5.0K Views
•
13:01 min
•
June 10th, 2021
DOI :
June 10th, 2021
•0:00
Introduction
0:56
Protocol: Configuring gP2S
1:39
Results: Registering cryoEM Experiments in a Configured Instance of gP2S
12:27
Conclusion
Transcript
Hvis du vil logge på gP2S, skal du indtaste dit brugernavn og din adgangskode. I venstre side kan du se navigationslinjen, der består af en projektvælger og et sæt navigationselementer, der viser de eksperimentelle enhedstyper i CryoEMEM-arbejdsprocessen, prøver, der består af proteiner eller ligands eller kombination af disse to, gitre, mikroskopisessioner, behandlingssessioner, kort og modeller. Det sidste element på navigationslinjen er et link til afsnittet med indstillinger i programmet.
Her vil du være i stand til at tilføje en række objekter, der giver dig mulighed for at optage eksperimenter i gP2S. Hvis du udfylder den, får du oplysninger om, hvordan forskellige rullelister kan bruges i hele systemet. Det medfølgende manuskript indeholder detaljerede oplysninger om, hvordan du installerer og konfigurerer gP2S, så det kan bruges til at logge eksperimenter.
I denne video illustrerer vi kun et af konfigurationstrinnene, hvordan man registrerer en kryogen prøveholder og derefter illustrerer mere detaljeret, hvordan brugere kan registrere eksperimenter i gP2S. Prøveholdere kan konfigureres, når mikroskoper er blevet registreret, ved at navigere til prøveholdersektionen. Når du registrerer en ny prøveholder, skal du angive, hvilke af de konfigurerede mikroskoper den kan bruges sammen med, og om den kan bruges til kryoprøver.
GP2S-applikationen er projektorienteret. Det betyder, at arbejdsgangsobjektet kun kan oprettes i forbindelse med et projekt. Det relevante projekt skal vælges fra en rulleliste.
Når du vælger et projekt, vises antallet af objekter af hver type, der er tilknyttet dette projekt, i arbejdsgangssektionen. Du kan se, at der i dette særlige tilfælde er registreret 89 prøver, 203 gitre, 80 mikroskopisessioner, fem behandlingssessioner, syv kort og to modeller. Når du klikker på en af arbejdsgangsobjekttyperne, f.eks.
Denne liste består af en etiket. Der kan også være et flag, som i dette tilfælde, for at vise, om det var en kryo eller negativ pletmikroskopisession og op til seks nøglemetadatafelter. I tilfælde af mikroskopisession kan du se, hvilket gitter der er afbildet, antallet af billeder, der blev indsamlet, start- og slutdatotiderne for sessionen, og hvilket mikroskop og detektor der blev brugt.
Hvis du vælger et af de viste enheder, åbnes en detaljeside, der viser alle de oplysninger, der er tilgængelige for dette element, hvilket er meget i tilfælde af mikroskopisessioner. Under mikroskopioplysningerne kan du se en oversigtsliste over alle overordnede enheder, f.eks. Dette giver mulighed for meget hurtig navigation gennem afstamning af den viste enhed.
Lad os hoppe til modeller for bedre at visualisere dette. Endelig kan alle enheder i gP2S kommenteres ved at vælge kommentarer. Som du kan se for denne særlige model, findes der allerede en kommentar.
Hvis du klikker på det viser, hvem og hvornår oprettet det. Du kan tilføje endnu en kommentar ved at indtaste en fri tekst og eventuelt vedhæfte en eller flere filer. Nu hvor vi har turneret i hoveddelen af applikationen, vil vi demonstrere, hvordan man registrerer eksperimentelle enheder under et CryoEM-eksperiment.
I det første trin i arbejdsprocessen bliver du bedt om at beskrive eksemplet. For at gøre dette skal du først definere mindst en komponent, protein eller ligand. Tilføjelse af et nyt protein kræver kun en proteinetiket, men for at hjælpe med bedre at beskrive proteinet kan du også tilføje en rensningsidentifikator.
Dette felt kan indeholde et lotbatchnummer eller fungere som et sted for en stregkodeetiket. Hvis gP2S er blevet tilpasset til at integrere med et proteinregistreringssystem, kan PUR ID valideres automatisk og bruges til at hente og vise detaljerede oplysninger om dette parti protein. For ligands er en etiket og lagerkoncentrationen obligatoriske, og to andre felter er valgfrie, koncept- og batchparti-id'et.
En prøve defineres ved enhver kombination af proteiner og ligands og deres endelige koncentrationer. I vores tilfælde vil vi oprette en prøve, der indeholder et protein, der tidligere er registreret i gP2S. Komponenter er nemme at finde takket være den søgbare rulleliste.
Hvis du ikke kan finde komponenten, kan du oprette en fra bunden i dette trin. Du kan også angive andre eksperimentelle oplysninger om din prøve, f.eks. Når din prøve er klar, og du laver gitre, skal du navigere til gitre og oprette en ny cryo.
Vælg gittertypen og den anvendte overfladebehandlingsprotokol, f.eks. Angiv derefter, om du forbereder et kryo- eller et negativt pletgitter, og vælg en af de forudkonfigurerede vitrifikationsprotokoller på rullelisten. Vælg derefter det eksempel, du har anvendt på gitteret, på rullelisten.
Hvis du vælger at fortynde eller koncentrere den valgte prøve, skal du bruge til/fra-knappen og angive den relevante fortyndings- eller koncentrationsfaktor. Du skal også angive den diskenhed, der anvendes på gitteret, og eventuelt registrere en inkubationstid. Endelig skal du definere gitterlagringsplaceringen.
Hvis du vil, kan du ændre standardetiketten og gemme gitteret. Når du har registreret dine gitre, vil du være i stand til at registrere dataindsamlingseksperimenter ved at oprette en mikroskopisession. Formularen består af fire sektioner:grundlæggende oplysninger, mikroskopindstillinger, eksponeringsindstillinger og mikroskopkontrol.
Den første sektion indeholder grundlæggende oplysninger, en etiket, ændre standardværdien, hvis du vil. Bemærk, at systemet automatisk udfylder startdatoen og -klokkeslættet. Slutdato og -klokkeslæt er valgfrit, fordi du sandsynligvis registrerer mikroskopisessionen, mens dit eksperiment stadig er i gang.
Hvis du kender slutdatoen og -klokkeslættet, kan du skrive den manuelt eller bruge knappen Nu til at angive den aktuelle. Vælg derefter, hvilket gitter der blev afbildet, og hvilket mikroskop der blev brugt. Som standard er det mikroskop, der senest er brugt i det aktuelle projekt, forudvalgt.
Vælg en detektor og eventuelt, hvor mange billeder der blev indsamlet. Tredje afsnit af mikroskopisessionen indeholder oplysninger om eksponeringsindstillinger. I dette afsnit registreres følgende metadata:forstørrelse, staffagestørrelse, diameter af belyst område, eksponeringshastighed, eksponeringsvarighed og antal rammer.
Du bør angive, om nanoprobe, tælletilstand, dosisfraktionering og superopløsning blev brugt. De er kun aktiveret, hvis det valgte mikroskop og detektor har disse funktioner. Når du har indtastet en eventuel pixelplaceringsfaktor, beregnes en række eksperimentelt vigtige parametre i farten og vises.
Billedbehandlingsarbejde registreres i en behandlingssession. Hver behandlingssession er relateret til mindst én mikroskopisession, som du vælger på en rulleliste. Du kan tilføje flere mikroskopisessioner, hvis du fletter data fra flere sessioner under behandlingen.
Du skal også angive, hvilke softwarepakker der blev brugt, ved at vælge softwareetiketten og dens version. Der er også plads til nogle relaterede noter. Du er nødt til at give antallet af mikrografer og plukkede partikler.
Du kan også registrere navnet på den mappe eller den fulde sti, hvor du udførte behandlingen. Når en eller flere tredimensionelle rekonstruktioner er opnået, kan kortene deponeres i gP2S. Hvert kort er knyttet til en behandlingssession og består af den faktiske tilknytningsfil.
gP2S tillader alle filtyper. Indtast vigtige metadata såsom størrelsen af pixlen, anbefales, er en kontur niveau for overflade rendering, hvad symmetri du anvendt, antallet af billeder, der anvendes til at oprette kortet, og den anslåede opløsning i sine bedste dele, den gennemsnitlige globale opløsning, og opløsning i værste dele. Som i tilfældet kontrollerer valideringsregler i mange dele af gP2S dit input for åbenlyse fejl.
Kort kan være knyttet til hinanden ved hjælp af forskellige typer relationer. Når du registrerer en sådan tilknytning, skal du vælge relationstypen og det relaterede kort. Når en atommodel er opnået, kan den deponeres i gP2S.
Tilføj en modelfil, opløsning og kortet eller en liste over kort, som modellen er afledt fra. Derudover er det muligt at angive, at en model er en raffineret version af en tidligere deponeret model. Rediger etiketten, og gem posten.
Hvis du samarbejder med andre forskere, der ikke har adgang til applikationen, kan det være nødvendigt at generere oversigtsdokumenter, som du derefter kan dele. Til dette formål indeholder gP2S en rapportfunktionalitet. Der dette genereres en PDF-fil, der kan udskrives, og som indeholder alle metadata, der beskriver objektet og hvert af dets overordnede objekter, herunder alle kommentarer.
Denne funktion er især værdifuld efter modelaflejring, da alle data og metadata, der sporer afstamningen af den endelige atommodel helt tilbage til specifikke protein- og små molekyle ligandpartier via mikroskopisessioner og gitre, er tilgængelige i det enkelte dokument. Men en PDF kan genereres fra enhver detaljevisningsside. Som du kan se, giver gP2S dig mulighed for at spore forskellige enheder, der er velstrukturerede og nemme at navigere til.
Som tidligere vist bidrager datavalidering ved registrering af bestemte objekter til metadata af højere kvalitet, end det kan lade sig gøre med klassiske regneark eller notesbøger. Tak, fordi du kiggede. Vi håber, at denne video vil opfordre dig til at prøve gP2S som laboratoriet information management system til din CryoEM lab.
gP2S er en webapplikation til sporing af kryoEM-eksperimenter. Dens vigtigste funktioner er beskrevet, ligesom de trin, der kræves for at installere og konfigurere applikationen. Når det er konfigureret, giver applikationen en mulighed for nøjagtigt at registrere metadata, der er forbundet med negative plet- og kryoEM-eksperimenter.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved