Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Bu çalışma, Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (RGPIN-2015-05114 ve RGPIN-2020-05881), Manchester Üniversitesi ve Toronto Üniversitesi Ortak Araştırma Fonu ve Toronto Üniversitesi XSeed Programı tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre Tohumlama
NOT: Açıklanan hücre yayma protokolü, PH-Akt-GFP (PIP3 /PI(3,4)P2için floresan belirteç) ifade eden fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu hücre hattı, CRISPR aracılı gen düzenleme ile PH-Akt-GFP (Addgene #21218) için bir ifade yapısı genomik olarak entegre edilmesiyle oluşturulmuştır. Bununla birlikte, geçici olarak ifade edilen veya genoma entegre edilen diğer floresan belirteçler de bu testte...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

Açıklanan hücre yayma tahlili, çoğu hücre yayma protokolünde eksik olan morfolojik değişikliklerin(örneğin, hücre büyüklüğü ve şekli) ve hücre kenar hareketlerinin(örneğin, çıkıntı hızı ve geri çekme sıklığı) sürekli izlenmesini sağlar19,24. Yaygın olarak kullanılan son nokta hücre yayma tahlilleri hücre yayılma hızının belirlenmesine izin verirken, bu tahliller hücre kenar hareketlerinin zamansal dinam...

Lamellipodial çıkıntılar, göç eden bir hücrenin önünde oluşan belirgin sitoskeletal yapılardır. Lamellipodia'da, Arp2/3 kompleksi ve forminlerin yardımıyla aktinin polimerizasyonu, plazma zarına1,2'ye karşı iten hızlı büyüyen dallı bir aksin meshwork oluşturur. Aktüen meshwork tarafından oluşturulan itme kuvveti, hücreyi fiziksel olarakileriye doğru iterek 1,3,4,5. Arp2/3 kompleksinin tükenmesi veya lamellipodial çıkıntılar için gerekli sinyal yollarının bozulması genellikle hücre göçini bozar6, 7. Lamellipodia eksikliği olan hücrelerin göçü de bildirilmiş olsa da8,9Hücre göçünde lamellipodia'nın önemi, hücrenin karmaşık biyolojik mikroçevremeler 6,10arasında hareket etme yeteneğini besleyen bu çıkıntılı yapının tükenmesi olarak açıktır.
Göç eden hücrelerde lamellipodia'nın düzenlenmesini anlamanın en büyük engeli, lamellipodial çıkıntı kinetiği, boyutu ve şekli11 , 12,13,14'tekidoğal değişkenliktir. Ayrıca, son çalışmalar lamellipodia'nın dalgalanan, periyodik ve hızlanan çıkıntılar da dahil olmak üzere karmaşık çıkıntılı davranışlar sergilediğini göstermiştir14,15. Göç eden hücrelerin son derece değişken lamellipodia ile karşılaştırıldığında6,16, hücre yayılması sırasında oluşan lamellipodia daha düzgün12. Yayılan ve göç eden hücrelerin çıkıntılı aktivitesi, dallı bir aksin ağı, kontrtil akomiyosin demetleri ve integrin bazlı hücre matrisi yapışmaları17,18, yayılan hücreleri içeren özdeş makromoleküler montajlar tarafından yönlendirilmediğinden, yayılan hücreler lamellipodia dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır.
Hücre yayma, süspansiyondaki bir hücrenin önce integrin bazlı yapıştırmalar17 , 19,20 yoluyla bir substrata yapıştığı ve daha sonra aksin bazlı çıkıntıları21 ,22,23genişleterek yayıldığı dinamik bir mekanokimyasal süreçtir. Yayılma aşamasında, hücre gövdesinden yayılan lamellipodia izotropik olarak ve ısrarlı bir şekilde çok az geri çekilme veya oyalama ile çıkıntı12. En sık kullanılan hücre yayma protokolleri, yayılan hücrelerin kaplamadan sonra çeşitli zamanlarda sabitlendiği uç noktalar tahlilleridir19,24. Bu tahliller, hızlı ve basit olmasına rağmen, lamellipodia'nın dinamik özelliklerindeki değişiklikleri tespit etmek için tanılama güçlerinde sınırlıdır. Lamellipodia dinamiklerini kontrol eden moleküler mekanizmaları belirlemek için Sheetz grubu, canlı yayılan hücrelerin nicel analizinin kullanılmasına öncülük etti ve hücre kenarı çıkıntılarının birçok temel özelliğini ortaya çıkardı11,12,22. Bu çalışmalar, canlı hücre yayma tahlilinin bir hücre biyolojisi laboratuvarının alet çantasında sağlam ve güçlü bir teknik olduğunu göstermiştir. Buna rağmen, canlı hücre yayma tahlilleri için ayrıntılı bir protokol ve açık kaynaklı hesaplama aracı şu anda hücre biyolojisi topluluğu için kullanılamamaktadır. Bu amaçla, protokolümüz canlı yayılan hücreleri görüntüleme prosedürlerini özetler ve otomatik bir görüntü analizi aracı sağlar. Bu yöntemi doğrulamak için deneysel bir tedavi olarak Arp2/3 inhibisyonunu kullandık ve Arp2/3 kompleksinin işlevini engellemenin hücre yayılımını tutuklamadığını, hücre çıkıntı hızında önemli bir azalmaya neden olduğunu ve hücre kenarı çıkıntılarının stabilitesinin pürüzlü hücre kenarlarına yol açtığını gösterdik. Bu veriler, canlı hücre görüntüleme ve otomatik görüntü analizi kombinasyonunun hücre kenar dinamiklerini analiz etmek ve lamellipodia'yı düzenleyen moleküler bileşenleri tanımlamak için yararlı bir araç olduğunu göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

Hücre yayma, medyada asılı bir hücrenin bir substrata bağlandığı ve yuvarlanmış bir şekilden ince ve yayılmış bir şekle düzleştirmesi dinamik bir işlemdir. Hücre-substrat ekini takiben, hücre gövdesinden yayılan ince bir lamellipodia tabakası oluşturur. Lamellipodia'da, globüler aktin (G-actin) monomerleri plazma zarına doğru iten yoğun bir filamentli aktin (F-actin) meshwork'e polimerize olur ve böylece hücrenin yayılması için gereken mekanik kuvvetleri sağlar. Özellikle, lamellipodia'daki aksin polimerizasyonunu kontrol eden moleküler oyuncular, hücre göçü ve endositoz gibi diğer birçok hücresel süreç için gereklidir. 
Yayılan hücreler tüm hücre çevresini kapsayan ve sürekli olarak dışa doğru genişleyen sürekli lamellipodia oluşturduğundan, hücre yayma tahlilleri lamellipodial çıkıntıların kinetiğini değerlendirmek için etkili bir araç haline gelmiştir. Hücrenin yayılan tahlillerinin birkaç teknik uygulaması geliştirilmiş olsa da, iş akışının hem adım adım protokol hem de veri analizi için hesaplama araçlarını içerecek ayrıntılı bir açıklaması şu anda eksiktir. Burada, hücre yayılma tahlilinin deneysel prosedürlerini açıklıyoruz ve yayılma sırasında hücre kenar dinamiklerinin nicel ve tarafsız analizi için açık kaynaklı bir araç sunuyoruz. Farmakolojik manipülasyonlar ve/veya gen susturma teknikleri ile birleştirildiğinde, bu protokol lamellipodial çıkıntıları düzenleyen moleküler oyuncuların geniş ölçekli bir ekranına tabidir.

Yukarıdaki protokol, yayılan hücrelerin canlı hücre görüntülemesi için deneysel prosedürleri ve hücre yayma dinamiklerinin nicel analizi için bir hesaplama aracını açıklar. Hesaplama aracı, hücre lideri kenarındaki akrin polimerizasyon makinelerini düzenleyen moleküler oynatıcıları tanımlamak için düşük veya yüksek aktarım hızı biçiminde kullanılabilir.
Deneysel yordamların şematik gösterimi Şekil 1'de tasvir edilir. Test yay...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Bu protokolde canlı hücre mikroskopisi esas alınarak yapılan test yayılan bir hücrenin deneysel prosedürlerini sunuyoruz. Floresan etiketli hücrelerin tarafsız segmentasyonu ve hücre yayılması sırasında lamellipodia dinamiklerinin nicel analizi için açık kaynaklı bir hesaplama aracı sunuyoruz.

Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Bu videoda açıklanan protokol, yayılan hücrelerin yaşam boyu görüntülenmesi ve dinamikleri yayan hücreleri tarafsız ve otomatik bir şekilde ölçen bir hesaplama aracının kullanımı için gerekli deneysel prosedürleri tanımlayacaktır. Hücre yayma varlığı, hücre yayılma sırasında hücre kenar hareketinin ve morfolojik değişikliklerin sürekli izlenmesini sağlar, bu da mevcut hücre yayılma testlerinin çoğunda eksik olan bir özelliktir. Ayrıca, bu protokol, hücre döngüselliği, alan ve yayılan hücrelerin çıkıntı geri çekme döngüleri hakkında bilgi sağlayarak otomatik bilgisayar işleme ve analizinin kullanımını uygular.Bu tür otomatik işleme, veri analizindeki önyargıyı azaltır ve çok sayıda hücre için hücre yayma dinamiklerini analiz etmek için sağlam bir yöntem sağlar. İlaç tedavileri veya gen bilimi ve teknikleri ile birleştirildiğinde, bu protokol hücre çıkıntılarını düzenleyen moleküler oyuncuların büyük ölçekli hızlarına açıktır. Verilen protokol için, Kullanılan hücreler, plazma zarının floresan etiketlenmesine izin veren PH-Akt-GFP'yi genetik olarak kodlayan fare embriyonik fibroblastlarıdır.Test yayılan hücrenin başlangıcından önce, bir hücre çanağını% 90 izdiah eder. Hücreler uygun izdiah süresine ulaştıktan sonra, 22'ye 22 milimetrelik bir kapak kayması alevlendir ve 35 milimetrelik bir hücre kültürü çanağı içine yerleştirin. Kapak kaymasını PBS'de seyreltilmiş fibronektin ile mililitre başına 2,5 mikrogram konsantrasyona kadar kaplayın.Kapağı olan tabağı bir saat boyunca 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bir saat sonra fibronektin, pipet ucuyla kapak kaymasına dokunmamaya dikkat ederim. Kapağın etrafına iki ila üç kez hafifçe pipetle vurarak yemeği PBS ile yıkayın.Hücre tohumlama için, hücre kültürü medyasını hücre çanaktan aspire ederek başlayın. Daha sonra, yemeği ılık PBS ile yıkayın. Yemeğe 650 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve enzimi eşit olarak dağıtmak için kabı eğin.Tripinli yemeği bir dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra önce bir santrifüj tüpüne 10 mililitre hücre kültürü ortamı eklemeniz gerekir. Daha sonra, tripsinleri söndürmek için yemeğe 10 mililitre daha medya ekleyin.Kapak kayması üzerine tohumlanacak hücreleri seyreltmek için, yemeğin içeriğinin bir mililitresini santrifüj tüpüne pipetlayın. Tüpten pipet yaklaşık 500 ila 1.000 mikrolitre seyreltilmiş hücre kapak kayması ile kabın içine. Kapak kaymasının mililitre başına %10 veya 50.000 hücrede olduğundan emin olun ve seyreltilmiş hücrelerin hacmini gerektiği gibi ayarlayın.Bu hücrelerin amacı, görüntü alımı sırasında bir odak düzlemi oluşturmaktır. Çanaktaki kalan hücrelerle, hücrelerin beşte birini tedavi başına küçük bir tabağa geçirin. Bunlar, yayılma dinamikleri için analiz edilecek hücreler olacaktır.Pasaj tabaklarını ve kapak kayması kabını sekiz ila 24 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Arp2/3'ün hücre yayılımı için önemini test etmek için, önce bir kontrole ve bir tedavi santrifüj tüpüne beş mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Daha sonra iki büyük santrifüj tüpünün her birine fenol kırmızısı olmayan 20 mililitre dmem ekleyin.Pipet ya Arp2/3 kompleksinin inhibitörü olan CK-666 ilacı ya da küçük ve büyük tüplere DMSO gibi kontrollü tedavi. Hücrelerin farmakolojik tedavisine başlamak için, bir gecede kuluçkaya yatıran pasaj yemeklerini çıkarın. Tüm yemeklerden hücre kültürü medyasını epire edin ve bulaşıkları ılık PBS ile yıkayın.CK-666 içeren küçük tüpleri alın veya takviyeli medyayı kontrol edin ve ilgili tüpün içeriğini pasaj yemeklerinin her birine ekleyin. Yemeklerin her birini doğru ilaç tedavisi ile etiketleyin ve ardından bulaşıkları bir saat daha inkübatöre yerleştirin Bir saatlik kuluçkadan sonra, her bir yemekten ilaç takviyeli medyayı aspire edin. Daha sonra, kalan tüm fenol kırmızı medyasını iyice çıkarmak için tüm yemeklere sıcak PBS ekleyin.230 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve bulaşıkları bir dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Trypsinized yemekleri inkübatörden çıkarın ve B tüpü olarak belirlenmiş bir tüpe fenol kırmızısı olmayan ilaç takviyeli dmem'in beş mililitresini eklemeye devam edin.Daha sonra tripsinleri söndürmek için ilgili yemeğe aynı ortamın beş mililitresini daha ekleyin. Tüm hücreleri tabaktan ayırmak için medyayı birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın.Görüntüleme için uygun bir hücre seyreltmesi hazırlamak için çanağın tüm içeriğini tüp olarak belirlenmiş başka bir tüpe aktarın A.In A tüpünden bir mililitre hücreyi B tüpüne aktarın.Her tedavi için tüm seyreltme adımlarını tekrarlayın. Hücrelerin tripzyasyondan kurtulmasını sağlamak için tüm tüpleri 45 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. 22 ila 22 milimetrelik bir kapak fişini barındırabilen bir hücre manyetik odasının tüm parçalarının kullanımdan önce iyice temizlenmiş olduğundan emin olun.Kabı inkübatörden kapak kayması ile çıkarın. Hücre kültürü medyasını epire edin ve kapak fişini sıcak PBS ile yıkayın. Bir çift tokmak kullanarak kapak fişini çıkarın ve kapak kaymasını yavaşça manyetik odanın alt plakasına koyun.Sonra silikon contayı alın ve kapak fişinin üstüne yerleştirin. Manyetik odanın ana gövdesini alt plakaya takın. Manyetik odaya ilgili tedaviye karşılık gelen fenol kırmızısı olmayan dmem'in bir mililitresini ekleyin.Tüy bırakmayan bir doku alın ve sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için muhafazayı ana gövde ile alt plaka arasında dikkatlice dab. Manyetik odayı tamamlamak için şeffaf kapağı ana gövdeye diri diri uzadı. Son olarak kapak fişinin altını su ile püskürtülen bir doku ve% 70 etanol ile püskürtülen bir başka mendille silin.Konfokal mikroskobun sahne üstü inkübatörini 37 dereceye ısıtın. Manyetik odayı hedefin üstüne yerleştirin. Yayılma dinamiklerini elde etmeden önce, odağı yeşil floresan kanalındaki zaten polarize hücrelere ayarlayın.Bu, yayılan hücrelerin kapak kaymasına tutturulurken odakta olmasını sağlar. Manyetik odanın şeffaf kapağını ve pipet 500 mikrolitreyi inkübatörden çıkarılan B tüpünden çıkarın. Şeffaf kapağı tekrar üste yerleştirin.Hücre yayma analizi için ideal hücreleri tanımlamak için, kapak kaymasına henüz bağlanmamış veya ekin en erken aşamalarında olan hücreleri temsil eden yeşil haleler arayın. Görüntüleri alın ve dosyaları kaydedin. Hücre yaymanın görüntü alımını tamamladıktan sonra, Spyder gibi uyumlu bir Python IDE çalıştırarak başlayın.Hücre yayma dinamiklerinin hesaplamalı analizi için, ilgili komut dosyası paketlerinde sağlanan hücre yayma GUI dosyasını bulun ve açın. Arka planda analiz GUI panelini açacak çalıştır düğmesine basın. GUI, analiz için gereken tüm ayarları barındırr.Hücre alanını ve döngüselliği çözümlemek için, hücre yayılma alanı sekmesine edinme dosyasını ve gerekli ayarları girin. Ayarlamaların hücre türüne ve görüntü alma parametrelerine bağlı olarak yapılması gerekecektir. Çalıştırma tuşuna bastıktan sonra, komut dosyası tüm yayılan hücreler için zaman çizimi ile karşı bir hücre döngüselliği ve alanı oluşturur.Kimograf verileri için kimograf üreteci ve analiz sekmesine basın. Bu çözümleme, giriş dosyalarının tek hücreli görüntü yığınlarının kırpılmasını gerektirir. Tüm ayarları ekledikten ve çalıştırma tuşuna bastıktan sonra, komut dosyası verilen hücre için birden çok kimograf oluşturur.Solda, sağlanan komut dosyası kullanılarak otomatik olarak bölümlere ayrılmış DMSO ve CK-666 tedavilerinden temsili hücreler bulunur. Kontrol hücreleri tarafından gösterilen izotropik ve son derece dairesel morfolojinin aksine, Arp2/3 inhibe edilmiş hücreler döngüsellikte azalma gösterir. Ayrıca, otomatik olarak oluşturulan kimograflar, çıkıntıların dinamiklerini anlamak için kritik olan zamansal çözünürlük sağlar.Kontrol hücreleri, çok az veya hiç geri çekme olmadan sürekli olarak çıkıntılır. Buna karşılık, Arp2/3 inhibisyonu, yayılma boyunca geri çekilme olaylarındaki artışın gösterdiği gibi çıkıntıların stabilitesini bozar. Bu videolar size hücrelerin nasıl düzgün bir şekilde tohumlanacağını, farmakolojik tedavilerin nasıl gerçekleştirildiğini ve hücre yayma dinamiklerinin nicelleştirilmesi için gerekli görüntüleme ve hesaplama araçlarını nasıl hazırlayacağınızı anlamanızı sağlamalıdır.Bu protokol, hücre çıkıntılarını yöneten moleküler oyuncuları tanımlamak için sitoskeleton floresan görüntüleme ve göç tahlilleri ile daha da birleştirilebilir. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.

quantitative-analysis-of-cell-edge-dynamics-during-cell-spreading

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Biyoloji

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.
Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed1 who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate2.
To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry1. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments1.
The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection3 in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

The Scepter Cell Counter is a handheld automated device that can be used to count cells, monitor cell diameter and volume, and be used to check the health and quality of cellular populations from one culture to the next.

Hücre Kültürü sırasında Hücre Sayısını Belirleme Scepter Hücre Sayıcı

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.

A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.