Génération de xénogreffes larvaires de poisson zèbre et analyse du comportement tumoral

Les xénogreffes de poisson zèbre sont largement utilisées pour la recherche sur le cancer. Vous pouvez prendre des cellules tumorales humaines et les injecter dans de petites larves de poissons zèbres, ou même dans des adultes. Ici, ce que nous présentons est un protocole étape par étape du modèle de larve, où nous pouvons étudier plusieurs caractéristiques de cancer humain chez un animal vivant.

Vous pouvez étudier la prolifération, vous pouvez étudier l’angiogenèse, vous pouvez étudier les métastases, et aussi les interactions au sein du microenvironnement tumoral. Et un gros avantage est que vous pouvez étudier cela dans un laps de temps très court. Juste quatre jours, par exemple.

Un autre grand avantage est que vous pouvez étudier cela en direct avec une résolution unicellulaire, à l’aide d’un microscope confocal ou d’un microscope à feuille de lumière. Vous pouvez étudier comment les cellules migrent, comment les cellules interagissent les unes avec les autres, ou même comment elles se parlent. C’est donc un modèle très puissant pour étudier la biologie du cancer.

Les xénogreffes de poisson zèbre peuvent être utilisées pour étudier la réponse aux thérapies anticancéreuses, comme la chimiothérapie, la radiothérapie ou même les thérapies ciblées avec des anticorps. Et enfin, aussi, ce protocole peut également être adapté pour utiliser des cellules dérivées du patient à partir d’un échantillon chirurgical, ou même de biopsies, puis générer les avatars de poissons zèbres. Configuration pour l’injection.

Deux semaines avant l’injection, dilatez les cellules en culture. Commencez par l’excès de cellules et l’excès de poissons jusqu’à ce qu’ils deviennent compétents avec la technique, car de nombreuses cellules et poissons seront perdus pendant l’entraînement. Le tableau un des PDF ci-joint contient un guide détaillé des pourcentages optimaux de confluence in vitro pour l’injection de plusieurs lignées cellulaires.

Trois jours avant l’injection, croisez le poisson zèbre du fond souhaité. 24 heures avant l’injection. Nettoyez les plaques d’embryons de poisson zèbre.

Jetez tous les embryons morts et non développés et rafraîchissez le milieu E3. Dans la salle de culture cellulaire, jetez le milieu de culture cellulaire. Laver une fois avec PBS 1X pour enlever les cellules mortes et ajouter du milieu frais.

Préparez les outils pour la procédure d’injection, tels que les aiguilles de microinjection, les plaques d’agarose et les épingles à cheveux pour aligner les embryons pour l’injection. Pour la préparation de la plaque, versez une couche d’agarose dissoute à 2% dans le couvercle d’une boîte de Pétri propre. Laissez-le polymériser et à l’aide d’une règle, faire trois à quatre lignes droites d’agarose pour l’alignement des embryons.

Jour d’injection. Séparez les embryons éclos des œufs non éclos. L’ajout de pronase au milieu embryonnaire à ce stade peut stimuler l’éclosion.

Placez les embryons dans l’incubateur à 28 degrés Celsius jusqu’à l’injection. Étiquetage cellulaire pour injection. Pour aider à la mise en place d’une technique d’étiquetage cellulaire reproductible, vérifiez les tableaux un et deux du protocole écrit pour une compilation d’une liste de lignées cellulaires et de plusieurs solutions d’étiquetage.

Retirer le milieu de culture cellulaire et laver le ballon deux fois avec du PBS 1X. Étiquetez les cellules avec un colorant lipophile, en évitant l’exposition à la lumière, et incuber le ballon à 37 degrés. Vous pouvez également choisir d’étiqueter les cellules dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml lors du détachement.

Retirez la solution d’étiquetage cellulaire et lavez les cellules avec du PBS 1X pour éliminer l’excès de colorant. Ajoutez l’agent de détachement correspondant et incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Faciliter le processus de détachement en brossant le ballon avec un grattoir à cellules stériles et recueillir les cellules avec une pipette sérologique.

Transférer les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml et centrifuger. Jeter le surnageant et suspendre à nouveau le granulé avec du milieu de culture cellulaire. Quantifier la viabilité cellulaire à l’aide d’une chambre de Neubauer avec exclusion du bleu trypan ou d’une autre méthode de choix.

Centrifuger et re-suspendre les cellules dans le milieu d’injection. Les concentrations recommandées de cellules en milieu se trouvent dans le tableau un du manuscrit. À partir de ce moment, les cellules doivent être maintenues sur la glace.

Procédures d’injection. Anesthésier les embryons en tricaine 1X pendant 5 minutes. Ensuite, transférez une petite quantité d’embryons anesthésiés sur une plaque d’agarose et alignez-les à l’aide d’une boucle en épingle à cheveux.

Assurez-vous de maintenir la distance entre les embryons. Surtout entre le jaune de l’un et la tête du suivant. Pour prévenir la mortalité, assurez-vous que les embryons alignés ne se dessèchent pas dans la plaque d’agarose en ajoutant soigneusement une à trois gouttes de solution de tricaine 1X à la plaque.

Appuyez légèrement sur le tube de microcentrifugation pour suspendre à nouveau les cellules. Chargez l’aiguille d’injection avec une suspension cellulaire à l’aide d’une pointe microchargeuse, en évitant les bulles d’air, car elles peuvent compromettre l’intégrité des embryons. Ouvrez la soupape de pression d’air, configurez le microinjecteur et placez soigneusement l’aiguille de microinjection dans le support.

Couper l’aiguille de microinjection près de la pointe. Percez soigneusement le jaune de l’embryon, abaissant l’angle de l’aiguille et poussant prudemment jusqu’à ce que le bout de l’aiguille atteigne l’espace périivitellin. Une fois que la pointe est dans l’espace perivitelline, injecter les cellules.

Essayez d’injecter un volume de cellules similaire à la taille de l’œil de l’embryon et aussi loin que possible du cœur pour prévenir l’œdème cardiaque. Ajustez la pression du micro-injecteur, si nécessaire. Transférer les embryons injectés dans une boîte de Petri propre avec une solution de tricaine 1X et les laisser reposer pendant cinq à 10 minutes.

Cela donnera à la plaie le temps de se refermér. Retirez la solution de tricaine 1X et ajoutez du milieu frais E3. Ensuite, incuber les embryons à 34 degrés Celsius.

Cette température permettra la survie à la fois des embryons de poisson zèbre et des cellules tumorales humaines. Essai métastatique. Si vous souhaitez étudier le potentiel métastatique de vos lignées cellulaires, environ une heure après l’injection, examinez les embryons injectés sur un stéréomicroscope à fluorescence et triez-les en deux groupes en fonction de l’absence ou de la présence de cellules cancéreuses en circulation.

Un jour après l’injection. Sur un stéréomicroscope à fluorescence, analysez soigneusement chaque embryon et sélectionnez ceux qui ont des tumeurs correctement injectées. Triez les xénogreffes sélectionnées en fonction de la taille de la tumeur.

Utilisez la taille de l’œil à des fins de comparaison. Jetez tous les embryons présentant une morphologie anormale, un œdème cardiaque ou jaune, des xénogreffes avec très peu de cellules cancéreuses ou ceux avec des cellules cancéreuses uniquement à l’intérieur du jaune. Distribuez les xénogreffes selon la disposition expérimentale souhaitée et commencez le test du médicament.

Remplacez les médicaments et le milieu E3 tous les jours. Incuber les xénogreffes, en maintenant la température de 34 degrés Celsius jusqu’à la fin du test. Quatre jours après l’injection.

Le dernier jour du test, anesthésiez les xénogreffes avec une solution de tricaine 1X et alignez-les soigneusement sur la plaque de gélose. Jetez toutes les xénogreffes mortes ou enflées. Ces xénogreffes ne sont pas considérées pour la quantification de l’engraftment.

Sur un stéréomicroscope de fluorescence, analysez soigneusement chaque xénogreffe et évaluez l’absence ou la présence de tumeurs dans l’espace perivitelline. Selon la configuration expérimentale, sélectionnez les xénogreffes d’intérêt et euthanasiez-les avec de la tricaine 25X. Fixez-les dans du formaldéhyde à 4% pendant au moins 4 heures à température ambiante pour procéder à l’immunomarquage.

Sinon, conservez la nuit à quatre degrés Celsius et le lendemain, remplacez le formaldéhyde par du méthanol à 100%. Les xénogreffes fixées dans du méthanol à 100% peuvent être stockées à 20 degrés indéfiniment. Immunomarquage de monture entière pour l’imagerie confocale.

L’ensemble de la technique d’immunofluorescence de montage prend trois jours, répartis comme suit. Le premier jour est pour la perméabilisation des xénogreffes et l’incubation des anticorps primaires. Le deuxième jour, pour le lavage et l’incubation d’anticorps secondaires.

Et le troisième jour, pour le lavage, la fixation des xénogreffes et le stockage dans le support de montage. Vous trouverez plus de détails sur cette procédure dans le PDF ci-joint. Montage de xénogreffes.

Scellez les bords d’un slip de couvercle avec de la vaseline ou de la graisse de silicone, afin que le support de montage ne fuit pas. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les xénogreffes sur le couvercle. Alignez-les soigneusement avec une épingle à cheveux.

Ajoutez le support de montage à un autre glissement de couvercle. Joignez soigneusement les deux feuillets de couverture et placez-les sur une lame de microscope pour faciliter la manipulation. Imagerie confocale.

Une lentille d’objectif d’immersion apochromatique de 25X avec correction d’eau est optimale pour l’imagerie des tumeurs avec une résolution de cellule unique. Acquérir les échantillons à l’aide de la fonction Z-Stack avec un intervalle de cinq microns entre chaque tranche. Ouvrez les données brutes dans le logiciel Fidji.

Sélectionnez trois tranches représentatives de la tumeur du haut, du milieu et du bas, par z-stack, par xénogreffe. Ouvrez le plugin Cell Counter à partir du logiciel Fiji. Dans l’outil Compteur de cellules, cliquez sur Initialiser, sélectionnez un type de compteur, puis cliquez sur l’image pour démarrer manuellement le mode de comptage.

Pour chaque clic, le compteur demande combien de cellules sont comptées. Pour obtenir le nombre total de cellules dans la tumeur, utilisez la formule suivante. Pour évaluer le nombre total ou le pourcentage de marqueurs, tels que les cellules immunitaires, les figures mitotiques, la caspase activée, entre autres, quantifier manuellement les cellules qui sont positives à l’étiquetage spécifique, marqueur ou transgène d’intérêt le long de toutes les tranches de la pile z avec le plugin Cell Counter.

N’oubliez pas que certaines cellules seront situées entre deux tranches. Faites des allers-retours dans la pile z pour vous assurer qu’aucune cellule n’est comptée deux fois. Résultats représentatifs.

Des xénogreffes de variété de cellule de cancer côlorectal HCT 116 ont été générées comme décrit dans le protocole. Des xénogreffes ont été distribuées aléatoirement dans les témoins non traités et la chimiothérapie FOLFIRI. L’immunofluorescence a été exécutée pour détecter les cellules apoptotic, utilisant l’anticorps caspase-3 anti-clivé et le DAPI pour counterstaining nucléique.

La quantification de l’index mitotic, de l’apoptose, et de la taille de tumeur, a indiqué que FOLFIRI induit une diminution significative de mitose et une induction significative d’apoptosis, accompagnée d’une réduction de 54% de taille de tumeur. Ces dispositifs sont utiles dans les criblages phénotypiques à haut débit de drogue, aussi bien que pour tester les effets intrinsèques et physiologiques de cellules de plusieurs traitements de cancer dans un court laps de temps. Un autre grand avantage du modèle de xénogreffe de poisson zèbre est qu’il est possible d’étudier les interactions de différentes cellules tumorales et d’analyser comment chaque type de cellule peut influencer le comportement de l’autre.

Différentes cellules cancéreuses humaines, différents clones de la même tumeur, ou de différentes tumeurs, peuvent être co-injectés. Dans cet exemple, deux variétés de cellule de cancer côlorectal dérivées du même patient ont été étiquetées avec différents colorants lipophiles et mélangées dans un rapport de un-à-un pour l’injection. Nous espérons que ce protocole pourra aider les chercheurs à devenir de véritables experts dans la génération de xénogreffes de poisson zèbre.

Ce n’est pas facile. Vous devez pratiquer, pratiquer. N’abandonnez pas.

Je suis sûr que vous y arriverez. Bonne chance.