Generation av zebrafisk larv Xenografts och tumör beteende analys

Zebrafisk xenografts används ofta för cancerforskning. Du kan ta mänskliga tumörceller och injicera det i små larver zebrafisk, eller till och med i vuxna. Här presenterar vi ett steg-för-steg-protokoll av larvamodellen, där vi kan studera flera mänskliga cancermärken i ett levande djur.

Du kan studera spridning, du kan studera angiogenes, du kan studera metastasering och även interaktioner inom tumörmikromiljön. Och en stor fördel är att du kan studera detta på mycket kort tid. Bara fyra dagar, till exempel.

En annan stor fördel är att du kan studera detta live med encellsupplösning, med hjälp av ett konfokalt eller ett ljust arkmikroskop. Du kan studera hur celler migrerar, hur celler interagerar med varandra eller till och med hur de pratar med varandra. Så det är en väldigt kraftfull modell för att studera cancerbiologi.

Zebrafisk xenografts kan användas för att studera svar på anti-cancer terapier, som kemoterapi, strålbehandling, eller till och med riktade terapier med antikroppar. Och slutligen kan detta protokoll också anpassas för att använda patientbaserade celler från ett kirurgiskt prov, eller till och med från tarmbiopsier, och sedan generera zebrafiskavatarerna. Inställning för injektion.

Två veckor före injektion, expandera cellerna i kulturen. Börja med överflödiga celler och överflödig fisk tills du blir skicklig på tekniken, eftersom många celler och fisk kommer att gå förlorade under träning. Tabell ett av den medföljande PDF-filen har en detaljerad guide över de optimala procentandelarna in vitro-konfluens för injektion av flera cellinjer.

Tre dagar före injektionen, korsa zebrafisken i önskad bakgrund. 24 timmar före injektion. Rengör zebrafiskembryonplattorna.

Kassera alla döda och icke-utvecklade embryon och uppdatera E3 medium. I cellkulturrummet kasserar du cellkulturmediet. Tvätta en gång med PBS 1X för att ta bort de döda cellerna och tillsätt färskt medium.

Förbered verktygen för injektionsproceduren, såsom mikroinjektionsnålar, agarosaplattor och hårnålar för att justera embryona för injektion. För tallriksberedningen, häll ett lager upplöst 2% agarose i locket på en ren Petri-skål. Låt det polymerisera och med hjälp av en linjal, gör tre till fyra raka agarosalinjer för embryots inriktning.

Injektionsdag. Separera de kläckta embryona från ouppnäckta ägg. Att lägga till Pronase till embryomediet i detta skede kan öka kläckningen.

Placera embryona i inkubatorn vid 28 grader Celsius tills de injektionsstället. Cellmärkning för injektion. Om du vill hjälpa till att upprätta en reproducerbar cellmärkningsteknik kontrollerar du tabellerna ett och två i det skriftliga protokollet för en sammanställning av en lista över cellinjer och flera märkningslösningar.

Ta bort cellkulturmediet och tvätta kolven två gånger med PBS 1X. Märk cellerna med ett lipofila färgämne, undvik exponering för ljus och inkubera kolven vid 37 grader. Du kan också välja att märka cellerna i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör vid lossning.

Ta bort cellmärkningslösningen och tvätta cellerna med PBS 1X för att ta ut överskottsfärgen. Tillsätt motsvarande lösgöringsmedel och inkubera cellerna vid 37 grader Celsius. Underlätta lossningsprocessen genom att borsta kolven med en steril cellskrapa och samla cellerna med en serologisk pipett.

Överför cellerna till 1,5 ml mikrocentrifugrör och centrifug. Kassera supernatant och suspendera pelleten igen med cellkulturmedium. Kvantifiera cellens livskraft med hjälp av en Neubauer-kammare med trypanblå uteslutning eller annan valmetod.

Centrifug och suspendera cellerna i injektionsmediet igen. De rekommenderade koncentrationerna av celler i medium finns i tabell ett av manuskriptet. Från och med nu måste cellerna hållas på is.

Injektionsprocedurer. Bedöva embryona i trikain 1X i 5 minuter. Överför sedan en liten mängd bedövade embryon till en agarosaplatta och rikta dem mot hjälp av en hårnålsslinga.

Se till att hålla avståndet mellan embryona. Speciellt mellan äggulan på en och huvudet på nästa. För att förhindra dödlighet, se till att de justerade embryona inte torkar ut i agarosaplattan genom att försiktigt lägga till en till tre droppar trikain 1X-lösning på plattan.

Knacka lätt på mikrocentrifugröret för att återhänga cellerna. Ladda tillbaka injektionsnålen med en cellupphängning med hjälp av en Microloader-spets och undvik luftbubblor, eftersom de kan äventyra embryonas integritet. Öppna lufttrycksventilen, sätt upp mikroinjektorn och placera försiktigt mikroinjektionsnålen i hållaren.

Skär mikroinjektionsnålen nära spetsen. Genomborra försiktigt embryots äggula, sänk nålens vinkel och tryck försiktigt tills nålens spets når det perivitellin utrymmet. När spetsen är i perivitellinutrymmet, injicera cellerna.

Försök att injicera en volym celler som liknar storleken på embryots öga, och så långt som möjligt från hjärtat för att förhindra hjärtödem. Justera mikroinjektortrycket om det behövs. Överför de injicerade embryona till en ren Petri-maträtt med trikain 1X-lösning och låt dem vila i fem till tio minuter.

Detta kommer att ge såret tid att stänga. Ta bort trikain 1X-lösningen och tillsätt färskt E3-medium. Inkubera sedan embryona vid 34 grader Celsius.

Denna temperatur kommer att möjliggöra överlevnad av både zebrafiskembryon och de mänskliga tumörcellerna. Metastaserad analys. Om du vill studera celllinjernas metastaserande potential, vid ungefär en timme efter injektionen, screena de injicerade embryona på ett fluorescensstereomikroskop och sortera dem i två grupper beroende på frånvaron eller närvaron av cancerceller i omlopp.

En dag efter injektionen. På ett fluorescensstereomikroskop, analysera noggrant varje embryo och välj de med korrekt injicerade tumörer. Sortera de valda xenografterna efter tumörstorleken.

Använd ögats storlek för jämförelse. Kassera embryon med onormal morfologi, hjärt- eller äggulaödem, xenografter med mycket få cancerceller eller de med cancerceller endast inuti äggulan. Distribuera xenografts enligt önskad experimentell layout och starta läkemedelsanalysen.

Byt ut drogerna och E3 medium dagligen. Inkubera xenografterna och behåll temperaturen på 34 grader Celsius till slutet av analysen. Fyra dagar efter injektionen.

På den sista dagen av analysen, bedöva xenografts med tricaine 1X lösning och försiktigt justera dem på agarplattan. Kassera döda eller svullna xenografter. Dessa xenografts är inte ansedda för engraftment kvantifiering.

På ett fluorescens stereomikroskop, noggrant analysera varje xenograft och bedöma frånvaron eller närvaron av tumörer i perivitelline utrymmet. Enligt den experimentella inställningen, välj xenografts av intresse och avliva dem med tricaine 25X. Fixa dem i 4%formaldehyd i minst 4 timmar vid rumstemperatur för att fortsätta med immunostaining.

Annars, förvara över natten vid fyra grader Celsius och nästa dag, ersätt formaldehyd med 100% metanol. Xenografts fasta i 100% metanol kan lagras vid 20 grader på obestämd tid. Hela fästet immunostaining för confocal imaging.

Hela mount immunofluorescens tekniken tar tre dagar, uppdelad enligt följande. Den första dagen är för permeabilisering av xenografts och primära antikropp inkubation. Den andra dagen, för tvättning och sekundär antikroppsinkubation.

Och den tredje dagen, för tvätt, fixering av xenografter och lagring i monteringsmediet. Mer information om denna procedur finns i den medföljande PDF-filen. Montering av xenografter.

Försegla kanterna på ett lockskvitto med petroleumgel eller silikonfett, så att monteringsmediet inte läcker. Använd en Pasteur-pipett och överför xenografts till täckspingen. Rikta försiktigt in dem mot en hårnål.

Tillsätt monteringsmediet till en annan täcksnederett. Sammanfoga försiktigt båda täckslipsarna och placera dem ovanpå en mikroskopbild för att möjliggöra enklare manipulering. Konfokal avbildning.

En apochromatic 25X nedsänkning mållins med vattenkorrigering är optimal för bildframställning tumörer med en enda cell upplösning. Hämta proverna med hjälp av Z-Stack-funktionen med ett intervall på fem mikron mellan varje skiva. Öppna rådata i Fiji-programvaran.

Välj tre representativa segment av tumören uppifrån, mitten och botten, per z-stack, per xenograft. Öppna Cell Counter-plugin från Fiji-programvaran. Klicka på Initiera i verktyget Cellräknare, välj en räknartyp och klicka på bilden för att starta inventeringsläget manuellt.

För varje klick frågar räknaren hur många celler som räknas. För att få det totala antalet celler i tumören, använd följande formel. För att bedöma totala tal eller procentandel av markörer, till exempel immunceller, mitotiska siffror, aktiverade caspase, bland andra, kvantifiera manuellt de celler som är positiva till den specifika märkningen, markören eller transgenen av intresse längs alla segment i z-stacken med Cell Counter plugin.

Var medveten om att vissa celler kommer att placeras mellan två segment. Gå fram och tillbaka i z-stacken för att se till att ingen cell räknas två gånger. Representativa resultat.

HCT 116 kolorektal cancer cellinje xenografts genererades som beskrivs i protokollet. Xenografts distribuerades slumpmässigt i icke-behandlade kontroller och FOLFIRI kemoterapi. Immunofluorescens utfördes för att upptäcka apoptotiska celler, med hjälp av anti-cleaved caspase-3 antikroppar och DAPI för nukleära motständer.

Kvantifiering av mitotiska index, apoptos och tumör storlek, visade att FOLFIRI inducerar en betydande minskning av mitos och en betydande induktion av apoptos, åtföljd av en 54%minskning av tumör storlek. Dessa funktioner är användbara i fenotypiska läkemedelsskärmar med hög genomströmning, samt för att testa cellens inneboende och fysiologiska effekter av flera cancerbehandlingar på kort tid. En annan stor fördel med zebrafiskens xenograftmodell är att det är möjligt att studera interaktionerna mellan olika tumörceller och analysera hur varje typ av cell kan påverka den andras beteende.

Olika mänskliga cancerceller, olika kloner från samma tumör, eller från olika tumörer, kan injiceras samtidigt. I detta exempel var två kolorektal cancer cellinjer som härrör från samma patient märkta med olika lipofila färgämnen och blandas i ett förhållande av en-till-en för injektion. Vi hoppas att detta protokoll kan hjälpa forskare att bli verkliga experter på att generera zebrafisk xenografts.

Det är inte lätt. Du måste öva, öva. Ge inte upp.

Jag är säker på att du kommer dit. Lycka till.