5.0K Views
•
13:01 min
•
June 10th, 2021
DOI :
June 10th, 2021
•0:00
Introduction
0:56
Protocol: Configuring gP2S
1:39
Results: Registering cryoEM Experiments in a Configured Instance of gP2S
12:27
Conclusion
Transcript
For å logge inn på gP2S, skriv inn brukernavn og passord. På venstre side kan du se navigasjonsfeltet som består av en prosjektvelger og et sett med navigasjonselementer som viser de eksperimentelle enhetstypene i CryoEMEM-arbeidsflyten, prøver som består av proteiner eller ligander eller kombinasjoner av disse to rutenettene, mikroskopiøktene, prosesseringsøktene, kartene og modellene. Det siste elementet i navigasjonsfeltet er en kobling til innstillingsdelen i programmet.
Her vil du kunne legge til en rekke enheter som lar deg spille inn eksperimenter i gP2S. Å fylle den ut vil gi informasjon for forskjellige rullegardinlister som skal brukes i hele systemet. Det medfølgende manuskriptet inneholder detaljert informasjon om hvordan du installerer og konfigurerer gP2S slik at det kan brukes til å logge eksperimenter.
I denne videoen illustrerer vi bare ett av konfigurasjonstrinnene, hvordan du registrerer en kryogen prøveholder, og deretter illustrerer du mer detaljert hvordan brukere kan registrere eksperimenter i gP2S. Prøveholdere kan konfigureres når mikroskoper er registrert ved å navigere til prøveholderdelen. Når du registrerer en ny prøveholder, må du angi hvilke av de konfigurerte mikroskopene den kan brukes med, og om den kan brukes til å kryoprøver.
gP2S-applikasjonen er prosjektorientert. Det betyr at arbeidsflytenheten bare kan opprettes i konteksten til et prosjekt. Det aktuelle prosjektet må velges fra en rullegardinliste.
Når du velger et prosjekt, vises antall enheter av hver type som er knyttet til dette prosjektet, i arbeidsflytdelen. Du kan se at i dette tilfellet er det registrert 89 prøver, 203 rutenett, 80 mikroskopiøkter, fem prosesseringsøkter, syv kart og to modeller. Når du klikker en av enhetstypene for arbeidsflyt, for eksempel mikroskopiøkter, vises en liste over disse enhetene.
Denne listen består av en etikett. Det kan også være et flagg, som i dette tilfellet, for å vise om det var en kryo eller negativ flekkmikroskopiøkt, og opptil seks viktige metadatafelt. Ved mikroskopiøkt kan du se hvilket rutenett som er avbildet, antall bilder som ble samlet inn, start- og sluttdatoidene for økten og hvilket mikroskop og detektor som ble brukt.
Hvis du velger en av de oppførte enhetene, åpnes en detaljside som viser all informasjonen som er tilgjengelig for dette elementet, som i tilfelle mikroskopiøktene er mye. Under mikroskopidetaljene kan du se en sammendragsliste over alle overordnede enheter, for eksempel rutenett og prøver. Dette gir mulighet for veldig rask navigering gjennom avgrensning av den viste enheten.
La oss hoppe til modeller for å visualisere dette bedre. Til slutt kan alle enheter i gP2S kommenteres ved å velge kommentarer. Som du kan se for denne modellen, finnes det allerede én kommentar.
Ved å klikke på den viser hvem og når du opprettet den. Du kan legge til en annen kommentar ved å skrive inn en fritekst og eventuelt legge ved én eller flere filer. Nå som vi har turnert hoveddelen av søknaden, vil vi demonstrere hvordan du registrerer eksperimentelle enheter under et CryoEM-eksperiment.
I det første trinnet i arbeidsflyten blir du bedt om å beskrive eksemplet. For å gjøre det, må du først definere minst en komponent, protein eller ligand. Å legge til et nytt protein krever bare en proteinetikett, men for å hjelpe til med å bedre beskrive proteinet, kan du også legge til en renseidentifikator.
Dette feltet kan inneholde et partipartinummer eller fungere som et sted for en strekkodeetikett. Hvis gP2S er tilpasset for å integreres med et proteinregistreringssystem, kan PUR-ID-en valideres automatisk og brukes til å hente og vise detaljert informasjon om dette proteinet. For ligander er en etikett og lagerkonsentrasjonen obligatorisk, og to andre felt er valgfrie, konsept- og partipartiidentifikatorer.
En prøve defineres av en hvilken som helst kombinasjon av proteiner og ligander og deres endelige konsentrasjoner. I vårt tilfelle vil vi lage en prøve som inneholder ett protein som tidligere er registrert i gP2S. Komponenter er enkle å finne takket være den søkbare rullegardinmenyen.
Hvis du ikke finner komponenten, kan du opprette en fra grunnen av på dette trinnet. Du kan også angi andre eksperimentelle detaljer for prøven, for eksempel inkubasjonstid og -temperatur, buffer og en protokollbeskrivelse for fri tekst. Når eksemplet er klart og du lager rutenett, navigerer du til rutenett og oppretter en ny kryo.
Velg rutenetttypen og overflatebehandlingsprotokollen som brukes, for eksempel en glødutladningsprotokoll. Angi deretter om du forbereder en kryo eller et negativt flekkrutenett, og velg en av de forhåndskonfigurerte vitrifiseringsprotokollene fra rullegardinlisten. Deretter velger du eksemplet du brukte på rutenettet, fra rullegardinlisten.
Hvis du velger å fortynne eller konsentrere den valgte prøven, bruker du veksleknappen og angir den relevante fortynnings- eller konsentrasjonsfaktoren. Du må også angi volumet som brukes på rutenettet, og eventuelt registrere en inkubasjonstid. Til slutt må du definere lagringsstedet for rutenettet.
Hvis du vil, kan du endre standardetiketten og lagre rutenettet. Når du har registrert rutenettene dine, vil du kunne registrere datainnsamlingseksperimenter ved å opprette en mikroskopiøkt. Skjemaet består av fire seksjoner: grunnleggende informasjon, mikroskopinnstillinger, eksponeringsinnstillinger og mikroskopkontroll.
Den første inndelingen inneholder grunnleggende informasjon, en etikett, endrer standardverdien hvis du vil. Legg merke til at systemet automatisk fyller ut startdatoen og -klokkeslettet. Etterbehandlingsdato og -klokkeslett er valgfritt fordi du sannsynligvis vil registrere mikroskopiøkten mens eksperimentet fortsatt pågår.
Hvis du kjenner sluttdatoen og -klokkeslettet, kan du skrive det inn manuelt eller bruke nå -knappen til å angi den gjeldende. Velg deretter hvilket rutenett som ble avbildet og hvilket mikroskop som ble brukt. Som standard er mikroskopet som sist ble brukt i det gjeldende prosjektet, forhåndsvalgt.
Velg en detektor og eventuelt hvor mange bilder som ble samlet inn. Den tredje delen av mikroskopiøkten inneholder informasjon om eksponeringsinnstillinger. I denne delen registreres følgende metadata: forstørrelse, spotstørrelse, diameter på opplyst område, eksponeringsfrekvens, eksponeringsvarighet og antall bilder.
Du bør angi om nanoprobe, tellemodus, dosefraksjonering og superoppløsning ble brukt. De aktiveres bare hvis det valgte mikroskopet og detektoren har disse funksjonene. Etter å ha gått inn i pikselbinningsfaktoren, om noen, beregnes en rekke eksperimentelt viktige parametere mens du er på farten og vises.
Bildebehandlingsarbeid registreres i en behandlingsøkt. Hver behandlingsøkt er relatert til minst én mikroskopiøkt, som du velger fra en rullegardinliste. Du kan legge til flere mikroskopiøkter hvis du slår sammen data fra flere økter under behandlingen.
Du må også angi hvilke programvarepakker som ble brukt ved å velge programvareetiketten og versjonen. Det er også et sted for noen relaterte notater. Du må oppgi antall mikrografer og plukkede partikler.
Du kan også registrere navnet på katalogen eller den fullstendige banen der du utførte behandlingen. Når en eller flere tredimensjonale rekonstruksjoner er oppnådd, kan kartene deponeres i gP2S. Hvert kart er knyttet til en behandlingsøkt og består av den faktiske kartfilen.
gP2S tillater alle filtyper. Skriv inn viktige metadata, for eksempel størrelsen på bildepunktet, anbefalt er et konturnivå for overflategjengivelse, hvilken symmetri du har brukt, antall bilder som brukes til å opprette kartet, og den beregnede oppløsningen i de beste delene, den gjennomsnittlige globale oppløsningen og oppløsningen i de verste delene. Som i tilfelle, i mange deler av gP2S, kontrollerer valideringsregler dine innspill for åpenbare feil.
Kart kan knyttes til hverandre ved hjelp av ulike typer relasjoner. Når du registrerer en slik tilknytning, må du velge relasjonstype og relatert tilknytning. Når en atommodell er oppnådd, kan den deponeres i gP2S.
Legg til en modellfil, oppløsning og kartet eller en liste over kart som modellen ble avledet fra. I tillegg er det mulig å indikere at en modell er en raffinert versjon av en tidligere avsatt modell. Endre etiketten, og lagre posten.
Hvis du samarbeider med andre forskere som ikke har tilgang til søknaden, kan det være nødvendig å generere sammendragsdokumenter som du deretter kan dele. Til dette formålet gir gP2S en rapportfunksjonalitet. Dette genererer en utskrivbar PDF-fil som inneholder alle metadata som beskriver enheten og hver av de overordnede enhetene, inkludert alle kommentarer.
Denne funksjonen er spesielt verdifull etter modellavsetning, siden alle data og metadata som sporer avstamningslinjen til den endelige atommodellen helt tilbake til spesifikke protein- og små molekylligandtomter via mikroskopiøkter og rutenett er tilgjengelige i det ene dokumentet. Men en PDF-fil kan genereres fra en hvilken som helst detaljvisningsside. Som du kan se, lar gP2S deg spore forskjellige enheter som er godt strukturerte og enkle å navigere til.
Som vist tidligere, bidrar datavalidering ved registrering av bestemte enheter til metadata av høyere kvalitet enn det som kan oppnås med klassiske regneark eller notatblokker. Takk for at du så på. Vi håper denne videoen vil oppmuntre deg til å prøve gP2S som laboratorieinformasjonsstyringssystem for CryoEM-laboratoriet ditt.
gP2S er et webprogram for sporing av cryoEM-eksperimenter. Hovedfunksjonene er beskrevet, og det samme er trinnene som kreves for å installere og konfigurere applikasjonen. Når den er konfigurert, lar applikasjonen en nøyaktig registrere metadata knyttet til negative flekk- og kryoEM-eksperimenter.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved