Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Premio Connaught Fund New Investigator a S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (subvenciones RGPIN-2015-05114 y RGPIN-2020-05881), University of Manchester y University of Toronto Joint Research Fund, y University of Toronto XSeed Program.

1. Siembra celular
NOTA: El protocolo de propagación celular descrito se realizó utilizando fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que expresan PH-Akt-GFP (un marcador fluorescente para PIP3/PI(3,4)P2). Esta línea celular fue generada mediante la integración genómica de una construcción de expresión para PH-Akt-GFP (Addgene #21218) mediante la edición de genes mediados por CRISPR. Sin embargo, otros marcadores fluorescentes que se expresan de forma transitoria o ...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

El ensayo de propagación celular descrito permite el seguimiento continuo de los cambios morfológicos(por ejemplo, el tamaño y la forma de la célula) y los movimientos del borde celular(es decir, la velocidad de protuberancia y la frecuencia de retracción), que son características que faltan en la mayoría de los protocolos de propagación celular19,24. Si bien los ensayos de propagación de células de punto final utilizados comúnmente p...

Las protuberancias lamellipodiales son estructuras citoesqueléticos prominentes formadas en la parte delantera de una célula migratoria. En lamellipodia, la polimerización de actina con la ayuda del complejo Arp2/3 y las fímínas crea una malla actin ramificada de rápido crecimiento que empuja contra la membrana plasmática1,2. La fuerza de empuje generada por el trabajo de malla actin impulsa físicamente la celda hacia adelante1,3,4,5. El agotamiento del complejo Arp2/3 o la interrupción de las vías de señalización esenciales para las protuberancias lamellipodiales a menudo afectan la migración celular6, 7. Aunque la migración de células deficientes en lamellipodia también se ha reportado8,9, la importancia de la lamellipodia en la migración celular es evidente ya que el agotamiento de esta estructura sobretrusiva perturba la capacidad de la célula para moverse a través de microambientes biológicos complejos6,10.
Un obstáculo importante para entender la regulación de la lamellipodia en las células migratorias es la variabilidad natural en lamellipodial protrusión cinética, tamaño, y forma11,12,13,14. Además, estudios recientes han demostrado que la lamellipodia exhibe comportamientos protrusivos complejos, incluyendo protuberancias fluctuantes, periódicas y aceleradas14,15. En comparación con la lamellipodia altamente variable de las células migratorias6,16,lamellipodia formada durante la propagación celular son más uniformes12. Dado que la actividad protrusiva de las células de propagación y migración está impulsada por conjuntos macromoleculares idénticos, que incluyen una red actin ramificada, paquetes de actomiosina contractile y adherencias de matriz celular basadas en integrina17,18,las células de propagación han sido ampliamente utilizadas como modelo para investigar la regulación de la dinámica de lamellipodia.
La propagación celular es un proceso mecanoquímico dinámico en el que una célula en suspensión se adhiere primero a un sustrato a través de adherencias basadas en integrina17,19,20 y luego se propaga extendiendo protuberancias basadas en actin21,22,23. Durante la fase de propagación, lamellipodia que emana del cuerpo celular sobresale isotrópica y persistentemente con poca o ninguna retracción o semental12. Los protocolos de propagación celular más utilizados son los ensayos de puntos finales, donde las células de dispersión se fijan en varias ocasiones después de chapar19,24. Estos ensayos, aunque rápidos y sencillos, son limitados en su poder de diagnóstico para detectar cambios en las características dinámicas de la lamellipodia. Para determinar los mecanismos moleculares que controlan la dinámica de la lamellipodia, el grupo Sheetz fue pionero en el uso del análisis cuantitativo de células de propagación en vivo y descubrió muchas propiedades fundamentales de las protuberancias de borde celular11,12,22. Estos estudios han demostrado que el ensayo de propagación de células vivas es una técnica robusta y poderosa en la caja de herramientas de un laboratorio de biología celular. A pesar de eso, un protocolo detallado y una herramienta computacional de código abierto para un ensayo de propagación de células vivas actualmente no están disponibles para la comunidad de biología celular. Con este fin, nuestro protocolo describe los procedimientos de imágenes que propagan en vivo las células y proporciona una herramienta automatizada de análisis de imágenes. Para validar este método, utilizamos la inhibición de Arp2/3 como tratamiento experimental y demostramos que la inhibición de la función del complejo Arp2/3 no detuvo la propagación celular, sino que causó una reducción significativa en la velocidad de protuberancia celular, así como la estabilidad de las protuberancias del borde celular, dando lugar a bordes celulares irregulares. Estos datos demuestran que la combinación de imágenes de células vivas y análisis automatizado de imágenes es una herramienta útil para analizar la dinámica del borde celular e identificar componentes moleculares que regulan la lamellipodia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

La propagación celular es un proceso dinámico en el que una celda suspendida en medios se adhiere a un sustrato y se aplana de una forma redondeada a una forma delgada y dispersa. Después del apego de sustrato celular, la célula forma una fina lámina de lamellipodia que emana del cuerpo celular. En la lamellipodia, los monómeros de actina globular (G-actin) polimerizan en una densa malla de actina filamentosa (F-actin) que empuja contra la membrana plasmática, proporcionando así las fuerzas mecánicas necesarias para que la célula se propague. En particular, los actores moleculares que controlan la polimerización de actina en lamellipodia son esenciales para muchos otros procesos celulares, como la migración celular y la endocitosis. 
Dado que las células de dispersión forman lamellipodia continua que abarca toda la periferia celular y se expanden persistentemente hacia afuera, los ensayos de propagación celular se han convertido en una herramienta eficiente para evaluar la cinética de las protuberancias lamellipodiales. Aunque se han desarrollado varias implementaciones técnicas del ensayo de propagación celular, actualmente falta una descripción detallada del flujo de trabajo, que incluiría tanto un protocolo paso a paso como herramientas computacionales para el análisis de datos. Aquí, describimos los procedimientos experimentales del ensayo de propagación celular y presentamos una herramienta de código abierto para el análisis cuantitativo e imparcial de la dinámica del borde celular durante la propagación. Cuando se combina con manipulaciones farmacológicas y/o técnicas de silenciamiento de genes, este protocolo es apto para una pantalla a gran escala de jugadores moleculares que regulan las protuberancias lamellipodiales.

El protocolo anterior describe los procedimientos experimentales para la toma de imágenes de células vivas de células de dispersión y una herramienta computacional para el análisis cuantitativo de la dinámica de propagación celular. La herramienta computacional se puede utilizar en un formato de bajo o alto rendimiento para identificar los reproductores moleculares que regulan la maquinaria de polimerización actin en el borde de ataque celular.
La representación esquemática de los pr...

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Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

En este protocolo, presentamos los procedimientos experimentales de un ensayo de propagación celular que se basa en microscopía de células vivas. Proporcionamos una herramienta computacional de código abierto para la segmentación imparcial de células etiquetadas fluorescentemente y análisis cuantitativos de dinámicas de lamellipodia durante la propagación celular.

Análisis cuantitativo de la dinámica del borde celular durante la propagación celular

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

El protocolo descrito en este vídeo definirá los procedimientos experimentales necesarios para la toma de imágenes a tamaño natural de las células de dispersión y el uso de una herramienta computacional que cuantifica las células que difunden la dinámica de forma imparcial y automatizada. El activo de propagación celular permite el seguimiento continuo del movimiento del borde celular y los cambios morfológicos durante la propagación de la célula, que es una característica que falta en la mayoría de los ensayos de propagación de células existentes. Además, este protocolo implementa el uso de procesamiento y análisis informáticos automatizados, proporcionando información sobre la circularidad celular, el área y los ciclos de retracción de protuberancia de las células de dispersión.Este procesamiento automatizado reduce el sesgo en el análisis de datos y proporciona un método robusto para analizar la dinámica de propagación de células para un gran número de celdas. Cuando se combina con tratamientos farmacológicos o ciencia y técnicas genéticas, este protocolo es apto para velocidades a gran escala de los jugadores moleculares que regulan las protuberancias celulares. Para el protocolo dado, las células utilizadas son fibroblastos embrionarios del ratón que codifican genéticamente PH-Akt-GFP, lo que permite el etiquetado fluorescente de la membrana plasmática.Antes del comienzo del ensayo de propagación celular, cultiva un plato de células al 90% de confluencia. Una vez que las células hayan alcanzado la confluencia adecuada, llama a un resbalón de cubierta de 22 por 22 milímetros y colóquelo en un plato de cultivo celular de 35 milímetros. Cubra el resbalón de la cubierta con fibronectina que se ha diluido en PBS a una concentración de 2,5 microgramos por mililitro.Coloque el plato con la cubierta en una incubadora de 37 grados durante una hora. Después de una hora aspirar la fibronectina asegurándose de no tocar el resbalón de la cubierta con la punta de la pipeta. Lave el plato con PBS pipendo suavemente alrededor de la tapa deslice de dos a tres veces.Para la siembra celular, comience aspirando los medios de cultivo celular desde el plato de las células. Después, lave el plato con PBS caliente. Añadir 650 microlitros de trippsina EDTA al plato e inclinar el plato para distribuir uniformemente la enzima.Coloque el plato con la trypsin en la incubadora durante un minuto. Después de la incubación primero tendrá que añadir 10 mililitros de medios de cultivo celular en un tubo centrífugo. A continuación, agregue rápidamente otros 10 mililitros de medios en el plato con el fin de apagar la trypsin.Para diluir las células que se sembrarán en el deslizamiento de la cubierta, pipetear un mililitro del contenido del plato en el tubo centrífuga. Desde el tubo, pipeta aproximadamente 500 a 1.000 microlitros de células diluidas en el plato con el resbalón de la cubierta. Asegúrese de que el deslizamiento de la cubierta esté al 10% de confluencia o a 50.000 células por mililitro y ajuste el volumen de las células diluidas según sea necesario.El propósito de estas celdas es establecer un plano de enfoque durante la adquisición de imágenes. Con las células restantes en el plato, pasa una quinta parte de las células a un plato pequeño por tratamiento. Estas serán las células que serán analizadas para la dinámica de propagación.Coloque los platos de paso y la cubierta deslice el plato en una incubadora durante ocho a 24 horas. Para probar la importancia de Arp2/3 para la propagación celular, primero agregue cinco mililitros de medios de cultivo celular en un control y un tubo centrífuga de tratamiento. A continuación añadir 20 mililitros de dmem que carece de fenol rojo en cada uno de dos tubos centrífugos más grandes.Pipeta ya sea el fármaco CK-666 que es un inhibidor del complejo Arp2/3 o el tratamiento controlado como DMSO en los tubos pequeños y grandes. Para comenzar el tratamiento farmacológico de las células, retire los platos de paso que estaban incubando durante la noche. Aspirar los medios de cultivo celular de todos los platos y lavar los platos con PBS caliente.Tome los pequeños tubos que contienen CK-666 o controle los medios complementados y agregue el contenido del tubo pertinente en cada uno de los platos del pasaje. Etiqueta cada uno de los platos con el tratamiento farmacológico correcto y luego coloca los platos de nuevo en la incubadora durante una hora adicional Después de una hora de incubación, aspirar el medicamento complementado medios de cada uno de los platos. A continuación, añadir PBS caliente a todos los platos con el fin de eliminar a fondo todos los medios rojos fenol restantes.Añadir 230 microlitros de trypsin EDTA y colocar los platos en una incubadora durante un minuto. Retire los platos trypsinizados de la incubadora y proceda a añadir cinco mililitros de la droga dmem suplementada que carece de fenol rojo en un tubo designado como tubo B.Then añadir otros cinco mililitros de los mismos medios en el plato pertinente para saciar la trippsina. Pipetear los medios arriba y abajo varias veces con el fin de separar todas las células del plato.Transfiera todo el contenido del plato a otro tubo que ya ha sido designado como tubo A.In orden para preparar una dilución celular adecuada para la toma de imágenes, transfiera un mililitro de células del tubo A al tubo B.Repita todos los pasos de dilución para cada tratamiento. Coloque todos los tubos en la incubadora durante 45 minutos para permitir que las células se recuperen de la trippsinización. Asegúrese de que todas las partes de una cámara magnética celular que puede acomodar un resbalón de cubierta de 22 por 22 milímetros se hayan limpiado a fondo antes de su uso.Retire el plato con el resbalón de la cubierta de la incubadora. Aspirar los medios de cultivo celular y lavar el resbalón de la cubierta con PBS caliente. Retire el resbalón de la cubierta con un par de fórceps y coloque suavemente el resbalón de la cubierta en la placa inferior de la cámara magnética.A continuación, coja la junta de silicona y colóquela encima del resbalón de la cubierta. Coloque el cuerpo principal de la cámara magnética en la placa inferior. Añadir un mililitro del dmem carente de fenol rojo correspondiente al tratamiento pertinente a la cámara magnética.Tome un tejido libre de pelusas y coloque cuidadosamente la carcasa entre el cuerpo principal y la placa inferior para comprobar si hay fugas. Para completar la cámara magnética, baje la cubierta transparente sobre el cuerpo principal. Por último, limpie la parte inferior de la tapa con un tejido rociado con agua y otro rociado con 70% de etanol.Precaliente la incubadora superior del escenario de un microscopio confocal a 37 grados. Coloque la cámara magnética encima del objetivo. Antes de adquirir dinámicas de propagación, establezca el foco en las células ya polarizadas en el canal fluorescente verde.Esto garantiza que las células que se extienden estarán enfocadas una vez que se adhieran al resbalón de la cubierta. Retire la cubierta transparente de la cámara magnética y la pipeta 500 microlitros del tubo B que se retiró de la incubadora. Coloque la cubierta transparente en la parte superior.Para identificar las células ideales para el análisis de propagación celular, busque halos verdes que representen células que aún no se han adjunte al resbalón de la cubierta o se encuentran en las primeras etapas de unión. Adquiera imágenes y guarde los archivos. Después de haber completado la adquisición de imágenes de propagación de celdas, comience por ejecutar un IDE de Python compatible como Spyder.Para el análisis computacional de la dinámica de propagación de celdas, busque y abra el archivo GUI de propagación de celdas proporcionado en los paquetes de script relevantes. Pulse el botón ejecutar que abrirá el panel GUI de análisis en segundo plano. La GUI alberga todos los ajustes necesarios para el análisis.Para analizar el área de celda y la circularidad, introduzca el archivo de adquisición y la configuración necesaria en la pestaña área de dispersión de celda. Los ajustes deberán realizarse en función del tipo de celda y los parámetros de adquisición de imágenes. Después de presionar ejecutar, el script creará una circularidad de celda y un área frente a un gráfico de tiempo para todas las celdas de dispersión.Para los datos del kymograph, presione el generador de kymograph y la pestaña de análisis. Este análisis requiere que los archivos de entrada se recorten pilas de imágenes de una sola celda. Después de insertar todos los ajustes y presionar ejecutar, el script creará varios kymographs para la celda dada.A la izquierda hay células representativas de los tratamientos DMSO y CK-666, segmentadas automáticamente mediante el script proporcionado. A diferencia de la morfología isotrópica y altamente circular demostrada por las células de control, Arp2/3 células inhibidas exhiben disminución de la circularidad. Además, los kymographs generados automáticamente proporcionan una resolución temporal que es fundamental para comprender la dinámica de las protuberancias.Las células de control sobresalen persistentemente con pequeñas o ninguna retracción. Por el contrario, la inhibición de Arp2/3 altera la estabilidad de las protuberancias, como lo indica el aumento de los eventos de retracción a lo largo de la propagación. Estos videos deben proporcionarle la comprensión de cómo sembrar correctamente las células, realizar tratamientos farmacológicos y preparar las herramientas de imagen y cálculo necesarias para la cuantificación de la dinámica de propagación celular.Este protocolo se puede combinar aún más con imágenes fluorescentes de citoesqueleto y ensayos de migración para identificar a los jugadores moleculares que rigen las protuberancias celulares. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.

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