Generation von Zebrafischen Larval Xenografts und Tumorverhaltensanalyse

Zebrafisch Xenografts sind weit verbreitet für die Krebsforschung verwendet. Sie können menschliche Tumorzellen nehmen und in kleine Larven Zebrafische injizieren, oder sogar in Erwachsene. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll des Larvenmodells vor, in dem wir mehrere menschliche Krebsmerkmale bei einem lebenden Tier untersuchen können.

Sie können Proliferation studieren, Sie können Angiogenese studieren, Sie können Metastasen und auch Wechselwirkungen innerhalb der Tumormikroumgebung untersuchen. Und ein großer Vorteil ist, dass Sie dies in einem sehr kurzen Zeitrahmen studieren können. Nur vier Tage zum Beispiel.

Ein weiterer großer Vorteil ist, dass Sie dies live mit Einzelzellauflösung mit einem konfokalen oder einem Lichtbogenmikroskop studieren können. Sie können untersuchen, wie Zellen migrieren, wie Zellen miteinander interagieren oder sogar, wie sie miteinander sprechen. Es ist also ein wirklich mächtiges Modell, um Krebsbiologie zu studieren.

Zebrafish Xenografts können verwendet werden, um Die Reaktion auf Anti-Krebs-Therapien zu studieren, wie Chemotherapie, Strahlentherapie, oder sogar gezielte Therapien mit Antikörpern. Und schließlich kann dieses Protokoll auch angepasst werden, um patientenabgeleitete Zellen aus einer chirurgischen Probe oder sogar aus Biopsien zu verwenden und dann die Zebrafisch-Avatare zu generieren. Einrichten der Injektion.

Zwei Wochen vor der Injektion, erweitern Sie die Zellen in der Kultur. Beginnen Sie mit überschüssigen Zellen und überschüssigen Fischen, bis sie mit der Technik in Die Hand genommen werden, da viele Zellen und Fische während des Trainings verloren gehen. Tabelle 1 der begleitenden PDF-Datei enthält eine detaillierte Anleitung zu den optimalen Prozentsätzen des in-vitro-Konfluences zur Injektion mehrerer Zelllinien.

Drei Tage vor der Injektion, überqueren Sie die Zebrafische des gewünschten Hintergrunds. 24 Stunden vor der Injektion. Reinigen Sie die Zebrafisch-Embryoplatten.

Entsorgen Sie alle toten und nicht entwickelten Embryonen und erfrischen Sie E3-Medium. Entsorgen Sie im Zellenkulturraum das Zellkulturmedium. Einmal mit PBS 1X waschen, um die abgestorbenen Zellen zu entfernen und frisches Medium hinzuzufügen.

Bereiten Sie die Werkzeuge für das Injektionsverfahren vor, wie Mikroinjektionsnadeln, Agaroseplatten und Haarnadeln, um die Embryonen für die Injektion auszurichten. Für die Plattenzubereitung eine Schicht gelöster 2%Agarose in den Deckel einer sauberen Petrischale geben. Lassen Sie es polymerisieren und mit Hilfe eines Lineals, machen drei bis vier gerade Agarose Linien für die Ausrichtung der Embryonen.

Injektionstag. Trennen Sie die geschlüpften Embryonen von ungeschlüpften Eiern. Das Hinzufügen von Pronase zum Embryomedium in diesem Stadium kann das Schlüpfen ankurbeln.

Legen Sie die Embryonen bis zur Injektion bei 28 Grad Celsius in den Inkubator. Zellbeschriftung zur Injektion. Um bei der Erstellung einer reproduzierbaren Zelletikettierungstechnik zu helfen, überprüfen Sie die Tabellen eins und zwei des geschriebenen Protokolls auf eine Zusammenstellung einer Liste von Zelllinien und mehreren Etikettierungslösungen.

Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie den Kolben zweimal mit PBS 1X. Beschriften Sie die Zellen mit einem lipophilen Farbstoff, vermeiden Sie die Exposition gegenüber Licht, und bebrüten Sie den Kolben bei 37 Grad. Sie können die Zellen auch nach ablösender Ablösung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr beschriften.

Entfernen Sie die Zellbeschriftungslösung und waschen Sie die Zellen mit PBS 1X, um den überschüssigen Farbstoff herauszunehmen. Fügen Sie das entsprechende Trennmittel hinzu, und brüten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Erleichtern Sie den Ablösungsprozess, indem Sie den Kolben mit einem sterilen Zellschaber bürsten und die Zellen mit einer serologischen Pipette sammeln.

Übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge. Überstand entsorgen und das Pellet mit Zellkulturmedium wieder aufhängen. Quantifizieren Sie die Zelllebensfähigkeit mit einer Neubauer-Kammer mit Trypan-Blau-Ausschluss oder einer anderen Methode der Wahl.

Zentrifuge und re-suspendieren die Zellen im Injektionsmedium. Die empfohlenen Konzentrationen von Zellen im Medium finden Sie in Tabelle 1 des Manuskripts. Von diesem Zeitpunkt an müssen die Zellen auf Eis gehalten werden.

Injektionsverfahren. Anästhetisieren Sie die Embryonen in Tricain 1X für 5 Minuten. Dann übertragen Sie eine kleine Menge anästhesierter Embryonen auf eine Agaroseplatte und richten Sie sie mit Hilfe einer Haarnadelschlaufe aus.

Achten Sie darauf, den Abstand zwischen den Embryonen zu halten. Vor allem zwischen dem Eigelb eines und dem Kopf des nächsten. Um die Sterblichkeit zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die ausgerichteten Embryonen nicht in der Agaroseplatte austrocknen, indem Sie der Platte sorgfältig einen bis drei Tropfen Tricain 1X-Lösung hinzufügen.

Tippen Sie leicht auf das Mikrozentrifugenrohr, um die Zellen wieder aufzuhängen. Laden Sie die Injektionsnadel mit einer Zellsuspension mit einer Microloader-Spitze zurück, um Luftblasen zu vermeiden, da sie die Integrität der Embryonen beeinträchtigen können. Öffnen Sie das Luftdruckventil, richten Sie den Mikroinjektor ein und legen Sie die Mikroinjektionsnadel vorsichtig in den Halter.

Schneiden Sie die Mikroinjektionsnadel in der Nähe der Spitze. Durchbohren Sie vorsichtig das Eigelb des Embryos, senken Sie den Winkel der Nadel und drücken Sie vorsichtig, bis die Spitze der Nadel den Perivitelline-Raum erreicht. Sobald sich die Spitze im Perivitelline-Raum befindet, injizieren Sie die Zellen.

Versuchen Sie, ein Volumen von Zellen ähnlich der Größe des Embryos Auge zu injizieren, und so weit wie möglich aus dem Herzen, um Herzödem zu verhindern. Passen Sie bei Bedarf den Mikroinjektordruck an. Übertragen Sie die injizierten Embryonen in eine saubere Petrischale mit Tricain 1X Lösung und lassen Sie sie für fünf bis 10 Minuten ruhen.

Dies wird der Wunde Zeit geben, zu schließen. Entfernen Sie die Tricain 1X Lösung und fügen Sie frisches E3 Medium hinzu. Dann inkubieren Sie die Embryonen bei 34 Grad Celsius.

Diese Temperatur ermöglicht das Überleben sowohl der Zebrafisch-Embryonen als auch der menschlichen Tumorzellen. Metastasierender Assay. Wenn Sie das metastasierende Potenzial Ihrer Zelllinien untersuchen möchten, werden die injizierten Embryonen nach der Injektion nach etwa einer Stunde auf einem Fluoreszenz-Stereomikroskop untersucht und entsprechend dem Fehlen oder Vorhandensein von Krebszellen im Kreislauf in zwei Gruppen sortiert.

Ein Tag nach der Injektion. Analysieren Sie auf einem Fluoreszenz-Stereomikroskop jeden Embryo sorgfältig und wählen Sie diejenigen mit richtig injizierten Tumoren aus. Sortieren Sie die ausgewählten Xenografts nach der Tumorgröße.

Verwenden Sie die Größe des Auges zum Vergleich. Entsorgen Sie Embryonen mit abnormaler Morphologie, Herz- oder Eigelbödem, Xenografts mit sehr wenigen Krebszellen oder Embryonen mit Krebszellen nur im Eigelb. Verteilen Sie die Xenografts nach dem gewünschten experimentellen Layout und starten Sie den Arzneimitteltest.

Ersetzen Sie die Medikamente und E3 Medium täglich. Inkubieren Sie die Xenografts, wobei die Temperatur von 34 Grad Celsius bis zum Ende des Assays beibehalten wird. Vier Tage nach der Injektion.

Am letzten Tag des Assays die Xenografts mit Tricain 1X Lösung anästheisieren und sorgfältig auf der Agarplatte ausrichten. Entsorgen Sie alle toten oder geschwollenen Xenografts. Diese Xenografts werden nicht für die Transplantationsquantifizierung berücksichtigt.

Analysieren Sie auf einem Fluoreszenz-Stereomikroskop sorgfältig jedes Xenograft und bewerten Sie das Fehlen oder Vorhandensein von Tumoren im Perivitelline-Raum. Nach dem experimentellen Setup, wählen Sie die Xenografts von Interesse und einschläfern sie mit Tricain 25X. Fixieren Sie sie in 4%Formaldehyd für mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur, um mit der Immunfärbung fortzufahren.

Ansonsten über Nacht bei vier Grad Celsius lagern und am nächsten Tag Formaldehyd durch 100% Methanol ersetzen. Xenografts, die in 100% Methanol fixiert sind, können bei 20 Grad unbegrenzt gelagert werden. Ganzer Mount Immunostaining für konfokale Bildgebung.

Die gesamte Mount-Immunfluoreszenz-Technik dauert drei Tage, wie folgt aufgeteilt. Der erste Tag ist für die Permeabilisierung der Xenografts und primäre Antikörper-Inkubation. Am zweiten Tag zum Waschen und sekundären Antikörperinkubation.

Und am dritten Tag, zum Waschen, Fixieren von Xenotransplantaten und Lagerung im Montagemedium. Weitere Informationen zu diesem Verfahren finden Sie im begleitenden PDF. Montage von Xenografts.

Versiegeln Sie die Ränder eines Deckelschlupfes mit Petroleumgelee oder Silikonfett, damit das Montagemedium nicht austritt. Übertragen Sie die Xenografts mit einer Pasteur-Pipette auf den Deckbeleg. Richten Sie sie vorsichtig mit einer Haarnadel aus.

Fügen Sie das Montagemedium zu einem anderen Deckbeleg hinzu. Verbinden Sie vorsichtig beide Deckschlipsundungen und legen Sie sie auf ein Mikroskopschlitten, um eine einfachere Manipulation zu ermöglichen. Konfokale Bildgebung.

Eine apochromatische 25-fache Tauchobjektivlinse mit Wasserkorrektur ist optimal für bildgebende Tumoren mit einer Einzelzellauflösung. Erfassen Sie die Proben mit der Z-Stack-Funktion mit einem Intervall von fünf Mikrometern zwischen jedem Slice. Öffnen Sie die Rohdaten in Fidschi-Software.

Wählen Sie drei repräsentative Scheiben des Tumors von oben, Mitte und Unten, pro Z-Stack, pro Xenograft. Öffnen Sie das Cell Counter Plugin von Fidschi-Software. Klicken Sie im Werkzeug Zellenzähler auf Initialisieren, wählen Sie einen Zählertyp aus, und klicken Sie auf das Bild, um den Zählmodus manuell zu starten.

Bei jedem Klick fragt der Zähler, wie viele Zellen gezählt werden. Verwenden Sie die folgende Formel, um die Gesamtzahl der Zellen im Tumor zu erhalten. Um die Gesamtzahl oder den Prozentsatz der Marker, wie ZB-Immunzellen, mitotische Zahlen, aktivierte Caspase, zu bewerten, quantifizieren Sie unter anderem manuell die Zellen, die positiv auf die spezifische Beschriftung, Markierung oder Transgene von Interesse entlang aller Segmente des Z-Stacks mit dem Cell Counter Plugin sind.

Beachten Sie, dass sich einige Zellen zwischen zwei Slices befinden. Gehen Sie im Z-Stack hin und her, um sicherzustellen, dass keine Zelle zweimal gezählt wird. Repräsentative Ergebnisse.

HCT 116 Darmkrebszelllinien-Xenografts wurden wie im Protokoll beschrieben erzeugt. Xenografts wurden nach dem Zufallsprinzip in nicht behandelten Kontrollen und FOLFIRI Chemotherapie verteilt. Immunfluoreszenz wurde durchgeführt, um apoptotische Zellen zu detektieren, mit Anti-Cleaved Caspase-3-Antikörper und DAPI für nukleinige Gegenfärbung.

Quantifizierung des mitotischen Index, Apoptose, und Tumorgröße, zeigte, dass FOLFIRI induziert eine signifikante Abnahme der Mitose und eine signifikante Induktion der Apoptose, begleitet von einer 54%igen Verringerung der Tumorgröße. Diese Eigenschaften sind nützlich in Hochdurchsatz phänotisch Drogen-Screens, sowie die Zelle intrinsische und physiologische Effekte von mehreren Krebsbehandlungen in einem kurzen Zeitrahmen zu testen. Ein weiterer großer Vorteil des Zebrafisch-Xenograft-Modells ist, dass es möglich ist, die Wechselwirkungen verschiedener Tumorzellen zu untersuchen und zu analysieren, wie jede Art von Zelle das Verhalten der anderen beeinflussen kann.

Verschiedene menschliche Krebszellen, verschiedene Klone aus demselben Tumor oder aus verschiedenen Tumoren können mitinjiziert werden. In diesem Beispiel wurden zwei von demselben Patienten abgeleitete Darmkrebszelllinien mit unterschiedlichen lipophilen Farbstoffen beschriftet und in einem Verhältnis von eins zu eins zur Injektion gemischt. Wir hoffen, dass dieses Protokoll Forschern helfen kann, echte Experten bei der Erzeugung von Zebrafisch-Xenografts zu werden.

Es ist nicht leicht. Sie müssen üben, üben. Gib nicht auf.

Ich bin sicher, dass Sie es erreichen werden. Viel Glück.