Name: neutron spin echo spectroscopy as a unique probe for lipid membrane dynamics and membrane-protein interactions
Uploaded: 2021-05-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions at JoVE.com

ר. אשקר תודה מ. נגאו, ל.ר. סטינצ'יו, ו P. Zolnierczuk לדיונים שימושיים רבים ועל עזרתם התכופה בניסויי NSE על קווי הקורה שלהם. המחברים מכירים בשימוש בספקטרומטרי הד ספין נויטרונים ב- NIST ו- ORNL. ספקטרומטר NSE ב- NIST נתמך על ידי המרכז לפיזור ניוטרון ברזולוציה גבוהה, שותפות בין המכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה לבין הקרן הלאומית למדע בהסכם לא. DMR-1508249. ספקטרומטר NSE במקור הנויטרונים של ORNL נתמך על ידי חטיבת מתקני המשתמש המדעי, המשרד למדעי האנרגיה הבסיסית, מחלקת האנרגיה של ארה"ב. המעבדה הלאומית אוק רידג' מנוהלת על ידי UT-Battelle, LLC תחת חוזה DOE בארה"ב לא. DE-AC05-00OR22725.

1. ערכת ההסתה הנדרשת לניסוי
<ol><li>למדידות תנודות כיפוף, הכינו ליפוזומים פרוטיים לחלוטין ב- D2O (D 99.9%) או D2O-buffer (למשל, מאגר פוספט שהוכן עם D2O במקום H2O). השתמש DMPC protiated מלא (C36H72NO8P) ו- DSPC (C44H88NO8P) עם <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg"> 133.4 מ"ג, ...

NSE היא טכניקה רבת עוצמה וייחודית במדידת דינמיקה מסוסקופית של ממברנות שומנים בדם בתנאים שונים. הניצול היעיל של NSE תלוי באיכות המדגם, בניגודיות הנויטרונים ובמגוון הדינמיקה הנגישת שניתן לבדוק עבור מדגם נתון. לכן, נדרשים מספר צעדים קריטיים לביצוע ניסויי NSE מוצלחים ואיסוף נתונים באיכות גבוהה. ?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others &#8212;&#160;the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 &#215; 10-6&#160;&#197;-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others &#8212;&#160;the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" /> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC&#160;and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD&#160;~ 2&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" /> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC&#160;and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD&#160;~ 0&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted&#160;from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) &#197;-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" />, where&#160;Icoh and Iinc&#160;are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 &#215; 10-6 &#197;-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 &#215; 10-6 &#197;-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) &#197;-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" />, where&#160;Icoh and Iinc&#160;are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0&#160;&#215; 10-6 &#197;-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 &#215; 10-6 &#197;-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4.jpg" /> 
Figure 2:&#160;Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2&#160;&#215; 10-2 &#197;-2)&#160;and tail region (~4.5 &#215; 10-6 &#197;-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5.jpg" /> 
Figure 2:&#160;Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region&#160;(~0&#160;&#215; 10-2 &#197;-2)&#160;and headgroup&#160;region (~4.5 &#215; 10-6 &#197;-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

ההבנה של קרום התא ותפקודם התפתחה להפליא בעשורים האחרונים. ההשקפה הקודמת של קרום התא כביבאי שומנים פסיביים המגדירים את גבולות התא וחלבוני קרום הבית1 הפכה בהדרגה למודל דינמי שבו דו-שכבתי השומנים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות תהליכים ביולוגיים חיוניים, כולל איתות תאי, החלפה מולקולרית ותפקוד חלבונים - אם להזכיר כמה2,3,4,5,6. הבנה זו כי קרום התא הם דינמיים מאוד, כל הזמן עובר שיפוץ וחלוקה מולקולרית, דחף מחקרים מדעיים מעבר למבני שיווי משקל של ממברנות7,8,9. בהתאם, פותחו גישות מרובות כדי לחקור את המצבים הדינמיים השונים בממברנות שומנים ביולוגיות וביואינספיריות. עד כה, רוב המחקרים התמקדו בעיקר בתנועות מולקולריות מפוזרות10,11,12,13 ותנודות צורה מקרוסקופיות14,15,16, משאיר פער משמעותי בהבנת דינמיקת ממברנה ביניים, כלומר, תנודות קולקטיביות של מכלולי שומנים המורכבים כמה 10-100s של מולקולות השומנים. דינמיקה זו מתרחשת על פני סולמות אורך של כמה עשרות עד כמה 100 Å ועם הזמן סולמות של sub-ns עד כמה מאות ns (ראה איור 1), המכונה כאן קשקשים מסוסקופיים. זה אכן בקנה מידה זה כי פעילות ביולוגית מפתח מתרחשת ברמה הממברנה17. זה כולל ניצנים ויראליים18, ערוץ gating19, ו אינטראקציות חלבון ממברנה20. חשוב גם לציין כי הנוף האנרגטי של חלבוני הממברנה21,22 מראה כי שינויים קונפורמציה בחלבונים - הכרחיים לתפקידם הרגולטורי - מתרחשים לאורך סולמות הזמן ns23 של תנודות ממברנה קולקטיבית, תוך הדגשת החשיבות של דינמיקה מסוסקופית בתפקוד הביולוגי של קרום התא והאנלוגיות הביו-השראה שלהם20. מאמר זה מתמקד בשני המצבים הדינמיים המזוסקופיים העיקריים בממברנות השומנים, כלומר, תנודות כיפוף ותנודות עובי.
האתגר העיקרי בוחן ישיר מצבי תנודות אלה הוא הקושי לגשת בו זמנית לקנה המידה המרחבי והזמן שלהם בשיטות ספקטרוסקופיה סטנדרטיות. האתגר השני הוא שטכניקות מגע ישיר יכולות להשפיע על אותן תנודות שהן אמורות למדוד16. זה מחמיר עוד יותר על ידי המורכבות הרכב ומבנית של ממברנות ביולוגיות24,25, אשר התוצאה היא תכונות ממברנה לא הומוגנית, כולל היווצרות תחום השומנים26,27,28,29,30 ו אסימטריה ממברנה31,32,33- דורש בדיקות סלקטיביות כדי להבין את הדינמיקה של תכונות ממברנה שונות. למרבה המזל, ניתן להתגבר על אתגרים אלה בשיטות ספקטרוסקופיה לא פולשניות של נויטרונים, כגון הד ספין נויטרונים (NSE), אשר מטבען לגשת קשקשי האורך וזמן הנדרשים, ולאפשר עוד יותר מחקרים של תכונות ממברנה סלקטיבית מבלי לשנות את הסביבה הפיזיקוכימית שלהם34. ואכן, במהלך השנים האחרונות ספקטרוסקופיית NSE התפתחה לגשוש ייחודי ורב עוצמה של דינמיקת הממברנה הקולקטיבית35. תוצאות מחקרי NSE על ממברנות השומנים הפיקו תובנות חדשות על מכני36,37 ו צמיג38,39 תכונות של ממברנות השומנים לשפוך אור חדש על תפקידם הפוטנציאלי בתפקוד הביולוגי40,41.
טכניקת הספקטרוסקופיה של NSE מבוססת על עיצוב מכשיר אינטרפרומטרי, שהוצע לראשונה על ידי Mezei42, באמצעות סדרה של ספין סנפירים סלילים מגנטיים כדי לשלוט על הקדירה של ספין הנויטרונים כמו נייטרונים לחצות את המכשיר. העיצוב נשען על שיקוף מגנטי של יסודות השדה המגנטי ביחס למיקום המדגם(איור 1A). משמעות הדבר היא כי בהיעדר חילופי אנרגיה בין הנויטרונים לדגימה, הנויטרונים מבצעים את אותו מספר של נטיות ספין, בכיוונים מנוגדים, במחצית הראשונה והשנייה של המכשיר (שימו לב π-סנפיר בין שני סלילי ההקדמה). כתוצאה מכך, מצב הספין הסופי של הנויטרונים נותר ללא שינוי ביחס למצב ההתחלתי - תופעה המכונה ספין-הד (ראו נויטרונים שקופים באיור 1A). עם זאת, כאשר הנויטרונים מתקשרים במרץ עם המדגם, חילופי האנרגיה משנה את מספר ההטיות בסיבוב במחצית השנייה של המכשיר, מה שמוביל למצב ספין סופי אחר (ראו איור 1A). זה מזוהה באופן ניסיוני כהפסד בקיטוב, כפי שיוצג בהמשך מאמר זה. לקבלת פרטים נוספים על טכניקת NSE, הקורא מופנה מאמרים טכניים ייעודיים42,43,44,45.
כאן, תיאור פשוט מוצג כדי לספק הערכה גסה של סולמות האורך והשעה הנגישים עם NSE. סולמות האורך נקבעים על ידי טווח העברות wavevector בר השגה, Q = 4π sin θ/ λ, שבו2 θ הוא זווית הפיזור ו λ הוא אורך הגל הנויטרונים. ניתן לראות ש-Q מוגדר על ידי טווח אורך הגל והיקף הסיבוב של הזרוע השנייה של הספקטרומטר (ראו איור 1A). טווח Qטיפוסי על ספקטרומטרים NSE הוא ~ 0.02-2 Å-146,47, ועד 0.01-4 Å-1 עם שדרוגים אחרונים48,49, המקביל לקנה מידה מרחבי של ~ 1-600 Å. מצד שני, סולם הזמן הנגיש מחושב מזווית ההקדמה הכוללת (או השלב) שנרכשה על ידי הנויטרונים בתוך סלילי ההקדמה המגנטית, ונמצא50: <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq12v5.jpg"> . בביטוי זה, t הוא זמן פורייה המוגדר <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq13v2.jpg"> כ, איפה <img alt="Equation 50" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq50v2.jpg"> היחס הגירומגנטי של הנויטרונים, <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg"> הוא אורך סליל, <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> והוא כוחו של השדה המגנטי של סליל. ראוי לציין כי זמן פורייה הוא כמות התלויה לחלוטין בגיאומטריית המכשיר, חוזק השדה המגנטי ואורך הגל הנויטרונים. לדוגמה, באמצעות נייטרונים של אורך גל <img alt="Equation 70" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq70v6.jpg"> = 8 Å והגדרות מכשיר של <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg">   = 1.2 מ ' ו <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> - 0.4 T, זמן פורייה מחושב להיות t ~ 50 ns. באופן ניסיוני, זמן פורייה מכוון על ידי שינוי הזרם בסלילי הקדם (כלומר, חוזק השדה המגנטי) או באמצעות אורכי גל נויטרונים שונים, וכתוצאה מכך סולמות זמן טיפוסיים של NSE של ~ 1 ps עד 100 ns. עם זאת, שדרוגים אחרונים בספקטרומטר NSE אפשרו גישה לזמנים ארוכים יותר של פורייה, עד כ-400 נ'ב בספקטרומטר J-NSE-Phoenix בספקטרומטר היינץ מאייר-לייבניץ זנטרום51 וספקטרומטר SNS-NSE במעבדה הלאומית אוק רידג'48, ועד ~ 1,000 ns בספקטרומטר IN15 NSE במכון לאו-לנגווין (ILL)49. 
מלבד גישה ישירה לאורך ולקנה המידה של דינמיקת הממברנה, ל- NSE יש את היכולות הטבועות של רגישות איזוטופ נויטרונים52. באופן ספציפי, היכולת של נייטרונים לקיים אינטראקציה שונה עם האיזוטופים של מימן, היסוד הנפוץ ביותר במערכות ביולוגיות, גורמת לצפיפות אורך פיזור נויטרונים שונה,34 או NSLD (המקבילה של האינדקס האופטי של שבירה50), כאשר פרוטיום מוחלף על ידי דיטריום. זה מאפשר גישה המכונה וריאציה ניגודית, אשר משמש בדרך כלל כדי להדגיש תכונות ממברנה ספציפיות או להסתיר אחרים - התרחיש האחרון מכונה התאמת ניגוד. יישום תכוף של וריאציה /התאמה ניגודיות הוא החלפת מים (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) על ידי מים כבדים או D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) כדי להגביר את אות הנויטרונים מקרום השומנים פרוטיים (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). גישה זו יעילה מאוד במחקרים של מבנה הממברנה מכיוון שחדירת D2O לאזור קבוצת הראש של הממברנה מאפשרת קביעה מדויקת של עובי הממברנה (ראה איור 2A, פאנל שמאלי) ושל המיקום של קבוצות משנה שומנים שונות כאשר מודלים מתוחכמים יותר מוחלים53,54. מאמר זה מדגיש כמה דוגמאות על השימוש וריאציה ניגודיות למחקרים של דינמיקה קולקטיבית בממברנות biomimetic ותכונות ממברנה לבחור.
כאן, האפקטיביות של NSE במתן תובנות ייחודיות על תכונות ממברנה דינמית ופונקציונלית מודגמת באמצעות דוגמאות מוחשיות של מחקרי NSE על מודל ומערכות קרום שומנים רלוונטיות ביולוגית עם דגש על דינמיקה mesoscale בממברנות עצמאיות, בצורה של מתלים liposomal. עבור מדידות NSE של דינמיקת ממברנה בתוך המטוס, הקורא מתייחס פרסומים ייעודיים על ספקטרוסקופיית ספין-הד-הד של נויטרונים (GINSES)55,56 ומחקרים אחרים של ערימות ממברנה רב-שלמית מיושרות57,58,59,60.
לפשטות, מאמר זה מדגיש שלוש תוכניות שונות של פירוק ממברנה מאויר על דומיין נחקר היטב, או הפרדת פאזה, מערכת bilayer השומנים של 1,2-dimyristoyl-sn-גליצרי-3-פוספוצולין (DMPC) ו 1,2-distearoyl-sn-גלייצרו-3-פוספוצולין (DSPC) תערובות61,62. שני השומנים מאופיינים בחוסר התאמה באורך שרשרת הפחמימנים שלהם (14 פחמנים/זנב ב- DMPC לעומת 18 פחמנים /זנב ב- DSPC) וטמפרטורת המעבר של נוזל הג'ל שלהם (Tm, DMPC = 23 °C לעומת Tm, DSPC = 55 °C (C). התוצאה היא הפרדת פאזה לרוחב ב DMPC: DSPC ממברנות בטמפרטורות בין טמפרטורות המעבר העליונות והתחתונות של התערובת63. תוכניות ההסתה הנחשבות כאן נבחרות כדי להדגים את המצבים הדינמיים השונים הנגישים במדידות NSE על ממברנות ליפוזומליות, כלומר, תנודות כיפוף, תנודות עובי ותנודות כיפוף / עובי סלקטיביות של תחומים לרוחב. כל הרכבי השומנים מדווחים עבור DMPC:DSPC bilayers מוכן בשבר שומה של 70:30, באמצעות גרסאות פרוטציה ו perdeuterated זמין מסחרית של DMPC ו- DSPC. כל שלבי הכנת המדגם מבוססים על 4 מ"ל של השעיה ליפוזומית, ב D2O, עם ריכוז שומנים בדם של 50 מ"ג /מ"ל, עבור מסת שומנים כוללת של Mtot = 200 מ"ג לדגימה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroform (biotech grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>496189</td>
			<td>Biotech. grade, &#8805;99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>SE-12</td>
			<td>Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Cambridge Isotopes Laboratories</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Semi-Microbalance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS105</td>
			<td>Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof ethanol for molecular biology applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36360-536</td>
			<td>Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B7990-1</td>
			<td>Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab grade freezer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IU2886D</td>
			<td>Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids (protaited or perdeuterated)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>varies by lipid</td>
			<td>Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water purifier</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZRQSVP3US</td>
			<td>Direct-Q&#174;&#160;3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological&#160; applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder Set</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020</td>
			<td>Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Connect Fittings</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2YDA1 and 2YDA7</td>
			<td>Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>SyringePump.com</td>
			<td>New Era-1000</td>
			<td>Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td>Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3608</td>
			<td>0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td>Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron spin echo spectroscopy as a unique probe for lipid membrane dynamics and membrane-protein interactions

דו-שכבתיים שומנים מהווים את המטריצה העיקרית של קרום התא והם הפלטפורמה העיקרית לחילופי חומרים מזינים, אינטראקציות בין קרום חלבון וניצנים ויראליים, בין תהליכים תאיים חיוניים אחרים. לפעילות ביולוגית יעילה, קרום התא צריך להיות נוקשה מספיק כדי לשמור על שלמות התא ותאיו עדיין נוזל מספיק כדי לאפשר רכיבי ממברנה, כגון חלבונים ותחומים פונקציונליים, לפזר אינטראקציה. איזון עדין זה של תכונות ממברנה אלסטית וזורמת, והשפעתם על התפקוד הביולוגי, מחייבים הבנה טובה יותר של דינמיקת הממברנה הקולקטיבית על פני סולמות אורך וזמן מסוסקופיים של תהליכים ביולוגיים מרכזיים, למשל, עיוותי ממברנה ואירועי כריכת חלבונים. בין הטכניקות שיכולות לחקור ביעילות טווח דינמי זה הוא ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים (NSE). בשילוב עם תיוג דיטריום, NSE יכול לשמש כדי לגשת ישירות כיפוף ותנודות עובי, כמו גם דינמיקה מסוסקופית של תכונות ממברנה נבחרות. מאמר זה מספק תיאור קצר של טכניקת NSE ומתאר את ההליכים לביצוע ניסויי NSE על ממברנות liposomal, כולל פרטים של הכנה מדגם תוכניות deuteration, יחד עם הוראות לאיסוף נתונים והפחתת. המאמר מציג גם שיטות ניתוח נתונים המשמשות לחילוץ פרמטרים מרכזיים של ממברנה, כגון מודולוס קשיחות כיפוף, מודולוס דחיסת שטח וצמיגות בתוך המטוס. כדי להמחיש את החשיבות הביולוגית של מחקרי NSE, דוגמאות נבחרות לתופעות ממברנה הנבדקות על ידי NSE נדונות, כלומר, ההשפעה של תוספים על קשיחות כיפוף הממברנה, ההשפעה של היווצרות תחום על תנודות ממברנה, ואת החתימה הדינמית של אינטראקציות חלבון ממברנה.

מחקרי NSE גישה לתנודות כיפוף מבוצעים בדרך כלל על פני טווח Q של ~ (0.04 - 0.2) Å-1. טווח Q זה מתאים לקשקשי אורך ביניים בין עובי הממברנה לרדיוס הליפוזום, שבו דינמיקת הכיפוף שולטת. מדידה על פני טווח Q מורחב יכולה להעניק גישה למצבים דינמיים נוספים, כולל דיפוזיה ליפוזומלית ודינמיקה תוך-ממדית. לקבלת פ...

Watch this Scientific Journal Video about Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions at JoVE.com

Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים להכנת מדגם, הפחתת נתונים וניתוח נתונים במחקרי הד ספין נויטרונים (NSE) של ממברנות השומנים. תיוג דיטריום נבון של שומנים מאפשר גישה לדינמיקה שונה של ממברנה על קשקשי אורך וזמן מזוסקופיים, שעליהם מתרחשים תהליכים ביולוגיים חיוניים.

ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים כגשוש ייחודי לדינמיקה של קרום השומנים ואינטראקציות בין חלבון ממברנה

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

פרוטוקול זה מתאר הכנת מדגם והפחתת נתונים הנדרשים למחקרי הד ספין נויטרונים מוצלחים של תנודות ממברנה קולקטיבית של רלוונטיות לפונקציות ביולוגיות ויישומים מעשיים של ממברנות השומנים. NSE ניגש ישירות לדינמיקה של הממברנה בצירי הזמן של ננו-שניות של פונקציות קרום מפתח עם היתרון הייחודי של רגישות איזוטופים לבדיקת תכונות ממברנה סלקטיבית שאינן נגישות לטכניקות אחרות. מחקרים על דינמיקת הממברנה על הננומטרים חיוניים להבנת תכונות הממברנה הבסיסית של המנגנון המולקולרי ואינטראקציות בין חלבון ממברנה הסתבכו בפתולוגיות תאים שונות.השיטה מספקת לחוקרים חדשים ל- NSE הנחיות מפורטות על עיצוב, הכנה ואפיון שלשלות שומנים לניסויים מוצלחים וניתוח ופרשנות להפחתת נתונים לאחר מכן. מי שיוכיחו את ההליך יהיו טסאני קומארג' וג'ולי נגוין, סטודנטית לתואר שני ותלמידת לתואר ראשון מהמעבדה. עבודה בתוך מכסה המנוע, להכין את השעיית השומנים על ידי המסת שומנים במשקל מדויק מיליליטר אחד של ממס עם ערבוב ידני.ייבשו את תמיסת השומנים על ידי הזרמה עדינה של גז אינרטי בוויאליה תוך סיבוב איטי בזווית. כדי להסיר ביסודיות את הממס שיורית, מניחים את הבקבוקונים לילה בתנור ואקום ב 35 מעלות צלזיוס. למחרת, לחות את הסרט השומנים עם שני מיליליטר של מים כבדים כדי לקבל ריכוז שומנים של 50 מיליגרם למיליליטר מערבולת השעיית השומנים hydrated עד סרט השומנים מומס לחלוטין.לאחר מכן, לבצע חמישה מחזורי הפשרת הקפאה על ידי אחסון את ההשעיה השומנים hydrated במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הקפאה. ואז מעביר אותו לאמבט מים של 35 מעלות צלזיוס כדי להפשיר את ההשעיה של השומנים. מערבולת ההשעיה המופשרת עד הומוגני לפני שתמשיך למחזור הבא.לפני תחילת הניסוי, להרכיב את ההתקנה extruder באמצעות קרום פולי-ביקרבונט בין שתי תומכות ממברנה ולהוסיף שני מסנני נייר בכל צד כדי לספק תמיכה נוספת. השתמש מזרקי זכוכית אטום כדי לחות את קרום פוליקרבונט על ידי העברת 0.3 מיליליטר של מים כבדים דרך הרכבת הממברנה מספר פעמים. לאחר לחות הממברנה, הכנס מזרק גז אחד מיליליטר הדוק עם תמיסת שומנים לבן חלבי מוכן לקצה אחד ומזרק ריק לקצה הנגדי של מנגנון extruder.לאחר שהמזרקים מחוברים, הנח את ההרכבה לתוך בלוק המחול. תכנת את המשאבה על-ידי החזקת לחצן Rate לחוץ כדי להיכנס לקצב ההבלטה ולחץ על לחצן קוטר כדי להזין את קוטר המזרק. לאחר מכן, לחץ על סג עד שהאור נדלק.לחץ על התחל והמתן עד שהדגימה תתחיל לחלק למזרק הריק. לחץ על לחצן עצור רגע לפני שהמזרק לדוגמה ריק לחלוטין. הקלט את אמצעי האחסון שניתן לו ולאחר מכן החזק את לחצן Rate עד שהשלב הראשון יופיע על המסך.תוך שמירה על נורית משיכה כבויה, לחץ על לחצן עוצמת הקול כדי להזין את אמצעי האחסון שהוקלט קודם לכן. לחץ שוב על לחצן תדרג והשתמש בחץ הימני ביותר למעלה כדי לגשת לשלב השני. הקש על אמצעי אחסון כדי להזין את אותו ערך של אמצעי האחסון שהוקלט קודם לכן.בשלב זה, לחץ על לחצן לסגת עד שהנורית לסגת דולקת. חזור על המחזור עבור שלב שלוש על-ידי לחיצה על לחצן עוצמת הקול עד ש- LP:SE יופיע על המסך והגדר אותו ל- 20. לבסוף, לחץ על לחצן קצב, גש לשלב הרביעי ולחץ על לחצן עוצמת הקול כדי להגיע לפונקציה Stop כדי לסיים את הגדרת המשאבה.לאחר שהמשאבה מתוכנתת, הקש התחל כדי להתחיל את מחזור ההבלטה. בצע 15 עד 20 מחזורי שחול לפני איסוף השעיית השומנים השקוף כחול אופל ב בקבוקון נקי למדידות. פתח את תוכנת DAVE ובחר הקטן נתוני NSE מתפריט הפחתת נתונים.העלה את קבצי הנתונים מעל ערכי Q שונים באמצעות פתח קבצי הד מתפריט הקובץ. הקבצים שהועלו יופיעו תחת ערכות הנתונים הזמינות. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ שנבחר וסמן אותו לפי המדידה אליה הוא מתאים לסימון לדוגמה, לתא או לרזולוציה.באמצעות הכרטיסיה ערכת נתונים, קבץ את הפיקסלים של הגלאי ב- 2 X 2 כדי לשפר את יחס האות לרעש. החל את אותו binning על כל הקבצים של רזולוציה, תא ודוגמה. בדוק את הנתונים מעל כל קבוצות הפיקסלים והסוו את אלה עם אותות גרועים על-ידי הקשה על מקש End בלוח המקשים.הקש Enter כדי לגשת לחלון מוקפץ כדי להחיל את אותה מסיכה על כל ארבע הפעמים שלך. פיקסלים עם מסיכה יהפכו לירוקים. ודא שהנתונים שנאספו הם בצורה של אות הד.התחל להתאים את קובץ הרזולוציה מרשימת הקבצים שהועלה על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ הרצוי ובחירה באפשרות התאם פעולות, התאם לרזולוציית Echoes מהתפריט הנפתח. ודא כי התקפי אותות ההד מניבים פרמטרים מתאימים סבירים. כדי לבדוק את השגיאה המשויכת לכל פרמטר התאמה מעל הגלאי כולו, בחר אפשרויות תמונה ולאחר מכן בחר את הפרמטר המתאים לעניין.לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תמונת הגלאי כדי לגשת לחלון מוקפץ המציג מפת סרגל שגיאות. אם ההתאמה לפיקסל מסוים אינה משביעת רצון, התאימו מחדש את האות מעל הפיקסל על-ידי בחירתו, לחיצה על הכרטיסיה התאמה והקשה על התאם פיקסל. הזן פרמטרי התחלה חדשים עבור השלב והתקופה בכרטיסיה התאמה.הקטן את הקובץ לדוגמה על-ידי בחירת הקובץ המתאים מרשימת הקבצים שהועלה ומתויג. בדוק את כל הפיקסלים והסוות את העניים כמתואר לעיל. לאחר מכן, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ ובחר התאם פעולות, ייבוא שלבים.עבור קובץ הרזולוציה, התאם אותות הד כפי שתואר קודם לכן עם ערכי התקופה ללא שינוי ונקודת פאזה הד המיובאת מהרזולוציה מתאימה. הזן את מרכז הקרן עבור כל קבצי הנתונים על-ידי גישה לכרטיסיה כללי והזנת ערכי מרכז הקרן X ו- Y שנרשמו מהניסוי. לאחר השלמת ההתאמות, חשב את פונקציית פיזור הביניים מנורמלת על-ידי לחיצה ימינה על הקובץ לדוגמה הרצוי מרשימת הקבצים המותאמים ובחירה באפשרות חשב I of Q מהתפריט הנפתח.הזן את המידע הנדרש עבור קבצי הרזולוציה והתא ואת מספר Q-arcs בחלון המוקפץ ולאחר מכן הקש אישור כדי להציג תוצאות. שים לב כי הנתונים בציאן מציגים אות גרוע עקב אפקטי קצה גלאי ויש לבטל בעת הידור ערכות נתוני Q שונות. לבסוף, שמור את ערכות הנתונים המופחתות כקבצי ASCII ושמור את ההפעלה כולה כפרוייקט DAVE בתיקיה הרצויה.במחקר זה, מדידות NSE של דגימות liposomal שהוכנו עם תוכניות תיוג שונות בוצעו. מדידות NSE של תנודות כיפוף ממברנה מבוצעות על ליפוזומים מנוגדים לחלוטין. ערכת פירוק זו גורמת להבדל אורך פיזור גדול בין ליבת הממברנה לסביבת הנוזלים המנוטרלת, משפרת באופן משמעותי את אות הפיזור מהממברנות הליפוזומליות ומשפרת את סטטיסטיקת המדידה של דינמיקת הכיפוף.מצד שני, מדידות NSE של תנודות עובי הממברנה של ליפוזומים מראות סטיות ביחס ל- Q לתלות השלישית של תנודות כיפוף. כדי לבודד את אות תנודות העובי, האות המתקבל מחולק על ידי Q לשלישי והדינמיקה העודפת מותאמת לפונקציה לורנציאנית ב- Q.שיטה זו מותנית בנתונים באיכות טובה, שהיא ברת השגה יותר עם דגימות של ריכוזים גבוהים ואותות פיזור חזקים. הדינמיקה שנחקרה על ידי NSE יכולה להיחקר בסינרגיה על ידי דיטריום NMR relaxometry וסימולציות מולקולריות-דינמיות כדי להמחיש כיצד מבני שומנים מולקולריים ומוטיבים אריזה משפיעים על תפקודי הממברנה.מחקרי NSE על ממברנות שומנים לשפוך אור חדש על ביופיסיקה ממברנה, היחסים המורכבים של מבנה הממברנה והדינמיקה, וכיצד הם משפיעים על תפקודי הממברנה ואינטראקציות חלבון ממברנה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

בדיקה Microfluidic: מבצע ושימוש לעיבוד Surface לוקליזציה

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

פלאש-ו-Freeze: שיטה חדשנית לכידה Dynamics ממברנה עם מיקרוסקופית אלקטרונים

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

הדמיה FITC-לתוספי כעיתונאית אקסוציטוזה מוסדר

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...