Name: quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Bu çalışma, Connaught Fund New Investigator Award to S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (RGPIN-2015-05114 ve RGPIN-2020-05881), Manchester Üniversitesi ve Toronto Üniversitesi Ortak Araştırma Fonu ve Toronto Üniversitesi XSeed Programı tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre Tohumlama
NOT: Açıklanan hücre yayma protokolü, PH-Akt-GFP (PIP3 /PI(3,4)P2için floresan belirteç) ifade eden fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) kullanılarak gerçekleştirildi. Bu hücre hattı, CRISPR aracılı gen düzenleme ile PH-Akt-GFP (Addgene #21218) için bir ifade yapısı genomik olarak entegre edilmesiyle oluşturulmuştır. Bununla birlikte, geçici olarak ifade edilen veya genoma entegre edilen diğer floresan belirteçler de bu testte...

<ol>
	<li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+Nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li><li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells.">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317 (2007).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+driven+by+actin+polymerization.">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li><li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II:+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments.">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments.">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis.">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+without+a+lamellipodium.">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li><li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Arp2/3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2/3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation.">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708 (2021).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li><li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., D&#246;bereiner, H. -. G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves.">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading.">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735 (2008).</li><li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arp2/3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration.">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging.">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688 (2018).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation.">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020 (2020).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function:+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function.">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow.">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li><li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+assays.">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li><li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands.">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li><li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., D&#246;bereiner, H. -. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs.">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li><li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading.">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li><li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events.">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li><li>Guan, J. -. L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Migration,+Developmental+Methods+and+Protocols.">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, 55-68 (2004).</li><li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphatidylinositol+4,5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion.">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li><li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes.">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li><li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency.">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li><li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves.">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li></ol>

Açıklanan hücre yayma tahlili, çoğu hücre yayma protokolünde eksik olan morfolojik değişikliklerin(örneğin, hücre büyüklüğü ve şekli) ve hücre kenar hareketlerinin(örneğin, çıkıntı hızı ve geri çekme sıklığı) sürekli izlenmesini sağlar19,24. Yaygın olarak kullanılan son nokta hücre yayma tahlilleri hücre yayılma hızının belirlenmesine izin verirken, bu tahliller hücre kenar hareketlerinin zamansal dinam...

Lamellipodial çıkıntılar, göç eden bir hücrenin önünde oluşan belirgin sitoskeletal yapılardır. Lamellipodia'da, Arp2/3 kompleksi ve forminlerin yardımıyla aktinin polimerizasyonu, plazma zarına1,2'ye karşı iten hızlı büyüyen dallı bir aksin meshwork oluşturur. Aktüen meshwork tarafından oluşturulan itme kuvveti, hücreyi fiziksel olarakileriye doğru iterek 1,3,4,5. Arp2/3 kompleksinin tükenmesi veya lamellipodial çıkıntılar için gerekli sinyal yollarının bozulması genellikle hücre göçini bozar6, 7. Lamellipodia eksikliği olan hücrelerin göçü de bildirilmiş olsa da8,9Hücre göçünde lamellipodia'nın önemi, hücrenin karmaşık biyolojik mikroçevremeler 6,10arasında hareket etme yeteneğini besleyen bu çıkıntılı yapının tükenmesi olarak açıktır.
Göç eden hücrelerde lamellipodia'nın düzenlenmesini anlamanın en büyük engeli, lamellipodial çıkıntı kinetiği, boyutu ve şekli11 , 12,13,14'tekidoğal değişkenliktir. Ayrıca, son çalışmalar lamellipodia'nın dalgalanan, periyodik ve hızlanan çıkıntılar da dahil olmak üzere karmaşık çıkıntılı davranışlar sergilediğini göstermiştir14,15. Göç eden hücrelerin son derece değişken lamellipodia ile karşılaştırıldığında6,16, hücre yayılması sırasında oluşan lamellipodia daha düzgün12. Yayılan ve göç eden hücrelerin çıkıntılı aktivitesi, dallı bir aksin ağı, kontrtil akomiyosin demetleri ve integrin bazlı hücre matrisi yapışmaları17,18, yayılan hücreleri içeren özdeş makromoleküler montajlar tarafından yönlendirilmediğinden, yayılan hücreler lamellipodia dinamiklerinin düzenlenmesini araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır.
Hücre yayma, süspansiyondaki bir hücrenin önce integrin bazlı yapıştırmalar17 , 19,20 yoluyla bir substrata yapıştığı ve daha sonra aksin bazlı çıkıntıları21 ,22,23genişleterek yayıldığı dinamik bir mekanokimyasal süreçtir. Yayılma aşamasında, hücre gövdesinden yayılan lamellipodia izotropik olarak ve ısrarlı bir şekilde çok az geri çekilme veya oyalama ile çıkıntı12. En sık kullanılan hücre yayma protokolleri, yayılan hücrelerin kaplamadan sonra çeşitli zamanlarda sabitlendiği uç noktalar tahlilleridir19,24. Bu tahliller, hızlı ve basit olmasına rağmen, lamellipodia'nın dinamik özelliklerindeki değişiklikleri tespit etmek için tanılama güçlerinde sınırlıdır. Lamellipodia dinamiklerini kontrol eden moleküler mekanizmaları belirlemek için Sheetz grubu, canlı yayılan hücrelerin nicel analizinin kullanılmasına öncülük etti ve hücre kenarı çıkıntılarının birçok temel özelliğini ortaya çıkardı11,12,22. Bu çalışmalar, canlı hücre yayma tahlilinin bir hücre biyolojisi laboratuvarının alet çantasında sağlam ve güçlü bir teknik olduğunu göstermiştir. Buna rağmen, canlı hücre yayma tahlilleri için ayrıntılı bir protokol ve açık kaynaklı hesaplama aracı şu anda hücre biyolojisi topluluğu için kullanılamamaktadır. Bu amaçla, protokolümüz canlı yayılan hücreleri görüntüleme prosedürlerini özetler ve otomatik bir görüntü analizi aracı sağlar. Bu yöntemi doğrulamak için deneysel bir tedavi olarak Arp2/3 inhibisyonunu kullandık ve Arp2/3 kompleksinin işlevini engellemenin hücre yayılımını tutuklamadığını, hücre çıkıntı hızında önemli bir azalmaya neden olduğunu ve hücre kenarı çıkıntılarının stabilitesinin pürüzlü hücre kenarlarına yol açtığını gösterdik. Bu veriler, canlı hücre görüntüleme ve otomatik görüntü analizi kombinasyonunun hücre kenar dinamiklerini analiz etmek ve lamellipodia'yı düzenleyen moleküler bileşenleri tanımlamak için yararlı bir araç olduğunu göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>325-042-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented</td>
			<td>Starstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>CM-S22-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal</td>
			<td>Nest</td>
			<td>602002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>182515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera, Prime 95B-25MM</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide, Sterile</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>DMS666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>319-005 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, 1X</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>311-425 CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>080-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil</td>
			<td>Cargille</td>
			<td>16241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine Solution (200 mM)</td>
			<td>Wisent Bioproducts</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA48366-227-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Body, Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRD01605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk, Crest Light V2</td>
			<td>CrestOptics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spyder</td>
			<td>Anaconda</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistics Software, Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, Style 2</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>78326-42</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of cell edge dynamics during cell spreading

Hücre yayma, medyada asılı bir hücrenin bir substrata bağlandığı ve yuvarlanmış bir şekilden ince ve yayılmış bir şekle düzleştirmesi dinamik bir işlemdir. Hücre-substrat ekini takiben, hücre gövdesinden yayılan ince bir lamellipodia tabakası oluşturur. Lamellipodia'da, globüler aktin (G-actin) monomerleri plazma zarına doğru iten yoğun bir filamentli aktin (F-actin) meshwork'e polimerize olur ve böylece hücrenin yayılması için gereken mekanik kuvvetleri sağlar. Özellikle, lamellipodia'daki aksin polimerizasyonunu kontrol eden moleküler oyuncular, hücre göçü ve endositoz gibi diğer birçok hücresel süreç için gereklidir. 
Yayılan hücreler tüm hücre çevresini kapsayan ve sürekli olarak dışa doğru genişleyen sürekli lamellipodia oluşturduğundan, hücre yayma tahlilleri lamellipodial çıkıntıların kinetiğini değerlendirmek için etkili bir araç haline gelmiştir. Hücrenin yayılan tahlillerinin birkaç teknik uygulaması geliştirilmiş olsa da, iş akışının hem adım adım protokol hem de veri analizi için hesaplama araçlarını içerecek ayrıntılı bir açıklaması şu anda eksiktir. Burada, hücre yayılma tahlilinin deneysel prosedürlerini açıklıyoruz ve yayılma sırasında hücre kenar dinamiklerinin nicel ve tarafsız analizi için açık kaynaklı bir araç sunuyoruz. Farmakolojik manipülasyonlar ve/veya gen susturma teknikleri ile birleştirildiğinde, bu protokol lamellipodial çıkıntıları düzenleyen moleküler oyuncuların geniş ölçekli bir ekranına tabidir.

Yukarıdaki protokol, yayılan hücrelerin canlı hücre görüntülemesi için deneysel prosedürleri ve hücre yayma dinamiklerinin nicel analizi için bir hesaplama aracını açıklar. Hesaplama aracı, hücre lideri kenarındaki akrin polimerizasyon makinelerini düzenleyen moleküler oynatıcıları tanımlamak için düşük veya yüksek aktarım hızı biçiminde kullanılabilir.
Deneysel yordamların şematik gösterimi Şekil 1'de tasvir edilir. Test yay...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading at JoVE.com

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Bu protokolde canlı hücre mikroskopisi esas alınarak yapılan test yayılan bir hücrenin deneysel prosedürlerini sunuyoruz. Floresan etiketli hücrelerin tarafsız segmentasyonu ve hücre yayılması sırasında lamellipodia dinamiklerinin nicel analizi için açık kaynaklı bir hesaplama aracı sunuyoruz.

Hücre Yayma Sırasında Hücre Kenarı Dinamiklerinin Nicel Analizi

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Bu videoda açıklanan protokol, yayılan hücrelerin yaşam boyu görüntülenmesi ve dinamikleri yayan hücreleri tarafsız ve otomatik bir şekilde ölçen bir hesaplama aracının kullanımı için gerekli deneysel prosedürleri tanımlayacaktır. Hücre yayma varlığı, hücre yayılma sırasında hücre kenar hareketinin ve morfolojik değişikliklerin sürekli izlenmesini sağlar, bu da mevcut hücre yayılma testlerinin çoğunda eksik olan bir özelliktir. Ayrıca, bu protokol, hücre döngüselliği, alan ve yayılan hücrelerin çıkıntı geri çekme döngüleri hakkında bilgi sağlayarak otomatik bilgisayar işleme ve analizinin kullanımını uygular.Bu tür otomatik işleme, veri analizindeki önyargıyı azaltır ve çok sayıda hücre için hücre yayma dinamiklerini analiz etmek için sağlam bir yöntem sağlar. İlaç tedavileri veya gen bilimi ve teknikleri ile birleştirildiğinde, bu protokol hücre çıkıntılarını düzenleyen moleküler oyuncuların büyük ölçekli hızlarına açıktır. Verilen protokol için, Kullanılan hücreler, plazma zarının floresan etiketlenmesine izin veren PH-Akt-GFP'yi genetik olarak kodlayan fare embriyonik fibroblastlarıdır.Test yayılan hücrenin başlangıcından önce, bir hücre çanağını% 90 izdiah eder. Hücreler uygun izdiah süresine ulaştıktan sonra, 22'ye 22 milimetrelik bir kapak kayması alevlendir ve 35 milimetrelik bir hücre kültürü çanağı içine yerleştirin. Kapak kaymasını PBS'de seyreltilmiş fibronektin ile mililitre başına 2,5 mikrogram konsantrasyona kadar kaplayın.Kapağı olan tabağı bir saat boyunca 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Bir saat sonra fibronektin, pipet ucuyla kapak kaymasına dokunmamaya dikkat ederim. Kapağın etrafına iki ila üç kez hafifçe pipetle vurarak yemeği PBS ile yıkayın.Hücre tohumlama için, hücre kültürü medyasını hücre çanaktan aspire ederek başlayın. Daha sonra, yemeği ılık PBS ile yıkayın. Yemeğe 650 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve enzimi eşit olarak dağıtmak için kabı eğin.Tripinli yemeği bir dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkadan sonra önce bir santrifüj tüpüne 10 mililitre hücre kültürü ortamı eklemeniz gerekir. Daha sonra, tripsinleri söndürmek için yemeğe 10 mililitre daha medya ekleyin.Kapak kayması üzerine tohumlanacak hücreleri seyreltmek için, yemeğin içeriğinin bir mililitresini santrifüj tüpüne pipetlayın. Tüpten pipet yaklaşık 500 ila 1.000 mikrolitre seyreltilmiş hücre kapak kayması ile kabın içine. Kapak kaymasının mililitre başına %10 veya 50.000 hücrede olduğundan emin olun ve seyreltilmiş hücrelerin hacmini gerektiği gibi ayarlayın.Bu hücrelerin amacı, görüntü alımı sırasında bir odak düzlemi oluşturmaktır. Çanaktaki kalan hücrelerle, hücrelerin beşte birini tedavi başına küçük bir tabağa geçirin. Bunlar, yayılma dinamikleri için analiz edilecek hücreler olacaktır.Pasaj tabaklarını ve kapak kayması kabını sekiz ila 24 saat boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Arp2/3'ün hücre yayılımı için önemini test etmek için, önce bir kontrole ve bir tedavi santrifüj tüpüne beş mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Daha sonra iki büyük santrifüj tüpünün her birine fenol kırmızısı olmayan 20 mililitre dmem ekleyin.Pipet ya Arp2/3 kompleksinin inhibitörü olan CK-666 ilacı ya da küçük ve büyük tüplere DMSO gibi kontrollü tedavi. Hücrelerin farmakolojik tedavisine başlamak için, bir gecede kuluçkaya yatıran pasaj yemeklerini çıkarın. Tüm yemeklerden hücre kültürü medyasını epire edin ve bulaşıkları ılık PBS ile yıkayın.CK-666 içeren küçük tüpleri alın veya takviyeli medyayı kontrol edin ve ilgili tüpün içeriğini pasaj yemeklerinin her birine ekleyin. Yemeklerin her birini doğru ilaç tedavisi ile etiketleyin ve ardından bulaşıkları bir saat daha inkübatöre yerleştirin Bir saatlik kuluçkadan sonra, her bir yemekten ilaç takviyeli medyayı aspire edin. Daha sonra, kalan tüm fenol kırmızı medyasını iyice çıkarmak için tüm yemeklere sıcak PBS ekleyin.230 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve bulaşıkları bir dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Trypsinized yemekleri inkübatörden çıkarın ve B tüpü olarak belirlenmiş bir tüpe fenol kırmızısı olmayan ilaç takviyeli dmem'in beş mililitresini eklemeye devam edin.Daha sonra tripsinleri söndürmek için ilgili yemeğe aynı ortamın beş mililitresini daha ekleyin. Tüm hücreleri tabaktan ayırmak için medyayı birkaç kez yukarı ve aşağı borulayın.Görüntüleme için uygun bir hücre seyreltmesi hazırlamak için çanağın tüm içeriğini tüp olarak belirlenmiş başka bir tüpe aktarın A.In A tüpünden bir mililitre hücreyi B tüpüne aktarın.Her tedavi için tüm seyreltme adımlarını tekrarlayın. Hücrelerin tripzyasyondan kurtulmasını sağlamak için tüm tüpleri 45 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. 22 ila 22 milimetrelik bir kapak fişini barındırabilen bir hücre manyetik odasının tüm parçalarının kullanımdan önce iyice temizlenmiş olduğundan emin olun.Kabı inkübatörden kapak kayması ile çıkarın. Hücre kültürü medyasını epire edin ve kapak fişini sıcak PBS ile yıkayın. Bir çift tokmak kullanarak kapak fişini çıkarın ve kapak kaymasını yavaşça manyetik odanın alt plakasına koyun.Sonra silikon contayı alın ve kapak fişinin üstüne yerleştirin. Manyetik odanın ana gövdesini alt plakaya takın. Manyetik odaya ilgili tedaviye karşılık gelen fenol kırmızısı olmayan dmem'in bir mililitresini ekleyin.Tüy bırakmayan bir doku alın ve sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için muhafazayı ana gövde ile alt plaka arasında dikkatlice dab. Manyetik odayı tamamlamak için şeffaf kapağı ana gövdeye diri diri uzadı. Son olarak kapak fişinin altını su ile püskürtülen bir doku ve% 70 etanol ile püskürtülen bir başka mendille silin.Konfokal mikroskobun sahne üstü inkübatörini 37 dereceye ısıtın. Manyetik odayı hedefin üstüne yerleştirin. Yayılma dinamiklerini elde etmeden önce, odağı yeşil floresan kanalındaki zaten polarize hücrelere ayarlayın.Bu, yayılan hücrelerin kapak kaymasına tutturulurken odakta olmasını sağlar. Manyetik odanın şeffaf kapağını ve pipet 500 mikrolitreyi inkübatörden çıkarılan B tüpünden çıkarın. Şeffaf kapağı tekrar üste yerleştirin.Hücre yayma analizi için ideal hücreleri tanımlamak için, kapak kaymasına henüz bağlanmamış veya ekin en erken aşamalarında olan hücreleri temsil eden yeşil haleler arayın. Görüntüleri alın ve dosyaları kaydedin. Hücre yaymanın görüntü alımını tamamladıktan sonra, Spyder gibi uyumlu bir Python IDE çalıştırarak başlayın.Hücre yayma dinamiklerinin hesaplamalı analizi için, ilgili komut dosyası paketlerinde sağlanan hücre yayma GUI dosyasını bulun ve açın. Arka planda analiz GUI panelini açacak çalıştır düğmesine basın. GUI, analiz için gereken tüm ayarları barındırr.Hücre alanını ve döngüselliği çözümlemek için, hücre yayılma alanı sekmesine edinme dosyasını ve gerekli ayarları girin. Ayarlamaların hücre türüne ve görüntü alma parametrelerine bağlı olarak yapılması gerekecektir. Çalıştırma tuşuna bastıktan sonra, komut dosyası tüm yayılan hücreler için zaman çizimi ile karşı bir hücre döngüselliği ve alanı oluşturur.Kimograf verileri için kimograf üreteci ve analiz sekmesine basın. Bu çözümleme, giriş dosyalarının tek hücreli görüntü yığınlarının kırpılmasını gerektirir. Tüm ayarları ekledikten ve çalıştırma tuşuna bastıktan sonra, komut dosyası verilen hücre için birden çok kimograf oluşturur.Solda, sağlanan komut dosyası kullanılarak otomatik olarak bölümlere ayrılmış DMSO ve CK-666 tedavilerinden temsili hücreler bulunur. Kontrol hücreleri tarafından gösterilen izotropik ve son derece dairesel morfolojinin aksine, Arp2/3 inhibe edilmiş hücreler döngüsellikte azalma gösterir. Ayrıca, otomatik olarak oluşturulan kimograflar, çıkıntıların dinamiklerini anlamak için kritik olan zamansal çözünürlük sağlar.Kontrol hücreleri, çok az veya hiç geri çekme olmadan sürekli olarak çıkıntılır. Buna karşılık, Arp2/3 inhibisyonu, yayılma boyunca geri çekilme olaylarındaki artışın gösterdiği gibi çıkıntıların stabilitesini bozar. Bu videolar size hücrelerin nasıl düzgün bir şekilde tohumlanacağını, farmakolojik tedavilerin nasıl gerçekleştirildiğini ve hücre yayma dinamiklerinin nicelleştirilmesi için gerekli görüntüleme ve hesaplama araçlarını nasıl hazırlayacağınızı anlamanızı sağlamalıdır.Bu protokol, hücre çıkıntılarını yöneten moleküler oyuncuları tanımlamak için sitoskeleton floresan görüntüleme ve göç tahlilleri ile daha da birleştirilebilir. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Canlı hücre Görüntüleme ve Kantitatif Analiz Embriyonik Epitel Hücreleri Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Determining Cell Number During Cell Culture using the Scepter Cell Counter

Hücre Kültürü sırasında Hücre Sayısını Belirleme Scepter Hücre Sayıcı

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Surface Spreading and Immunostaining of Yeast Chromosomes

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Dinamik için objektif-ücretsiz Video mikroskobu ve kantitatif analiz yapisan hücre kültürü

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...