Geração de Xenoenxertos Larval de Zebrafish e Análise do Comportamento do Tumor

Xenoenxertos de zebrafish estão sendo amplamente utilizados para pesquisas sobre câncer. Você pode pegar células tumorais humanas e injetá-la em pequenos zebrafish larvas, ou mesmo em adultos. Aqui, o que estamos apresentando é um protocolo passo a passo do modelo larva, onde podemos estudar várias marcas de câncer humano em um animal vivo.

Você pode estudar a proliferação, você pode estudar angiogênese, você pode estudar metástase, e também interações dentro do microambiente tumoral. E uma grande vantagem é que você pode estudar isso em um período de tempo muito curto. Apenas quatro dias, por exemplo.

Outra grande vantagem é que você pode estudar isso ao vivo com resolução de célula única, usando um microscópio confocal ou uma folha de luz. Você pode estudar como as células migram, como as células interagem entre si, ou até mesmo como elas conversam entre si. Então é um modelo muito poderoso para estudar biologia do câncer.

Xenoenxertos de zebrafish podem ser usados para estudar a resposta a terapias anticâncgenas, como quimioterapia, radioterapia ou até mesmo terapias-alvo com anticorpos. E, finalmente, também, este protocolo também pode ser adaptado para usar células derivadas do paciente a partir de uma amostra cirúrgica, ou mesmo de biópsias, e, em seguida, gerar os avatares de zebrafish. Preparando-se para injeção.

Duas semanas antes da injeção, expanda as células na cultura. Comece com o excesso de células e o excesso de peixes até se tornar proficiente com a técnica, já que muitas células e peixes serão perdidos durante o treinamento. A tabela um do PDF que acompanha tem um guia detalhado das porcentagens ideais de confluência in vitro para injeção de várias linhas celulares.

Três dias antes da injeção, cruze o zebrafish do fundo desejado. 24 horas antes da injeção. Limpe as placas de embrião de zebrafish.

Descarte todos os embriões mortos e não desenvolvidos e atualize o meio E3. Na sala de cultura celular, descarte o meio de cultura celular. Lave uma vez com PBS 1X para remover as células mortas e adicione meio fresco.

Prepare as ferramentas para o procedimento de injeção, como agulhas de microinjeção, placas de ágarose e grampos de cabelo para alinhar os embriões para injeção. Para a preparação da placa, despeje uma camada de 2% de agarose dissolvida na tampa de uma placa de Petri limpa. Deixe polimerizar e com a ajuda de uma régua, faça de três a quatro linhas retas de agarose para o alinhamento dos embriões.

Dia da injeção. Separe os embriões eclodidos de ovos não-descomparáveis. Adicionar Pronase ao meio do embrião nesta fase pode impulsionar a eclosão.

Coloque os embriões na incubadora a 28 graus Celsius até a injeção. Rotulagem celular para injeção. Para ajudar no estabelecimento de uma técnica de rotulagem celular reprodutível, verifique as tabelas um e dois do protocolo escrito para uma compilação de uma lista de linhas celulares e várias soluções de rotulagem.

Remova o meio de cultura celular e lave o frasco duas vezes com PBS 1X. Rotule as células com um corante lipofílico, evitando a exposição à luz, e incubar o frasco a 37 graus. Você também pode optar por rotular as células em um tubo de microcentrifuge de 1,5 ml após o descolamento.

Remova a solução de rotulagem celular e lave as células com PBS 1X para retirar o excesso de corante. Adicione o agente de desprendimento correspondente e incuba as células a 37 graus Celsius. Facilite o processo de desprendimento escovando o frasco com um raspador de células estéril e coletar as células com uma pipeta sorológica.

Transfira as células para tubos de microcentrifuuagem de 1,5 ml e centrífuga. Descarte o supernasce e suspenda a pelota com meio de cultura celular. Quantifique a viabilidade celular usando uma câmara de Neubauer com exclusão azul trypan ou outro método de escolha.

Centrifugar e suspender as células no meio de injeção. As concentrações recomendadas de células em médio podem ser encontradas na tabela um do manuscrito. A partir deste ponto, as células devem ser mantidas no gelo.

Procedimentos de injeção. Anestesiar os embriões em tricaine 1X por 5 minutos. Em seguida, transfira uma pequena quantidade de embriões anestesiados para uma placa de agarose e alinhe-os com a ajuda de um laço de grampo.

Certifique-se de manter distância entre os embriões. Especialmente entre a gema de um e a cabeça da próxima. Para evitar a mortalidade, certifique-se de que os embriões alinhados não sequem na placa de agarose, adicionando cuidadosamente uma a três gotas de solução tricaine 1X à placa.

Toque levemente no tubo de microcentrifuge para suspender as células. Encarregar a agulha de injeção com uma suspensão celular usando uma ponta microcarregadora, evitando bolhas de ar, pois podem comprometer a integridade dos embriões. Abra a válvula de pressão de ar, configure o microinjetor e coloque cuidadosamente a agulha de microinjeção no suporte.

Corte a agulha de microinjeção perto da ponta. Fure cuidadosamente a gema do embrião, baixando o ângulo da agulha e empurrando cautelosamente até que a ponta da agulha atinja o espaço perivitelline. Uma vez que a ponta esteja no espaço perivitelline, injete as células.

Tente injetar um volume de células semelhante ao tamanho do olho do embrião, e o mais longe possível do coração para evitar edema cardíaco. Ajuste a pressão do microinjetor, se necessário. Transfira os embriões injetados para uma placa de Petri limpa com solução tricaine 1X e deixe descansar por cinco a 10 minutos.

Isso dará tempo para a ferida fechar. Remova a solução tricaine 1X e adicione um novo meio E3. Em seguida, incubar os embriões a 34 graus Celsius.

Esta temperatura permitirá a sobrevivência tanto dos embriões de zebrafish quanto das células tumorais humanas. Ensaio metastático. Se você quiser estudar o potencial metastático de suas linhas celulares, em cerca de uma hora após a injeção, trie os embriões injetados em um estereóscópio de fluorescência, e classifique-os em dois grupos de acordo com a ausência ou presença de células cancerígenas em circulação.

Um dia após a injeção. Em um estereóscópio de fluorescência, analise cuidadosamente cada embrião e selecione aqueles com tumores devidamente injetados. Classifique os xenoenxertos selecionados de acordo com o tamanho do tumor.

Use o tamanho do olho para comparação. Descarte quaisquer embriões com morfologia anormal, edema cardíaco ou gema, xenoenxertos com pouquíssimas células cancerígenas, ou aqueles com células cancerosas apenas dentro da gema. Distribua os xenoenxertos de acordo com o layout experimental desejado e inicie o ensaio da droga.

Substitua as drogas e o meio E3 diariamente. Incubar os xenoenxertos, mantendo a temperatura de 34 graus Celsius até o final do ensaio. Quatro dias após a injeção.

No último dia do ensaio, anestesia os xenoenxertos com solução tricaine 1X, e alinhe-os cuidadosamente na placa de ágar. Descarte xenógrafos mortos ou inchados. Estes xenoenxertos não são considerados para quantificação de engrafamento.

Em um estereóscópio de fluorescência, analise cuidadosamente cada xenoenxerto e avalie a ausência ou presença de tumores no espaço perivitelline. De acordo com a configuração experimental, selecione os xenoenxertos de interesse e eutanize-os com tricaine 25X. Fixá-los em 4% de formaldeído por pelo menos 4 horas em temperatura ambiente para prosseguir com a imunossuagem.

Caso contrário, armazene durante a noite a quatro graus Celsius e no dia seguinte, substitua o formaldeído por 100%de metanol. Xenoenxertos fixados em 100% de metanol podem ser armazenados a 20 graus indefinidamente. Imunostaining de montagem inteira para imagens confocal.

Toda a técnica de imunofluorescência do monte leva três dias, dividida da seguinte forma. O primeiro dia é para permeabilização dos xenoenxertos e incubação de anticorpos primários. No segundo dia, para lavagem e incubação de anticorpos secundários.

E o terceiro dia, para lavagem, fixação de xenoenxertos e armazenamento no meio de montagem. Mais detalhes deste procedimento podem ser encontrados no PDF que acompanha. Montagem de xenoenxertos.

Sele as bordas de um deslizamento de cobertura com geleia de petróleo ou graxa de silicone, para que o meio de montagem não vaze. Usando uma pipeta Pasteur, transfira os xenoenxertos para o deslizamento da tampa. Alinhe-os cuidadosamente com um grampo de cabelo.

Adicione o meio de montagem a outro deslizamento de cobertura. Junte cuidadosamente ambos os deslizamentos de cobertura e coloque-os em cima de um slide de microscópio para permitir uma manipulação mais fácil. Imagem confocal.

Uma lente objetiva de imersão apochromatic 25X com correção de água é ideal para tumores de imagem com resolução de uma única célula. Adquira as amostras usando a função Z-Stack com um intervalo de cinco mícrons entre cada fatia. Abra os dados brutos no software Fiji.

Selecione três fatias representativas do tumor de cima, médio e inferior, por pilha z, por xenoenxerto. Abra o plugin Cell Counter do software Fiji. Na ferramenta Contador de células, clique em Inicializar, selecione um tipo de contador e clique na imagem para iniciar o modo de contagem manualmente.

Para cada clique, o contador pergunta quantas células são contadas. Para obter o número total de células no tumor, use a seguinte fórmula. Avaliar números totais ou percentual de marcadores, como células imunes, figuras mitóticas, caspase ativada, entre outros, quantificar manualmente as células positivas à rotulagem específica, marcador ou transgene de interesse ao longo de todas as fatias da pilha z com o plugin Cell Counter.

Esteja ciente de que algumas células estarão localizadas entre duas fatias. Vá e volte na pilha z para ter certeza de que nenhuma célula está sendo contada duas vezes. Resultados representativos.

Os xenoenxertos da linha de células cancerígenas colorretal HCT 116 foram gerados conforme descrito no protocolo. Os xenoenxertos foram distribuídos aleatoriamente em controles não tratados e quimioterapia FOLFIRI. A imunofluorescência foi realizada para detectar células apoptóticas, utilizando anticorpos caspase-3 anti-fenda e DAPI para contra-retenção nucleica.

A quantificação do índice mitótico, apoptose e tamanho do tumor, revelou que o FOLFIRI induz uma diminuição significativa da mitose e uma indução significativa da apoptose, acompanhada de uma redução de 54% do tamanho do tumor. Essas características são úteis em telas de medicamentos fenotípicos de alto rendimento, bem como para testar os efeitos intrínsecos e fisiológicos de várias tratamentos de câncer em um curto espaço de tempo. Outra grande vantagem do modelo de xenoenxerto de zebrafish é que é possível estudar as interações de diferentes células tumorais e analisar como cada tipo de célula pode influenciar o comportamento do outro.

Diferentes células cancerígenas humanas, clones diferentes do mesmo tumor, ou de tumores diferentes, podem ser co-injetados. Neste exemplo, duas linhas de células cancerígenas colorretais derivadas do mesmo paciente foram rotuladas com diferentes corantes lipofílicos e misturadas em uma proporção de um para um para injeção. Esperamos que este protocolo possa ajudar os pesquisadores a se tornarem verdadeiros especialistas na geração de xenoenxertos de zebrafish.

Não é fácil. Você precisa praticar, praticar. Não desista.

Tenho certeza que você vai chegar lá. Boa sorte.