3.8K Views
•
08:34 min
•
April 16th, 2021
DOI :
April 16th, 2021
•0:04
Introduction
0:50
Generation of Human Kidney Tubuloids From Tissue
3:45
Generation of Human Kidney Tubuloids From Urine
5:02
Expansion of Tubuloid Cultures
7:01
Results: Successful Generation of Human Kidney Tubuloids From Tissue and Urine
7:55
Conclusion
Transcript
Nyre tubuloid kulturer kan etableres fra sundt nyrevæv og fra urin giver mulighed for generering af repræsentative modeller til at studere nyresygdom og fysiologi. Denne protokol giver mulighed for generering af sunde nyre tubuloider fra væv og urin, sidstnævnte er en ikke-invasiv og patient-venlige måde at opnå materiale til generation af kulturer. Tubuloid kulturer kan bruges til at studere nyrefysiologi og til sygdom modellering, såsom smitsomme, ondartede, og arvelige nyresygdomme.
For at generere menneskelige nyre tubuloider fra væv, placere nyrevæv prøve i en milliliter af avancerede DMEM plus plus medium i en 10 centimeter Petri parabol og bruge skalpeller til at hakke vævet i stykker af en cirka en kubik millimeter størrelse. Brug knold og skalpel til at overføre vævsstykkerne til et 15 milliliterrør og vask fadet med fem milliliter frisk medium. Brug en steril 10 milliliter pipette til at overføre mediet til røret.
Sediment vævsstykkerne ved centrifugering og resuspend pellet i tre til fire milliliter kollagenopløsning. Inkuber vævene på en vandret shaker ved 37 grader Celsius og 250 omdrejninger i minuttet i 45 til 60 minutter med kraftig rysten hvert 15. minut. Når suspensionen er homogen, og de fleste vævsstykker er fordøjet, fyldes røret med medium og blandes fem til 10 gange ved inversion.
Centrifugere suspensionen. Hvis pellet er rød, tilsættes en milliliter røde blodlegemer lysis buffer til røret for en fem-minutters inkubation ved stuetemperatur. I slutningen af inkubationen vaskes røret med frisk medium.
Hvis vævsstykker stadig er synlige, skal du genbruge pelleten med fem milliliter frisk medium og filtrere suspensionen gennem en 100 mikron cellesnak i et 50 milliliterrør. Overfør den filtrerede suspension til et nyt 15 milliliterrør til centrifugering, og brug en P1000-pipette indstillet til et kendt volumen til at måle mængden af cellepillen. Genbrug forsigtigt pellet uden at skabe luftbobler og inkubere cellerne i et minut på is.
I slutningen af inkubationen, genbruge pellet i en 70 til 75% volumen af kælderen membran ekstrakt og plade 15 mikroliter dråber af den resulterende suspension i en 37 grader opvarmet multi-brønd celle kultur plade. Når alle dråberne er blevet belagt, inkuberes pladen på hovedet ved 37 grader Celsius i 15 til 20 minutter, tilsæt derefter det passende volumen på 37 grader Celsius opvarmet kulturmedium og inspicere kulturerne under et lysfeltmikroskop. For at generere menneskelige nyre tubuloider fra urin, opdele urinprøven ligeligt mellem 50 milliliter rør og vaske prøverne to gange med 10 til 20 milliliter frisk vask medium pr vask.
Efter den anden vask, genbruge pellets i deres resterende supernatants og pool prøverne i en enkelt 15 milliliter rør for en tredje centrifugering. Mål cellepillevolumenet som demonstreret, og genbrug forsigtigt pelleten uden at skabe luftbobler. Efter et minut inkubation i is, genbruge pellet i en 70 til 75% volumen af kælderen membran ekstrakt og plade 15 mikroliter dråber af den resulterende suspension i 37 grader Celsius opvarmet multi-brønd celle kultur plader som påvist, derefter inkubere dråberne på hovedet i 15 til 20 minutter, før du tilføjer frisk medium og se kulturer ved lys mikroskopi.
Efter en til to uger af hver type kultur, skal du bruge en P1000 pipette til at forstyrre tubuloid dråber i hver brønd ved hjælp af spidsen til at skrabe bunden af brøndene til at indsamle de vedhæftede celler. Træk brønden indholdet i en enkelt 15 milliliter rør, der indeholder 10 milliliter af avancerede DMEM plus plus medium og indsamle tubuloider ved centrifugering. Baseret på pelletens størrelse tilsættes trypsinerstatningsmiddel suppleret med 10 mikromolar Y27632 for en fem minutters inkubation ved 37 grader Celsius.
I slutningen af inkubationen skal du bruge en 1.000 mikroliter pipettespids med en 10 mikroliter pipettespids placeret over spidsen for at pipette tubuloidaffjedringen 20 til 30 gange. Kontroller under mikroskopet for at se, om der stadig er intakte tubuloider i røret. Det mindre end 10% af intakte tubuloider er til stede, fylde røret med frisk avanceret DMEM plus plus plus, og indsamle tubuloider ved centrifugering at tillade pellet volumen, der skal måles som påvist.
Resuspend pellet i en 70 til 75% volumen af kælderen membran ekstrakt og plade 15 mikroliter dråber i en 37 grader Celsius opvarmet multi-godt celle kultur plade. Efter en 15 til 20-minutters omvendt inkubation ved 37 grader Celsius, tilsæt forvarmet kulturmedium til dråberne og inspicere kulturen ved let mikroskopi. Tubuloider genereret fra nyrevævsprøver vises typisk inden for syv dage efter kulturinstitutionen og skal passages inden for en til to uger efter plating.
I urinkulturer vises kompakte tubuloidstrukturer og klæbende celler ca. 14 til 21 dage efter plating, og første passaging forekommer generelt mellem tre og fire uger. Tilstedeværelsen af cystiske epitel tubuloider stiger med hver passage. Den vellykkede generation af menneskelige nyre tubuloid kulturer kan vurderes ved immunohistokemisk farvning for markører udtrykt i rørformede nyre epitel, såsom parret boks gen 8 protein.
En korrekt timing af enzymatisk fordøjelse af vævsmateriale og hurtig behandling af urinprøver er afgørende skridt for det vellykkede resultat af disse protokoller. Den høje effektivitet af etablering af nyre tubuloid kulturer kan bane vejen for patient-specifikke test af narkotika-induceret nefrotoksicitet, en almindelig bivirkning af mange kemoterapier.
Menneskelige nyre tubuloid kulturer repræsenterer en værdifuld in vitro model til at studere nyrefysiologi og sygdom. Tubuloider kan etableres fra nyrevæv (sund og syg) samt urin, sidstnævnte repræsenterer en let opnåelig og mindre invasiv kilde til forskningsmateriale.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved