Name: neutron spin echo spectroscopy as a unique probe for lipid membrane dynamics and membrane-protein interactions
Uploaded: 2021-05-27T14:30:00
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R. Ashkar gracias M. Nagao, L.-R. Stingaciu y P. Zolnierczuk por muchas discusiones útiles y por su frecuente asistencia con experimentos de NSE en sus respectivas líneas de haz. Los autores reconocen el uso de espectrómetros de eco de espín de neutrones en NIST y ORNL. El espectrómetro NSE en el NIST cuenta con el apoyo del Centro de Dispersión de Neutrones de Alta Resolución, una asociación entre el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología y la Fundación Nacional de Ciencias bajo el acuerdo no. DMR-1508249. El espectrómetro NSE en la fuente de neutrones de espalación de ORNL cuenta con el apoyo de la División de Instalaciones de Usuarios Científicos, Oficina de Ciencias Básicas de la Energía, Departamento de Energía de los Estados Unidos. El Laboratorio Nacional de Oak Ridge es administrado por UT-Battelle, LLC bajo el Contrato No. DE-AC05-00OR22725.

1. Esquema de deuteración requerido para el experimento
<ol><li>Para las mediciones de fluctuación de flexión, realice liposomas completamente protiated en D2O (D 99.9%) o D2O-buffer (por ejemplo, tampón de fosfato preparado con D2O en lugar de H2O). Utilice DMPC (C36H72NO8P) y DSPC (C44H88NO8P) totalmente protiados con <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg"> 133,4 mg, donde <em...

NSE es una técnica poderosa y única en la medición de la dinámica mesoscópica de las membranas lipídicas bajo diversas condiciones. La utilización efectiva de NSE depende de la calidad de la muestra, el contraste de neutrones y el rango de dinámica accesible que se puede sondear para una muestra determinada. Por lo tanto, se requieren varios pasos críticos para realizar experimentos exitosos de NSE y recopilar datos de alta calidad. Un paso clave para garantizar el uso efectivo del tiempo de haz de neutrones dur...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others &#8212;&#160;the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 &#215; 10-6&#160;&#197;-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others &#8212;&#160;the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" /> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC&#160;and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD&#160;~ 2&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq01v2.jpg" /> 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC&#160;and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD&#160;~ 0&#160;&#215; 10-6&#160;&#197;-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 &#215; 10-6&#160;&#197;-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted&#160;from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) &#197;-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" />, where&#160;Icoh and Iinc&#160;are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 &#215; 10-6 &#197;-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 &#215; 10-6 &#197;-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) &#197;-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq05v2.jpg" />, where&#160;Icoh and Iinc&#160;are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0&#160;&#215; 10-6 &#197;-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 &#215; 10-6 &#197;-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4.jpg" /> 
Figure 2:&#160;Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2&#160;&#215; 10-2 &#197;-2)&#160;and tail region (~4.5 &#215; 10-6 &#197;-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v4large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5.jpg" /> 
Figure 2:&#160;Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region&#160;(~0&#160;&#215; 10-2 &#197;-2)&#160;and headgroup&#160;region (~4.5 &#215; 10-6 &#197;-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62396/62396fig2v5large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62396">Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions</a>. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.

Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

La comprensión de las membranas celulares y su función ha evolucionado notablemente en las últimas décadas. La visión anterior de las membranas celulares como bicapas lipídicas pasivas que definen los límites celulares y albergan proteínas de membrana1 se ha transformado gradualmente en un modelo dinámico en el que las bicapas lipídicas desempeñan un papel importante en la regulación de los procesos biológicos vitales, incluida la señalización celular, el intercambio molecular y la función de las proteínas, por nombrar algunos2,3,4,5,6. Esta comprensión de que las membranas celulares son altamente dinámicas, en constante remodelación y redistribución molecular, ha impulsado exploraciones científicas más allá de las estructuras de equilibrio de las membranas7,8,9. En consecuencia, se han desarrollado múltiples enfoques para estudiar los diversos modos dinámicos en las membranas lipídicas biológicas y bioinspiradas. Hasta la fecha, la mayoría de estos estudios se han centrado principalmente en los movimientos moleculares difusivos10,11,12,13 y las fluctuaciones macroscópicas de la forma14,15,16,dejando un vacío significativo en la comprensión de la dinámica intermedia de la membrana, es decir, las fluctuaciones colectivas de los conjuntos de lípidos que consisten en unos pocos 10-100 de moléculas de lípidos. Estas dinámicas ocurren en escalas de longitud de pocas decenas a pocas 100 Å y en escalas de tiempo de sub-ns a unos pocos cientos de ns (ver Figura 1),referidas aquí como escalas mesoscópicas. De hecho, es en estas escalas que la actividad biológica clave tiene lugar a nivel de membrana17. Esto incluye la brotación viral18,la canalización19y las interacciones membrana-proteína20. También es importante señalar que el panorama energético de las proteínas de membrana21,22 muestra que los cambios conformacionales en las proteínas, necesarios para su papel regulador, ocurren en las escalas de tiempons 23 de fluctuaciones colectivas de la membrana, enfatizando aún más la importancia de la dinámica mesoscópica en la función biológica de las membranas celulares y sus análogos bioinspirados20. Este artículo se centra en los dos modos dinámicos mesoscópicos primarios en las membranas lipídicas, a saber, las fluctuaciones de flexión y las fluctuaciones de espesor.
El principal desafío al sondear directamente estos modos de fluctuación es la dificultad de acceder simultáneamente a sus escalas espaciales y temporales utilizando métodos de espectroscopia estándar. El otro desafío es que las técnicas de contacto directo podrían afectar las mismas fluctuaciones que se supone que miden16. Esto se ve agravado por la complejidad composicional y estructural de las membranas biológicas24,25,lo que resulta en características de membrana no homogéneas, incluida la formación de dominios lipídicos26,27,28,29,30 y la asimetría de membrana31,32,33, que exigen sondas selectivas para comprender la dinámica de diferentes características de la membrana. Afortunadamente, estos desafíos pueden superarse con métodos de espectroscopia de neutrones no invasivos, como el eco de espín de neutrones (NSE), que inherentemente accede a las escalas de longitud y tiempo requeridas, y permiten además estudios de características selectivas de la membrana sin cambiar su entorno fisicoquímico34. De hecho, en los últimos años la espectroscopia NSE se ha convertido en una sonda única y poderosa de dinámica colectiva demembranas 35. Los resultados de los estudios de NSE sobre membranas lipídicas han producido nuevos conocimientos sobre las propiedades mecánicas36,37 y viscoelásticas38,39 de las membranas lipídicas y han arrojado nueva luz sobre su papel potencial en la función biológica40,41.
La técnica de espectroscopia NSE se basa en un diseño de instrumento interferométrico, propuesto por primera vez por Mezei42,utilizando una serie de aletas de espín y bobinas magnéticas para controlar la precesión del espín de neutrones a medida que los neutrones atraviesan el instrumento. El diseño se basa en el reflejo magnético de los elementos del campo magnético con respecto a la posición de la muestra (Figura 1A). Esto implica que en ausencia de intercambio de energía entre el neutrón y la muestra, el neutrón realiza el mismo número de precesiones de espín, en direcciones opuestas, en la primera y segunda mitad del instrumento (nótese el π-flipper entre las dos bobinas de precesión). Como resultado, el estado de espín final del neutrón permanece sin cambios en relación con el estado inicial, un fenómeno conocido como espín-eco (ver neutrón transparente en la Figura 1A). Sin embargo, cuando el neutrón interactúa energéticamente con la muestra, el intercambio de energía modifica el número de precesiones de espín en la segunda mitad del instrumento, lo que lleva a un estado de espín final diferente (ver Figura 1A). Esto se detecta experimentalmente como una pérdida en la polarización, como se mostrará más adelante en este artículo. Para obtener más detalles sobre la técnica NSE, se remite al lector a los documentos técnicos dedicados42,43,44,45.
Aquí, se presenta una descripción simplificada para proporcionar una estimación aproximada de la longitud y las escalas de tiempo accesibles con NSE. Las escalas de longitud están determinadas por el rango de transferencias de vector de onda alcanzables, Q = 4π sin θ/λ, donde 2θ es el ángulo de dispersión y λ es la longitud de onda del neutrón. Se puede ver que Q está establecido por el rango de longitud de onda y la extensión de rotación del segundo brazo del espectrómetro (ver Figura 1A). Un rango Qtípico en los espectrómetros NSE es ~ 0.02-2 Å-146,47y hasta 0.01-4 Å-1 con actualizaciones recientes48,49, correspondientes a escalas espaciales de ~ 1-600 Å. Por otro lado, la escala de tiempo accesible se calcula a partir del ángulo de precesión total (o fase) adquirido por el neutrón dentro de las bobinas de precesión magnética, y se encuentra que esde 50: <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq12v5.jpg"> . En esta expresión, t es el tiempo de Fourier definido como <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq13v2.jpg"> , donde es la relación <img alt="Equation 50" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq50v2.jpg"> giromagnética de neutrones, <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg"> es la longitud de la bobina y es la fuerza del campo magnético de <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> la bobina. Vale la pena señalar que el tiempo de Fourier es una cantidad que depende estrictamente de la geometría del instrumento, la intensidad del campo magnético y la longitud de onda de los neutrones. Por ejemplo, utilizando neutrones de longitud de onda <img alt="Equation 70" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq70v6.jpg"> = 8 Å y ajustes del instrumento de <img alt="Equation 51" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq51v6.jpg">   = 1,2 m y <img alt="Equation 52" src="/files/ftp_upload/62396/62396eq52v6.jpg"> = 0,4 T, el tiempo de Fourier se calcula en t ~ 50 ns. Experimentalmente, el tiempo de Fourier se ajusta cambiando la corriente en las bobinas de precesión (es decir, la intensidad del campo magnético) o utilizando diferentes longitudes de onda de neutrones, lo que resulta en escalas de tiempo típicas de NSE de ~ 1 ps a 100 ns. Sin embargo, las actualizaciones recientes en los espectrómetros NSE han permitido el acceso a tiempos Fourier más largos, hasta ~ 400 ns en el espectrómetro J-NSE-Phoenix en el Heinz Maier-Leibnitz Zentrum51 y el espectrómetro SNS-NSE en el Laboratorio Nacional Oak Ridge48,y hasta ~ 1,000 ns en el espectrómetro IN15 NSE en el Institut Laue-Langevin (ILL)49. 
Además del acceso directo a la escala de tiempo y longitud de la dinámica de membranas, NSE tiene las capacidades inherentes de la sensibilidad a los isótopos de neutrones52. Específicamente, la capacidad de los neutrones para interactuar de manera diferente con los isótopos del hidrógeno, el elemento más abundante en los sistemas biológicos, da como resultado una densidad de longitud de dispersión de neutrones diferente,34 o NSLD (el equivalente al índice óptico de refracción50),cuando el protio es sustituido por deuterio. Esto permite un enfoque conocido como variación de contraste, que se usa comúnmente para resaltar características específicas de la membrana u ocultar otras; este último escenario se conoce como coincidencia de contraste. Una aplicación frecuente de variación/coincidencia de contraste es la sustitución de agua (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) por agua pesada o D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å -2) para amplificar la señal de neutrones de las membranas lipídicas protiatadas (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). Este enfoque es altamente efectivo en estudios de estructura de membrana porque la penetración de D2O en la región del grupo de cabeza de la membrana permite la determinación precisa de los espesores de la membrana (ver Figura 2A,panel izquierdo) y de la ubicación de diferentes subgrupos lipídicos cuando se aplican modelos más sofisticados53,54. Este artículo destaca algunos ejemplos sobre el uso de la variación de contraste para estudios de dinámica colectiva en membranas biomiméticas y características de membrana seleccionadas.
Aquí, la efectividad de NSE para proporcionar información única sobre las propiedades dinámicas y funcionales de la membrana se ilustra a través de ejemplos tangibles de estudios de NSE en sistemas de membrana lipídica modelo y biológicamente relevantes con énfasis en la dinámica de mesoescala en membranas independientes, en forma de suspensiones liposomales. Para las mediciones de NSE de la dinámica de la membrana en el plano, se remite al lector a publicaciones dedicadas a la espectroscopia de espín-eco de neutrones de incidencia de pastoreo (GINSES)55,56 y otros estudios de pilas de membrana multilamelar alineadas57,58,59,60.
Para simplificar, este artículo destaca tres esquemas diferentes de deuteración de membrana ilustrados en un sistema de bicapa lipídica de formación de dominios o separación de fases bien estudiado de mezclas de 1,2-ditiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)61,62. Los dos lípidos se caracterizan por un desajuste en la longitud de su cadena de hidrocarburos (14 carbonos/cola en DMPC vs 18 carbonos/cola en DSPC) y su temperatura de transición gel-fluido (Tm, DMPC = 23 °C vs Tm, DSPC = 55 °C). Esto da como resultado la separación de fases laterales en membranas DMPC:DSPC a temperaturas entre las temperaturas de transición superior e inferior de la mezcla63. Los esquemas de deuteración considerados aquí se eligen para demostrar los diferentes modos dinámicos accesibles en las mediciones de NSE en membranas liposomales, a saber, fluctuaciones de flexión, fluctuaciones de espesor y fluctuaciones selectivas de flexión / espesor de dominios laterales. Todas las composiciones lipídicas se informan para las bicapas DMPC:DSPC preparadas a una fracción molar de 70:30, utilizando variantes protiated y perdeuteradas disponibles comercialmente de DMPC y DSPC. Todos los pasos de preparación de la muestra se basan en 4 mL de suspensión liposomal, en D2O, con una concentración de lípidos de 50 mg/mL, para una masa lipídica total de Mtot = 200 mg por muestra.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chloroform (biotech grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>496189</td>
			<td>Biotech. grade, &#8805;99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating water bath</td>
			<td>Julabo</td>
			<td>SE-12</td>
			<td>Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Cambridge Isotopes Laboratories</td>
			<td>DLM-4</td>
			<td>Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Semi-Microbalance</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MS105</td>
			<td>Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof ethanol for molecular biology applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>36360-536</td>
			<td>Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B7990-1</td>
			<td>Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab grade freezer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IU2886D</td>
			<td>Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipids (protaited or perdeuterated)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>varies by lipid</td>
			<td>Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millipore water purifier</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZRQSVP3US</td>
			<td>Direct-Q&#174;&#160;3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological&#160; applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder Set</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610020</td>
			<td>Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick Connect Fittings</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2YDA1 and 2YDA7</td>
			<td>Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>SyringePump.com</td>
			<td>New Era-1000</td>
			<td>Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPX2800</td>
			<td>Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3608</td>
			<td>0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-414</td>
			<td>Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neutron spin echo spectroscopy as a unique probe for lipid membrane dynamics and membrane-protein interactions

Las bicapas lipídicas forman la matriz principal de las membranas celulares y son la plataforma principal para el intercambio de nutrientes, las interacciones proteína-membrana y la brotación viral, entre otros procesos celulares vitales. Para una actividad biológica eficiente, las membranas celulares deben ser lo suficientemente rígidas como para mantener la integridad de la célula y sus compartimentos, pero lo suficientemente fluidas como para permitir que los componentes de la membrana, como las proteínas y los dominios funcionales, se difundan e interactúen. Este delicado equilibrio de las propiedades de la membrana elástica y fluida, y su impacto en la función biológica, requieren una mejor comprensión de la dinámica colectiva de la membrana en escalas de tiempo y duración mesoscópicas de procesos biológicos clave, por ejemplo, deformaciones de membrana y eventos de unión a proteínas. Entre las técnicas que pueden sondear eficazmente este rango dinámico se encuentra la espectroscopia de eco de espín de neutrones (NSE). Combinado con el etiquetado de deuterio, NSE se puede utilizar para acceder directamente a las fluctuaciones de flexión y espesor, así como a la dinámica mesoscópica de características de membrana seleccionadas. Este documento proporciona una breve descripción de la técnica NSE y describe los procedimientos para realizar experimentos de NSE en membranas liposomales, incluidos los detalles de la preparación de muestras y los esquemas de deuteración, junto con instrucciones para la recopilación y reducción de datos. El documento también presenta métodos de análisis de datos utilizados para extraer parámetros clave de la membrana, como el módulo de rigidez de flexión, el módulo de compresibilidad del área y la viscosidad en el plano. Para ilustrar la importancia biológica de los estudios de NSE, se discuten ejemplos seleccionados de fenómenos de membrana sondeado por NSE, a saber, el efecto de los aditivos en la rigidez de flexión de la membrana, el impacto de la formación de dominios en las fluctuaciones de la membrana y la firma dinámica de las interacciones membrana-proteína.

Los estudios de NSE que acceden a las fluctuaciones de flexión se realizan típicamente en un rango Q de ~ (0.04 - 0.2) Å-1. Este rango Q corresponde a escalas de longitud intermedia entre el grosor de la membrana y el radio liposomal, donde domina la dinámica de flexión. La medición en un rango Q extendido puede dar acceso a modos dinámicos adicionales, incluida la difusión liposomal y la dinámica intramembrana. Para obtener más detalles sobre el cruce en la dinámica de membranas a la que accede NSE...

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Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions

Este artículo describe los protocolos para la preparación de muestras, la reducción de datos y el análisis de datos en estudios de eco de espín de neutrones (NSE) de membranas lipídicas. El etiquetado juicioso de los lípidos con deuterio permite el acceso a diferentes dinámicas de membrana en escalas de longitud y tiempo mesoscópicas, sobre las cuales ocurren procesos biológicos vitales.

Espectroscopía de eco de espín de neutrones como una sonda única para la dinámica de la membrana lipídica y las interacciones membrana-proteína

Lipid bilayers form the main matrix of cell membranes and are the primary platform for nutrient exchange, protein-membrane&#160;interactions, and viral ...

Este protocolo describe la preparación de muestras y la reducción de datos necesarias para estudios exitosos de eco de espín de neutrones de fluctuaciones colectivas de membrana relevantes para las funciones biológicas y aplicaciones prácticas de membranas lipídicas. NSE accede directamente a la dinámica de la membrana en las escalas de tiempo de nanosegundos de las funciones clave de la membrana con la ventaja única de la sensibilidad a los isótopos para sondear características selectivas de la membrana inaccesibles con otras técnicas. Los estudios de la dinámica de membranas a nanoescala son esenciales para comprender las propiedades subyacentes de la membrana del mecanismo molecular y las interacciones membrana-proteína implicadas en diversas patologías celulares.El método proporciona a los investigadores nuevos en NSE pautas detalladas sobre el diseño, preparación y caracterización de vesículas lipídicas para experimentos exitosos y el posterior análisis e interpretación de reducción de datos. Demostrando el procedimiento estarán Teshani Kumarage y Julie Nguyen, una estudiante de posgrado y una estudiante de pregrado del laboratorio. Trabajando dentro de una campana, prepare la suspensión lipídica disolviendo los lípidos pesados con precisión en un mililitro de disolvente con mezcla manual.Seque la solución lipídica haciendo un suave movimiento de un gas inerte en el vial mientras lo gira lentamente en ángulo. Para eliminar completamente el disolvente residual, coloque los viales durante la noche en un horno al vacío a 35 grados centígrados. Al día siguiente, hidratar la película lipídica con dos mililitros de agua pesada para obtener una concentración lipídica de 50 miligramos por mililitro y vórtice la suspensión lipídica hidratada hasta que la película lipídica se disuelva por completo.A continuación, realice cinco ciclos de congelación-descongelación almacenando el vial de suspensión lipídica hidratada a menos 80 grados centígrados hasta que se congele. Y luego transferirlo a un baño de agua de 35 grados centígrados para descongelar la suspensión de lípidos. Vórtice la suspensión descongelada hasta que sea homogénea antes de pasar al siguiente ciclo.Antes de comenzar el experimento, ensamble la configuración del extrusor utilizando una membrana de poli-bicarbonato entre dos soportes de membrana y agregue dos filtros de papel en cada lado para proporcionar soporte adicional. Use jeringas de vidrio herméticas para hidratar la membrana de policarbonato pasando 0,3 mililitros de agua pesada a través del conjunto de la membrana varias veces. Después de hidratar la membrana, inserte una jeringa hermética al gas de un mililitro con una solución lipídica de color blanco lechoso preparada en un extremo y una jeringa vacía en el extremo opuesto del aparato extrusor.Una vez que las jeringas estén conectadas, coloque el conjunto en el bloque extrusor. Programe la bomba manteniendo pulsado el botón Velocidad para introducir la velocidad de extrusión y pulse el botón Diámetro para introducir el diámetro de la jeringa. Luego, presione Retirar hasta que la luz se encienda.Presione start y espere a que la muestra comience a dispensar en la jeringa vacía. Presione el botón Detener justo antes de que la jeringa de muestra esté completamente vacía. Grabe el volumen dispensado y, a continuación, mantenga pulsado el botón Tasa hasta que aparezca la fase uno en la pantalla.Manteniendo la luz de retirada apagada, presione el botón de volumen para ingresar el volumen dispensado registrado anteriormente. Presione el botón Tasa nuevamente y use la flecha más arriba a la derecha para acceder a la fase dos. Presione volumen para introducir el mismo valor del volumen dispensado registrado anteriormente.En esta fase, pulse el botón Retirar hasta que la luz Retirar esté encendida. Repita el ciclo para la fase tres presionando el botón de volumen hasta que LP:SE aparezca en la pantalla y configáralo en 20. Finalmente, presione el botón Tasa, acceda a la fase cuatro y presione el botón de volumen para llegar a la función Stop para finalizar la configuración de la bomba.Después de programar la bomba, presione Iniciar para comenzar el ciclo de extrusión. Realice de 15 a 20 ciclos de extrusión antes de recoger la suspensión lipídica extruida de color azul ópalo transparente en un vial limpio para las mediciones. Abra el software DAVE y seleccione reducir datos NSE en el menú Reducción de datos.Cargue los archivos de datos sobre diferentes valores Q utilizando el menú Abrir archivos de eco del archivo. Los archivos cargados aparecerán debajo de los conjuntos de datos disponibles. Haga clic derecho en el archivo seleccionado y etiquételo de acuerdo con la medida a la que corresponde, como Muestra, Celda o Resolución.Con la pestaña Conjunto de datos, agrupo los píxeles del detector en 2 X 2 para mejorar la relación señal/ruido. Aplique el mismo binning a todos los archivos de Resolución, Celda y Ejemplo. Inspeccione los datos en todos los grupos de píxeles y enmascare aquellos con señales deficientes presionando la tecla Fin en el teclado.Presione Entrar para acceder a una ventana emergente para aplicar la misma máscara a las cuatro veces. Los píxeles enmascarados se volverán verdes. Asegúrese de que los datos recopilados estén en forma de una señal de eco.Comience a ajustar el archivo de resolución de la lista de archivos cargados haciendo clic con el botón derecho en el archivo deseado y seleccionando Ajustar operaciones, Ajustar resolución de ecos en el menú emergente. Asegúrese de que los ajustes de las señales de eco produzcan parámetros de ajuste razonables. Para inspeccionar el error asociado a cada parámetro de conexión en todo el detector, seleccione Opciones de imagen y, a continuación, seleccione el parámetro de conexión de interés.Luego, haga clic derecho en la imagen del detector para acceder a una ventana emergente que muestra un mapa de la barra de errores. Si el ajuste sobre un píxel específico no es satisfactorio, reajuste la señal sobre ese píxel seleccionándolo, presionando la pestaña Ajuste y, a continuación, presionando Ajustar píxel. Introduzca nuevos parámetros de inicio para la fase y el período en la ficha Conexión.Reduzca el archivo de ejemplo seleccionando el archivo correspondiente de la lista de archivos cargados y etiquetados. Inspeccione todos los píxeles y enmascare los pobres como se describió anteriormente. Luego, haga clic derecho en el archivo y seleccione Ajustar operaciones, Importar fases.Para el archivo de resolución, ajuste las señales de eco como se describió anteriormente con los valores del período sin cambios y el punto de fase de eco importado de la resolución se ajusta. Introduzca el centro del haz para todos los archivos de datos accediendo a la ficha General e introduciendo los valores del centro del haz X e Y registrados en el experimento. Una vez que se completen los ajustes, calcule la función de dispersión intermedia normalizada haciendo clic derecho en el archivo de muestra deseado de la lista de archivos ajustados y seleccionando Calcular I de Q en el menú emergente.Introduzca la información necesaria para los archivos de resolución y celda y el número de Q-arcs en la ventana emergente y, a continuación, pulse OK para ver los resultados. Observe que los datos en cian muestran una señal deficiente debido a los efectos del borde del detector y deben eliminarse al compilar diferentes conjuntos de datos Q. Finalmente, guarde los conjuntos de datos reducidos como archivos ASCII y guarde toda la sesión como un proyecto DAVE en la carpeta deseada.En este estudio, se realizaron las mediciones NSE de muestras liposomales preparadas con diferentes esquemas de deuteración. Las mediciones de NSE de las fluctuaciones de flexión de la membrana se realizan en liposomas totalmente contrastados. Este esquema de deuteración da como resultado una gran diferencia de longitud de dispersión entre el núcleo de la membrana y el entorno del fluido deuterado, mejorando significativamente la señal de dispersión de las membranas liposomales y mejorando las estadísticas de medición de la dinámica de flexión.Por otro lado, las mediciones NSE de las fluctuaciones del grosor de la membrana de los liposomas muestran desviaciones en relación con la Q a la tercera dependencia de las fluctuaciones de flexión. Para aislar la señal de fluctuación de espesor, la señal obtenida se divide por Q a la tercera y el exceso de dinámica se ajusta a una función lorentzeña en Q.Este método depende de datos de buena calidad, que es más alcanzable con muestras de altas concentraciones y señales de dispersión fuertes. La dinámica sondeada por NSE puede ser explorada sinérgicamente por relaxometría de RMN de deuterio y simulaciones moleculares-dinámicas para ilustrar cómo las estructuras lipídicas moleculares y los motivos de empaquetamiento influyen en las funciones de la membrana.Los estudios de NSE sobre membranas lipídicas arrojan nueva luz sobre la biofísica de membranas, las intrincadas relaciones de la estructura y dinámica de membranas, y cómo afectan las funciones de membrana y las interacciones membrana-proteína.

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Membrane Structure and Components

SCIENTISTS IN ACTION

The Microfluidic Probe: Operation and Use for Localized Surface Processing

La sonda de microfluidos: Operación y Uso de tratamiento de superficies localizadas

Microfluidic devices allow assays to be performed using minute amounts of sample and have recently been used to control the microenvironment of cells. ...

Investigación

Biología

Measuring Plasma Membrane Protein Endocytic Rates by Reversible Biotinylation

Medición de proteína de la membrana de plasma tarifas endocítica por biotinilación reversible

Plasma membrane proteins are a large, diverse group of proteins comprised of receptors, ion channels, transporters and pumps.  Activity of these proteins ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

La determinación de la proteína de membrana de topología usando fluorescencia de Protección de la proteasa (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

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Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

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The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

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Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

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