Detta protokoll kan användas för detektion och karakterisering av proteinkonformationsdynamik, som är avgörande för att förstå en stor mängd cellulära processer. Jämfört med andra metoder kräver denna metod inte specialiserade provberedningssteg och ger omfattande karakterisering av kinetik, termodynamik och strukturella aspekter av konfirmativ jämvikt. CPMG avslappning dispersion kan tillämpas mer allmänt för karakterisering av konfirmationsdynamik i nukleinsyror och andra biomolekyler, liksom för karakterisering av ligand nanopartiklar interaktioner.
Vårt protokoll riktar sig till första gången CPMG-användare. Så det är en bra utgångspunkt. Vi förväntar oss dock att användarna ska känna till de grundläggande stegen för att köra konventionella NMR-experiment.
För att ställa in ett NMR-experiment för första gången, ladda först ner och packa upp dessa kompletterande filer. Kopiera bitarna. vv och trosy_15N_CPMG.
vv-filer i pulsprogrammappen till pulsprogramkatalogen. Öppna förvärvsprogramvaran och använd kommandot EDC för att kopiera ett tidigare kört vätekväve 15 HSQC-experiment till ett nytt experiment. Använd kommandot pulseprogram för att läsa trosy_15N_CPMG.
vv pulse program fil i det nyskapade experimentet. Använd sedan anvisningarna från slutet av pulsprogramfilen för att ställa in CPMG-experimentet. För att ställa in ett rutinmässigt NMR-experiment, introducera provet till magneten och utför alla grundläggande NMR-förvärvssteg.
Ställ in P1 på väte hårda 90 graders pulser och P7 till varaktigheten kväve 15 hårda 90 graders pulser. I förvärvsfönstret ställer du in centrum och spektralbredden för väte- och kvävedimensionerna 15 dimensioner. Ställ in avslappningsfördröjningen på 0,7 T2 och använd kommandot VC-lista för att skapa en lista med heltalsnummer som motsvarar N.Efter att ha bekräftat att varje post i listan motsvarar ett annat CPMG-fält enligt CPMG arkiverat lika med gånger 4N dividerat med D30, kontrollera att det första numret i listan är noll.
Ange L8 till antalet poster i VC-listan, L3 till antalet verkliga punkter för den indirekta dimensionen och 1TD till L8 gånger L3 gånger två. För att optimera vattendämpningen ställer du in mottagarens förstärkning på en och skriver EDC-drag för att öppna pulsprogramfilen. På rad 91, ta bort semikolonet före goto 999 och spara filen.
Använd GS-kommandot och justera SPDB0-parametrarna för att minimera intensiteten hos FID-signalen. När signalintensiteten har ändrats, återinför ett semikolon på rad 91 i pulsprogramfilen och spara filen. Om du vill optimera SPDB11 ställer du in mottagarens förstärkning på en och typen EDC drar för att öppna pulsprogramfilen.
På rad 168, ta bort semikolonet före goto 999 och spara filen. Använd GS-kommandot och justera SPDB11-parametrarna för att minimera intensiteten hos FID-signalen. När signalintensiteten har ändrats, återinför semikolonet på rad 168 och spara filen.
Om du vill optimera SPDB2 ställer du in mottagarens förstärkning på en och anger EDC pull för att öppna pulsprogramfilen. På rad 179, ta bort semikolonet före goto 999 och spara filen. Använd GS-kommandot och justera SPDB2-parametrarna för att minimera intensiteten hos FID-signalen.
När signalintensiteten har ändrats, sätt tillbaka semikolonet på rad 179 i pulsprogramfilen och spara filen. För att optimera PLDB2 ställer du in mottagarens förstärkning på en och anger EDC-pull för att öppna pulsprogramfilen. På rad 184, ta bort semikolonet före goto 999 och spara filen.
Använd GS-kommandot och justera PLDB2-parametrarna för att minimera intensiteten hos FID-signalen. När signalintensiteten har ändrats, återinför semikolonet på rad 184 i pulsprogramfilen och spara filen. Kör RGA-kommandot för att optimera mottagarens förstärkning.
Kör sedan ZG-kommandot för att starta experimentet. I denna siffra kan resultaten av de avslappningsdispersionsprofiler som förvärvats för varje topp i vätekväve 15 Trosy-spektrumet observeras. Från de förvärvade avslappningsspridningsprofilerna är det möjligt att uppskatta utbytesbidraget till kväve 15 tvärgående avslappning av varje ryggradS-AMI-grupp.
Genom att plotta den tvärgående avslappningen på 3D-strukturen hos det protein som under utredning är det möjligt att identifiera de strukturella regioner som genomgår konfirmationsutbyte på mikrosekunds millisekundens tidsskala. Modellering av avslappningsspridningskurvorna med carver-Richards-ekvationerna returnerar de termodynamiska och kinetiska parametrarna på utbytesprocessen, såsom de fraktionerade populationerna i tillstånden i jämvikt och växelkursen mellan dessa stater. Temperaturberoendet av dessa termodynamiska och kinetiska parametrar kan sedan modelleras med hjälp av ekvationerna van't Hoff respektive I-ring för att få detaljerad information om energierna i konfirmationsutbytet.
Det är viktigt att noggrant optimera alla förvärvsparametrar, särskilt P7. Det är också viktigt att producera mycket rena och homogena prover för att undvika falska dispersioner. De kinetiska, termodynamiska och kemiska chipparametrarna som erhålls med hjälp av detta protokoll kan användas för att härleda energisk och strukturell information om de arter som genomgår konfirmationsutbytet. Karakterisering av proteinbekräftelsedynamiken som erhålls med CPMG-metoder ger viktig information för att förstå signalering och enzymatisk aktivitet, liksom nya perspektiv för läkemedelsdesign.