Name: neutron spin echo spectroscopy as a unique probe for lipid membrane dynamics and membrane-protein interactions
Uploaded: 2021-05-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions at JoVE.com

ر. أشقر يشكر م. ناغاو، ل. ر. Stingaciu ، وP. Zolnierczuk لكثير من المناقشات المفيدة ومساعدتهم المتكررة مع التجارب NSE على خطوط الحزم الخاصة بهم. يعترف المؤلفون باستخدام مطياف صدى الدوران النيوتروني في NIST و ORNL. ويدعم مطياف NSE في NIST من قبل مركز تشتت النيوترونات عالية الدقة، وهي شراكة بين المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا والمؤسسة الوطنية للعلوم بموجب الاتفاق رقم . DMR-1508249. ويدعم مطياف NSE في مصدر النيوترون Spallation ORNL من قبل شعبة مرافق المستخدمين العلميين، مكتب علوم الطاقة الأساسية، وزارة الطاقة الأمريكية. يتم إدارة مختبر أوك ريدج الوطني من قبل UT-Battelle، ذ.م.م بموجب عقد وزارة الكهرباء الأمريكية رقم دي-AC05-00OR22725.

1. مخطط الديوتريشن المطلوب للتجربة
<ol><li>لقياسات تقلبات الانحناء، قم بإجراء ليبوسومات بروتيات بالكامل في D2O (D 99.9٪) أو D2O-buffer (على سبيل المثال، مخزن الفوسفات المؤقت المعد مع D2O بدلا من H2O). استخدام DMPC بروتيات بالكامل (C36H72NO8P) و DSPC (C44H88NO8P...

NSE هي تقنية قوية وفريدة من نوعها في قياس الديناميات التنظيرية للأغشية الدهنية في ظل ظروف مختلفة. يعتمد الاستخدام الفعال ل NSE على جودة العينة والتباين النيوتروني ونطاق الديناميكيات التي يمكن الوصول إليها والتي يمكن بحثها لعينة معينة. وبالتالي، هناك العديد من الخطوات الحاسمة المطلوبة لإجر?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others &#8212;&#160;the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 &#215; 10-6&#160;&#197;-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others &#8212;&#160;the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" /> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC&#160;and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD&#160;~ 2&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" /> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC&#160;and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD&#160;~ 0&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted&#160;from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) &#197;-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" />, where&#160;Icoh and Iinc&#160;are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 &#215; 10-6 &#197;-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 &#215; 10-6 &#197;-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) &#197;-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" />, where&#160;Icoh and Iinc&#160;are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0&#160;&#215; 10-6 &#197;-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 &#215; 10-6 &#197;-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4.jpg" /> 
Figure 2:&#160;Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2&#160;&#215; 10-2 &#197;-2)&#160;and tail region (~4.5 &#215; 10-6 &#197;-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5.jpg" /> 
Figure 2:&#160;Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region&#160;(~0&#160;&#215; 10-2 &#197;-2)&#160;and headgroup&#160;region (~4.5 &#215; 10-6 &#197;-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

تطور فهم أغشية الخلايا ووظيفتها بشكل ملحوظ على مدى العقود القليلة الماضية. وقد تحولت النظرة السابقة لأغشية الخلايا كثنائيات الدهون السلبية التي تحدد حدود الخلايا وبروتينات غشاء المنزل1 تدريجيا إلى نموذج ديناميكي تلعب فيه الطبقات ثنائية الدهون دورا مهما في تنظيم العمليات البيولوجية الحيوية ، بما في ذلك الإشارات الخلوية والتبادل الجزيئي ووظيفة البروتين - على سبيل المثاللا الحصر2و3و4و5و6. هذا الإدراك بأن أغشية الخلايا ديناميكية للغاية ، وتخضع باستمرار لإعادة العرض وإعادة التوزيع الجزيئي ، وقد حث الاستكشافات العلمية وراء هياكل التوازن للأغشية7و8و9. وبناء على ذلك، تم تطوير نهج متعددة لدراسة مختلف الأنماط الديناميكية في الأغشية الدهنية البيولوجية والحيوى. حتى الآن، ركزت غالبية هذه الدراسات في المقام الأول على نشر الحركات الجزيئية10،11،12،13 وتقلبات الشكل العياني14،15،16، مما يترك فجوة كبيرة في فهم ديناميات الأغشية المتوسطة ، أي التقلبات الجماعية لجمعيات الدهون التي تتكون من عدد قليل من 10-100s من جزيئات الدهون. تحدث هذه الديناميكيات على مقاييس طول من عشرات قليلة إلى عدد قليل من 100 Å وعلى مدى المقاييس الزمنية من ns الفرعية إلى بضع مئات من ns (انظر الشكل 1)، ويشار إليها هنا باسم جداول التنظير. هو حقا على هذا ميزان أن نشاط رئيسية أحيائية يتم في الغشاء مستوى17. وهذا يشمل الفيروسية الناشئة18، قناة gating19، والتفاعلات الغشاء البروتين20. من المهم أيضا الإشارة إلى أن مشهد الطاقة للبروتينات الغشائية21،22 يظهر أن التغيرات التوافقية في البروتينات - الضرورية لدورها التنظيمي - تحدث على مدى المقاييس الزمنية23 من تقلبات الأغشية الجماعية ، مما يؤكد كذلك على أهمية الديناميكيات التنظيرية في الوظيفة البيولوجية لأغشية الخلايا ونظائرها ذات الأغشية الحيوية20. تركز هذه الورقة على الوضعين الديناميكيين الأساسيين بالمنظار في الأغشية الدهنية ، وهما تقلبات الانحناء وتقلبات السماكة.
ويتمثل التحدي الرئيسي في التحقيق المباشر في أوضاع التقلبات هذه في صعوبة الوصول في الوقت نفسه إلى مقاييسها المكانية والزمنية باستخدام أساليب التحليل الطيفي القياسية. والتحدي الآخر هو أن تقنيات الاتصال المباشر يمكن أن تؤثر على نفس التقلبات التي يقصد بها قياس16. ومما يزيد من تفاقم هذا التعقيد التركيبي والهيكلي للأغشية البيولوجية24،25، مما يؤدي إلى ميزات غشاء غير متجانسة ، بما في ذلك تشكيل المجال الدهني26،27،28،29،30 وعدم تناسق الأغشية31،32،33- مما يتطلب تحقيقات انتقائية لفهم ديناميات ميزات الأغشية المختلفة. لحسن الحظ ، يمكن التغلب على هذه التحديات باستخدام طرق التحليل الطيفي النيوتروني غير الغازية ، مثل صدى الدوران النيوتروني (NSE) ، والتي تدخل بطبيعتها إلى الطول والمقاييس الزمنية المطلوبة ، وتمكن من إجراء دراسات حول ميزات الغشاء الانتقائي دون تغيير بيئتها الفيزيائيةالكيميائية 34. في الواقع ، على مدى السنوات القليلة الماضية تطور التحليل الطيفي NSE إلى مسبار فريد وقوي من ديناميكيات الغشاء الجماعي35. وقد أنتجت نتائج دراسات NSE على الأغشية الدهنية رؤى جديدة فيالميكانيكية 36،37 وviscoelastic38،39 خصائص الأغشية الدهنية وألقت ضوءا جديدا على دورها المحتمل في الوظيفة البيولوجية40،41.
تعتمد تقنية التحليل الطيفي NSE على تصميم أداة التداخل ، الذي اقترحه Mezei42لأول مرة ، باستخدام سلسلة من الزعانف الدوارة واللفائف المغناطيسية للتحكم في مقدمة الدوران النيوتروني أثناء اجتياز النيوترونات للجهاز. يعتمد التصميم على النسخ المتطابق المغناطيسي لعناصر المجال المغناطيسي فيما يتعلق بموضع العينة(الشكل 1A). وهذا يعني أنه في غياب تبادل الطاقة بين النيوترون والعينة ، يؤدي النيوترون نفس العدد من السبق الدوراني ، في اتجاهين متعاكسين ، في النصف الأول والثاني من الجهاز (لاحظ π الزعانف بين لفائف السبق). ونتيجة لذلك، تبقى حالة الدوران النهائية للنيوترون دون تغيير بالنسبة للدولة الأولية - وهي ظاهرة يشار إليها باسم الدوران صدى (انظر النيوترون الشفاف في الشكل 1A). ومع ذلك ، عندما يتفاعل النيوترون بنشاط مع العينة ، يعدل تبادل الطاقة عدد السبقات الدورانية في النصف الثاني من الجهاز ، مما يؤدي إلى حالة دوران نهائية مختلفة (انظر الشكل 1A). يتم الكشف عن هذا تجريبيا كخسارة في الاستقطاب ، كما سيظهر لاحقا في هذه الورقة. لمزيد من التفاصيل حول تقنية NSE ، يشار إلى القارئ إلى الأوراق الفنيةالمخصصة 42،43،44،45.
هنا، يتم تقديم وصف مبسط لتقديم تقدير تقريبي للطول والجداول الزمنية التي يمكن الوصول إليها مع NSE. يتم تحديد موازين الطول من خلال نطاق عمليات نقل الموجات القابلة للتحقيق، Q = 4π sin ο/λ، حيث 2ο هي زاوية التشتت و λ هو الطول الموجي النيوتروني. يمكن للمرء أن يرى أن يتم تعيين Q من قبل نطاق الطول الموجي ومدى دوران الذراع الثاني للمطياف (انظر الشكل 1A). نموذجي Q-rangeعلى مطياف NSE هو ~0.02-2 Å-146,47, وحتى 0.01-4 Å-1 مع الترقيات الأخيرة48,49, المقابلة لمقاييس المكانية من ~ 1-600 Å. من ناحية أخرى، يتم حساب مقياس الوقت الذي يمكن الوصول إليه من زاوية السبق الكلية (أو المرحلة) التي يكتسبها النيوترون داخل لفائف السبق المغناطيسي، ووجد أن50: <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq12v5.jpg"> . في هذا التعبير، t هو الوقت فورييه <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq13v2.jpg"> تعريفها بأنها ، حيث <img alt="Equation 50" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq50v2.jpg"> هي نسبة الدوران النيوتروني، <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg"> هو طول لفائف، <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> وقوة المجال المغناطيسي لللفائف. تجدر الإشارة إلى أن وقت فورييه هو كمية تعتمد بشكل صارم على هندسة الجهاز ، وقوة المجال المغناطيسي ، والطول الموجي النيوتروني. على سبيل المثال، باستخدام نيوترونات الطول الموجي <img alt="Equation 70" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq70v6.jpg"> = 8 Å وإعدادات الصك <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg">   = 1.2 متر و <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> = 0.4 T، يتم حساب وقت فورييه ليكون t ~ 50 ns. تجريبيا، يتم ضبطها الوقت فورييه عن طريق تغيير التيار في لفائف قبل الخراج (أي قوة المجال المغناطيسي) أو باستخدام أطوال موجية نيوترونية مختلفة، مما أدى إلى جداول زمنية NSE نموذجية من ~ 1 PS إلى 100 ns. ومع ذلك، مكنت الترقيات الأخيرة في مطياف NSE الوصول إلى أوقات فورييه أطول، ما يصل إلى ~ 400 ns على مطياف J-NSE-Phoenix في هاينز ماير-ليبنيتز Zentrum51 ومطياف SNS-NSE في مختبر أوك ريدج الوطني48، وما يصل إلى ~ 1000 ns في مطياف NSE IN15 في معهد لو لانجفين (ILL)49. 
وإلى جانب الوصول المباشر إلى طول ديناميات الأغشية ونطاقها الزمني، فإن NSE لديها القدرات الكامنة في حساسية النظائر النيوترونية52. وعلى وجه التحديد، فإن قدرة النيوترونات على التفاعل بشكل مختلف مع نظائر الهيدروجين، وهو العنصر الأكثر وفرة في النظم البيولوجية، تؤدي إلى كثافة مختلفة لطول النيوترونات المتناثرة،34 أو NSLD (أي ما يعادل المؤشر البصري للانكسار50)،عندما يتم استبدال البروتيوم بالديوتريوم. وهذا يمكن من اتباع نهج يعرف باسم التباين التبايني، والذي يستخدم عادة لتسليط الضوء على ميزات غشاء محددة أو إخفاء الآخرين - ويشار إلى السيناريو الأخير على أنه مطابقة التباين. التطبيق المتكرر للتباين / المطابقة هو استبدال الماء (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2)بالماء الثقيل أو D2O (NSLD = 6 .4 × 10-6 Å-2)لتضخيم إشارة النيوترون من الأغشية الدهنية البروتية (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). هذا النهج فعال للغاية في دراسات بنية الغشاء لأن اختراق D2O في منطقة مجموعة الرأس من الغشاء يسمح بتحديد دقيق لسماكة الغشاء (انظر الشكل 2A، اللوحة اليسرى) وموقع المجموعات الفرعية المختلفة للدهون عندما يتم تطبيق نماذج أكثر تطورا53،54. تسلط هذه الورقة الضوء على بعض الأمثلة على استخدام التباين في دراسات الديناميكيات الجماعية في الأغشية المحاكاة الحيوية وميزات الأغشية المختارة.
هنا ، تتجلى فعالية NSE في توفير رؤى فريدة في خصائص الأغشية الديناميكية والوظيفية من خلال أمثلة ملموسة لدراسات NSE على أنظمة أغشية الدهون النموذجية والوثيقة الصلة بيولوجيا مع التركيز على ديناميكيات مقياس المتوسط في الأغشية القائمة بذاتها ، في شكل تعليق ليبوسومي. بالنسبة لقياسات NSE لديناميكيات الأغشية داخل الطائرة ، يشار إلى القارئ إلى منشورات مخصصة حول التحليل الطيفي للنيوترونات الدورانية الصدى (GINSES)55و56 ودراسات أخرى لمداخن الأغشية متعددة اللاميلار المنحازة57و58و59و60.
للبساطة ، تسلط هذه الورقة الضوء على ثلاثة مخططات مختلفة من الديوتريشن الغشاء يتضح على تشكيل المجال مدروسة جيدا ، أو فصل المرحلة، نظام ثنائي الطبقات الدهون من 1،2-dimyristoyl-sn-glycero-3-فوسفوتشولين (DMPC) و 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوتشولين (DSPC) خلائط61،62. وتتميز الدهون اثنين من عدم تطابق في طول سلسلة الهيدروكربونات (14 الكربونات / الذيل في DMPC مقابل 18 الكربون / الذيل في DSPC) ودرجة الحرارة انتقال هلام السائل (TM، DMPC = 23 درجة مئوية مقابل Tم، DSPC = 55 درجة مئوية). وهذا يؤدي إلى فصل المرحلة الجانبية في DMPC: DSPC الأغشية في درجات الحرارة بين درجات الحرارة الانتقالية العليا والسفلى من الخليط63. يتم اختيار مخططات الديوتر التي تم النظر فيها هنا لإظهار الأنماط الديناميكية المختلفة التي يمكن الوصول إليها في قياسات NSE على الأغشية الدهنية ، وهي تقلبات الانحناء ، وتقلبات السماكة ، وتقلبات الانحناء / السماكة الانتقائية للمجالات الجانبية. يتم الإبلاغ عن جميع التراكيب الدهنية لDMPC: DSPC الطبقات الثنائية المعدة في جزء الخلد من 70:30، وذلك باستخدام المتغيرات المتاحة تجاريا بروتيات و perdeuterated من DMPC وDSPC. وتستند جميع خطوات إعداد العينة على 4 مل من تعليق الدهون، في D2O، مع تركيز الدهون من 50 ملغم / مل، لكتلة الدهون الإجمالية منتوت M= 200 ملغ لكل عينة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroform (biotech grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>496189</td>
			<td>Biotech. grade, &#8805;99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>SE-12</td>
			<td>Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Cambridge Isotopes Laboratories</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Semi-Microbalance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS105</td>
			<td>Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof ethanol for molecular biology applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36360-536</td>
			<td>Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B7990-1</td>
			<td>Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab grade freezer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IU2886D</td>
			<td>Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids (protaited or perdeuterated)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>varies by lipid</td>
			<td>Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water purifier</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZRQSVP3US</td>
			<td>Direct-Q&#174;&#160;3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological&#160; applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder Set</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020</td>
			<td>Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Connect Fittings</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2YDA1 and 2YDA7</td>
			<td>Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>SyringePump.com</td>
			<td>New Era-1000</td>
			<td>Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td>Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3608</td>
			<td>0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td>Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron spin echo spectroscopy as a unique probe for lipid membrane dynamics and membrane-protein interactions

تشكل الطبقات ثنائية الدهون المصفوفة الرئيسية لأغشية الخلايا وهي المنصة الأساسية لتبادل العناصر الغذائية ، والتفاعلات بين البروتين والغشاء ، والفيروسية الناشئة ، من بين عمليات خلوية حيوية أخرى. للنشاط البيولوجي الفعال، يجب أن تكون أغشية الخلايا جامدة بما يكفي للحفاظ على سلامة الخلية ومقصوراتها ولكنها سائلة بما يكفي للسماح لمكونات الأغشية، مثل البروتينات والمجالات الوظيفية، بالانتشراط والتفاعل. هذا التوازن الدقيق لخصائص الأغشية المرنة والسائلة ، وتأثيرها على الوظيفة البيولوجية ، يتطلب فهما أفضل لديناميكيات الأغشية الجماعية على طول الغشاء التنظيري والمقاييس الزمنية للعمليات البيولوجية الرئيسية ، على سبيل المثال ، تشوهات الأغشية وأحداث ربط البروتين. من بين التقنيات التي يمكن أن تحقق بشكل فعال هذا النطاق الديناميكي هو النيوترون صدى دوران (NSE) الطيفية. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الديوتريوم، يمكن استخدام NSE للوصول مباشرة الانحناء وتقلبات سمك، فضلا عن ديناميات التنظير من ميزات غشاء مختارة. تقدم هذه الورقة وصفا موجزا لتقنية NSE وتحدد إجراءات إجراء تجارب NSE على الأغشية الدهنية ، بما في ذلك تفاصيل إعداد العينات ومخططات الديوتر ، إلى جانب تعليمات لجمع البيانات والحد منها. كما تقدم الورقة أساليب تحليل البيانات المستخدمة لاستخراج معلمات الغشاء الرئيسية، مثل معامل صلابة الانحناء، ومعامل ضغط المنطقة، واللزوجة داخل الطائرة. لتوضيح الأهمية البيولوجية لدراسات NSE ، تتم مناقشة أمثلة مختارة من الظواهر الغشائية التي بحثتها NSE ، وهي تأثير الإضافات على صلابة الانحناء الغشائي ، وتأثير تكوين المجال على تقلبات الأغشية ، والتوقيع الديناميكي للتفاعلات بين الغشاء والبروتين.

عادة ما يتم إجراء دراسات NSE الوصول إلى تقلبات الانحناء على مدى Q من ~ (0.04 - 0.2) Å-1. يتوافق نطاق Q هذا مع مقاييس الطول المتوسطة بين سمك الغشاء ونصف قطر الليبوزوما، حيث تهيمن ديناميكيات الانحناء. يمكن أن يمنح القياس عبر نطاق Q الموسع إمكانية الوصول إلى أوضاع ديناميكية إضافية، بما في ذلك الان...

Watch this Scientific Journal Video about Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions at JoVE.com

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

تصف هذه الورقة بروتوكولات إعداد العينات، والحد من البيانات، وتحليل البيانات في دراسات صدى الدوران النيوتروني (NSE) للأغشية الدهنية. تمكن وسمة الديوتريوم الحكيمة للدهون من الوصول إلى ديناميكيات غشاء مختلفة على الطول والمقاييس الزمنية بالمنظار ، والتي تحدث عليها العمليات البيولوجية الحيوية.

النيوترون تدور صدى الطيف كمسبار فريد لديناميات الغشاء الدهني والتفاعلات الغشاء البروتين

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

يصف هذا البروتوكول إعداد العينات وتقليل البيانات المطلوبة لنجاح دراسات صدى الدوران النيوتروني لتقلبات الأغشية الجماعية ذات الصلة بالمهام البيولوجية والتطبيقات العملية للأغشية الدهنية. NSE يصل مباشرة ديناميات الغشاء على الجداول الزمنية نانو ثانية من وظائف الغشاء الرئيسية مع ميزة فريدة من حساسية النظائر للتحقيق ميزات الغشاء الانتقائي لا يمكن الوصول إليها مع تقنيات أخرى. دراسات ديناميات الأغشية على مقياس النانو ضرورية لفهم خصائص الغشاء الكامنة في الآلية الجزيئية والتفاعلات بين الغشاء والبروتين المتورطين في أمراض الخلايا المختلفة.توفر هذه الطريقة للباحثين الجدد في NSE إرشادات مفصلة حول تصميم وإعداد وتوصيف الحويصلات الدهنية للتجارب الناجحة وتحليل وتفسير تقليل البيانات اللاحقة. وسيتجلى فى العملية تيشانى كوماراج وجولى نجوين طالبة دراسات عليا وطالبة جامعية من المختبر . العمل داخل غطاء محرك السيارة، وإعداد تعليق الدهون عن طريق حل الدهون وزنها بدقة في ملليلتر واحد من المذيبات مع خلط يدوي.جفف محلول الدهون عن طريق بث غاز خامل برفق في القارورة أثناء تدويره ببطء بزاوية. لإزالة المذيب المتبقية جيدا، ضع القنينات بين عشية وضحاها في فرن فراغ في 35 درجة مئوية. في اليوم التالي، هيدرات الفيلم الدهون مع اثنين من ملليلتر من الماء الثقيل للحصول على تركيز الدهون من 50 ملليغرام لكل ملليلتر ودوامة تعليق الدهون رطب حتى يتم حل الفيلم الدهون تماما.بعد ذلك، قم بإجراء خمس دورات لذوبان الجليد عن طريق تخزين قارورة تعليق الدهون المرطب عند ناقص 80 درجة مئوية حتى يتم تجميدها. ومن ثم نقله إلى حمام مائي 35 درجة مئوية لإذابة تعليق الدهون. دوامة التعليق المذاب حتى متجانسة قبل الشروع في الدورة التالية.قبل بدء التجربة، قم بتجميع إعداد البثق باستخدام غشاء متعدد الكربونات بين دعامتين للغشاء وإضافة فلترات ورق على كل جانب لتوفير دعم إضافي. استخدام المحاقن الزجاجية محكم لترطيب غشاء البولي عن طريق تمرير 0.3 ملليلتر من الماء الثقيل من خلال تجميع الغشاء عدة مرات. بعد ترطيب الغشاء، أدخل حقنة واحدة ضيقة بالغاز ملليلتر مع محلول دهون أبيض حليبي معد في نهاية واحدة وحقنة فارغة في الطرف الآخر من جهاز البثق.بمجرد توصيل المحاقن، ضع التجميع في كتلة البثق. برمجة المضخة عن طريق الضغط باستمرار على زر معدل لدخول معدل البثق واضغط على زر القطر لدخول قطر الحقنة. ثم اضغط على سحب حتى يتم تشغيل الضوء.اضغط على بدء وانتظر العينة لبدء الاستغناء في حقنة فارغة. اضغط على زر إيقاف قبل حقنة العينة فارغة تماما. سجل مستوى الصوت الذي تم توزيعه، ثم اضغط على زر Rate حتى تظهر المرحلة الأولى على الشاشة.مع إيقاف تشغيل ضوء السحب، اضغط على زر مستوى الصوت لإدخال مستوى الصوت الذي تم توزيعه المسجل سابقا. اضغط على زر Rate مرة أخرى واستخدم السهم الأيمن الأكثر متابعة للوصول إلى المرحلة الثانية. اضغط على وحدة التخزين لإدخال نفس قيمة وحدة التخزين الموزعة المسجلة سابقا.في هذه المرحلة، اضغط على زر السحب حتى يتم تشغيل ضوء السحب. كرر دورة المرحلة الثالثة بالضغط على زر الصوت حتى يظهر LP:SE على الشاشة وتعيينه إلى 20. وأخيرا، اضغط على زر Rate (معدل)، والوصول إلى المرحلة الرابعة، والضغط على زر مستوى الصوت للوصول إلى وظيفة Stop لإنهاء إعداد المضخة.بعد برمجة المضخة، اضغط على البدء لبدء دورة البثق. قم بإجراء 15 إلى 20 دورة قذف قبل جمع تعليق الدهون الأزرق الشفاف المقذوف من العقيق في قارورة نظيفة للقياسات. افتح برنامج DAVE وحدد تقليل بيانات NSE من قائمة "تقليل البيانات".تحميل ملفات البيانات عبر قيم Q مختلفة باستخدام فتح echo Files من قائمة الملفات. ستظهر الملفات التي تم تحميلها ضمن مجموعات البيانات المتوفرة. انقر بزر الماوس الأيمن على الملف المحدد وتسميته وفقا للقياس الذي يتوافق مع نموذج أو خلية أو دقة.باستخدام علامة التبويب مجموعة البيانات، قم بتجميع وحدات بكسل الكاشف في 2 X 2 لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. تطبيق binning نفس إلى كافة ملفات الدقة الخلية و نموذج. فحص البيانات على جميع مجموعات بكسل وإخفاء تلك مع إشارات الفقراء عن طريق الضغط على مفتاح النهاية على لوحة المفاتيح.اضغط على Enter للوصول إلى نافذة منبثقة لتطبيق القناع نفسه على جميع الأوقات الأربعة. سوف بكسل ملثمين تتحول إلى اللون الأخضر. تأكد من أن البيانات التي تم جمعها في شكل إشارة صدى.بدء تركيب ملف القرار من قائمة الملفات التي تم تحميلها عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الملف المطلوب وتحديد صالح العمليات، Fit Echoes القرار من القائمة المنبثقة. تأكد من أن نوبات إشارات الصدى تسفر عن معلمات مناسبة معقولة. لفحص الخطأ المقترن بكل معلمة مناسبة عبر الكاشف بالكامل، حدد خيارات الصورة، ثم حدد المعلمة المناسبة ذات الاهتمام.ثم انقر بزر الماوس الأيمن على صورة الكاشف للوصول إلى نافذة منبثقة تعرض خريطة شريط الأخطاء. إذا كان الاحتواء على بكسل معين غير مرض، فقم بإعادة ملاءمة الإشارة عبر هذا البكسل عن طريق تحديده، والضغط على علامة التبويب المناسب، ثم الضغط على Fit Pixel. إدخال معلمات بدء جديدة للمرحلة والفترة في علامة التبويب "ملائم".تقليل ملف العينة عن طريق تحديد الملف المطابق من قائمة الملفات التي تم تحميلها وتسميتها. فحص جميع بكسل وقناع الفقراء على النحو المبين أعلاه. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على الملف وحدد عمليات احتواء، استيراد مراحل.بالنسبة لملف الدقة، تناسب إشارات الصدى كما هو موضح من قبل مع قيم الفترة دون تغيير ونقطة مرحلة الصدى المستوردة من الدقة تناسبها. أدخل مركز الحزمة لكافة ملفات البيانات عن طريق الوصول إلى علامة التبويب عام وإدخال قيم مركز الحزم X و Y المسجلة من التجربة. بمجرد اكتمال الإعدادات، احسب وظيفة التشتت المتوسطة التي تم تسويتها بالنقر بزر الماوس الأيمن على ملف العينة المطلوب من قائمة الملفات المجهزة وتحديد حساب I من Q من القائمة المنبثقة.أدخل المعلومات المطلوبة لملفات الدقة والخلايا وعدد Q-arcs في النافذة المنبثقة، ثم اضغط موافق لعرض النتائج. لاحظ أن البيانات في سماوي يظهر إشارة رديئة بسبب آثار حافة كاشف وينبغي القضاء عليها عند تجميع مجموعات مختلفة من البيانات Q. وأخيرا، حفظ مجموعات البيانات المنخفضة كملفات ASCII وحفظ جلسة العمل بأكملها كمشروع DAVE في المجلد المطلوب.في هذه الدراسة، تم إجراء قياسات NSE للعينات الدهنية التي أعدت مع مخططات الديوتريشن المختلفة. يتم إجراء قياسات NSE لتقلبات الانحناء الغشاء على الليبوسومات المتناقضة تماما. ينتج عن مخطط الديوتر هذا فرق كبير في الطول المتناثر بين جوهر الغشاء وبيئة السوائل المذابة ، مما يعزز بشكل كبير إشارة التشتت من الأغشية الدهنية ويحسن إحصاءات قياس ديناميكيات الانحناء.من ناحية أخرى، تظهر قياسات NSE لتقلبات سماكة الأغشية من الليبوسومات انحرافات بالنسبة إلى Q إلى الاعتماد الثالث لتقلبات الانحناء. لعزل إشارة تقلبات السمك ، يتم تقسيم الإشارة التي تم الحصول عليها من قبل Q إلى الثالث ويتم تركيب الديناميكيات الزائدة على وظيفة Lorentzian في Q.This تعتمد على بيانات ذات نوعية جيدة ، والتي هي أكثر قابلية للتحقيق مع عينات من تركيزات عالية وإشارات تشتيت قوية. يمكن استكشاف الديناميكيات التي بحثتها NSE بشكل تآزري من خلال قياس استرخاء الديوتريوم NMR والمحاكاة الديناميكية الجزيئية لتوضيح كيفية تأثير هياكل الدهون الجزيئية وزخارف التعبئة على وظائف الغشاء.تلقي دراسات NSE على أغشية الدهون ضوءا جديدا على الفيزياء الحيوية للأغشية ، والعلاقات المعقدة لهيكل الغشاء وديناميكياته ، وكيف تؤثر على وظائف الغشاء والتفاعلات بين الغشاء والبروتين.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

ودقق ميكروفلويديك : تشغيل واستخدام لتصنيع السطحي المترجمة

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

قياس معدلات بلازما بروتين الغشاء التقامي بواسطة Biotinylation عكسية

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

فلاش وتجميد: تقنية جديدة لالتقاط غشاء حيوية مع المجهر الإلكتروني

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

تصوير فيتك-ديكستران كمراسل للرقابة الخاضعة للتنظيم

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

طريقة CryoAPEX لتحليل المجهر الإلكتروني لتوطين بروتين الغشاء داخل الخلايا المحفوظة فائقة الهيكلية

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

الكشف عن تجميع البروتين باستخدام التحليل الطيفي للارتباط الفلوري

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...