeta ou a droga CK-666 que é um inibidor do complexo Arp2/3 ou o tratamento controlado como o DMSO nos tubos pequenos e grandes. Para iniciar o tratamento farmacológico das células, remova os pratos de passagem que estavam incubando durante a noite. Aspire a mídia de cultura celular de todos os pratos e lave os pratos com PBS quente.Pegue os pequenos tubos contendo CK-666 ou controle a mídia suplementada e adicione o conteúdo do tubo relevante em cada um dos pratos de passagem. Rotule cada um dos pratos com o tratamento medicamentoso correto e, em seguida, coloque os pratos de volta na incubadora por mais uma hora Após uma hora de incubação, aspire a mídia suplementada da droga de cada um dos pratos. Em seguida, adicione PBS quente a todos os pratos, a fim de remover completamente todos os demais meios vermelhos de fenol.Adicione 230 microliters de trippsina EDTA e coloque os pratos em uma incubadora por um minuto. Remova os pratos experimentpsinizados da incubadora e continue a adicionar cinco mililitros do dmem suplementado que está sem fenol vermelho em um tubo designado como tubo B.Em seguida, adicione mais cinco mililitros da mesma mídia no prato relevante para saciar a trippsina. Pipeta a mídia para cima e para baixo várias vezes, a fim de separar todas as células do prato.Transfira todo o conteúdo do prato para outro tubo que já tenha sido designado como tubo A.In ordem para preparar uma diluição celular apropriada para a imagem, transfira um mililitro de células do tubo A para o tubo B.Repita todas as etapas de diluição para cada tratamento. Coloque todos os tubos na incubadora por 45 minutos para permitir que as células se recuperem da trippsinização. Certifique-se de que todas as partes de uma câmara magnética celular que possam acomodar um deslizamento de cobertura de 22 por 22 milímetros foram completamente limpas antes de usar.Retire o prato com o deslizamento da tampa da incubadora. Aspire a mídia de cultura celular e lave o deslizamento da tampa com PBS quente. Remova o deslizamento da tampa usando um par de fórceps e coloque suavemente o deslizamento da tampa na placa inferior da câmara magnética.Em seguida, pegue a junta de silicone e coloque-a em cima do deslizamento da tampa. Coloque o corpo principal da câmara magnética na placa inferior. Adicione um mililitro do dmem sem fenol vermelho correspondente ao tratamento relevante à câmara magnética.Pegue um tecido sem fiapos e desça cuidadosamente o invólucro entre o corpo principal e a placa inferior, a fim de verificar se há vazamentos. Para completar a câmara magnética, baixe a tampa transparente sobre o corpo principal. Por fim, limpe o fundo da tampa com um tecido pulverizado com água e outro pulverizado com 70% de etanol.Pré-aqueça a incubadora superior do estágio de um microscópio confocal a 37 graus. Coloque a câmara magnética em cima do objetivo. Antes de adquirir dinâmicas de difusão, defina o foco para as células já polarizadas no canal fluorescente verde.Isso garante que as células que se espalham estarão em foco assim que se anexarem ao deslizamento da tampa. Remova a tampa transparente da câmara magnética e a pipeta 500 microliters do tubo B que foi removido da incubadora. Coloque a tampa transparente de volta por cima.Para identificar células ideais para análise de propagação celular procure halos verdes que representem células que ainda não se anexaram ao deslizamento de cobertura ou estão nos estágios iniciais de apego. Adquira imagens e salve os arquivos. Depois de ter concluído a aquisição de imagem da expansão celular, comece executando um IDE Python compatível, como Spyder.Para análise computacional da dinâmica de disseminação de células, localize e abra o arquivo de GUI de expansão celular fornecido nos pacotes de script relevantes. Pressione o botão executar que abrirá o painel de gui de análise em segundo plano. A GUI abriga todas as configurações necessárias para análise.Para analisar a área da célula e a circularidade, insira o arquivo de aquisição e as configurações necessárias na guia da área de propagação da célula. Os ajustes terão que ser feitos dependendo do tipo de célula e dos parâmetros de aquisição de imagens. Após a pressão de execução, o script criará uma circularidade celular e uma parcela de área versus tempo para todas as células que espalham.Para dados de kymograph, pressione o gerador de kymograph e a guia de análise. Esta análise requer que os arquivos de entrada sejam cortados em pilhas de imagens de célula única. Depois de inserir todas as configurações e pressionar a execução, o script criará vários kymogramas para a célula dada.À esquerda estão células representativas dos tratamentos DMSO e CK-666, segmentados automaticamente usando o script fornecido. Ao contrário da morfologia isotropica e altamente circular demonstrada pelas células de controle, as células inibidas Arp2/3 apresentam diminuição da circularidade. Além disso, os kymogramas gerados automaticamente fornecem resolução temporal que é fundamental para entender a dinâmica das saliências.As células de controle se projetam persistentemente com pouca ou nenhuma retração. Em contraste, a inibição de Arp2/3 interrompe a estabilidade das saliências, como indicado pelo aumento dos eventos de retração ao longo da propagação. Estes vídeos devem fornecer-lhe a compreensão de como seed adequadamente células, realizar tratamentos farmacológicos e preparar imagens e ferramentas computacionais necessárias para a quantificação da dinâmica de disseminação celular.Este protocolo pode ser ainda mais combinado com imagens fluorescentes de citoesqueleto e ensaios de migração para identificar os atores moleculares que regem as saliências celulares. Obrigado por assistir e boa sorte com suas experiências.

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