Génération de tubuloïdes rénaux humains à partir de tissus et d’urine

Les cultures de tubuloïdes rénaux peuvent être établies à partir de tissus rénaux sains et d’urine, ce qui permet de génération de modèles représentatifs pour étudier les maladies rénales et la physiologie. Ce protocole permet la génération de tubuloïdes rénaux sains à partir des tissus et de l’urine, ce dernier étant un moyen non invasif et convivial d’obtenir du matériel pour la génération de cultures. Les cultures tubuloïdes peuvent être utilisées pour étudier la physiologie rénale et pour la modélisation des maladies, telles que les maladies rénales infectieuses, malignes et héréditaires.

Pour générer des tubuloïdes rénaux humains à partir de tissus, placez l’échantillon de tissu rénal dans un millilitre de DMEM plus plus plus moyen avancé dans une boîte de Petri de 10 centimètres et utilisez des scalpels pour hacher le tissu en morceaux d’environ un millimètre cube. Utilisez des pinces et des scalpels pour transférer les morceaux de tissu dans un tube de 15 millilitres et lavez la vaisselle avec cinq millilitres de milieu frais. Utilisez une pipette stérile de 10 millilitres pour transférer le fluide dans le tube.

Sédimenter les morceaux de tissu par centrifugation et resuspender la pastille dans trois à quatre millilitres de solution de collagénase. Incuber les tissus sur un shaker horizontal à 37 degrés Celsius et 250 tours par minute pendant 45 à 60 minutes avec une agitation vigoureuse toutes les 15 minutes. Lorsque la suspension est homogène et que la plupart des morceaux de tissu ont digéré, remplissez le tube de milieu et mélangez cinq à 10 fois par inversion.

Centrifuger la suspension. Si la pastille est rouge, ajoutez un millilitre de tampon de lyse des globules rouges au tube pour une incubation de cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez le tube avec un milieu frais.

Si des morceaux de tissu sont encore visibles, resuspendez la pastille avec cinq millilitres de milieu frais et filtrez la suspension à travers une passoire cellulaire de 100 microns dans un tube de 50 millilitres. Transférer la suspension filtrée dans un nouveau tube de 15 millilitres pour la centrifugation et utiliser une pipette P1000 réglée sur un volume connu pour mesurer le volume de la pastille de cellule. Resuspendez soigneusement la pastille sans créer de bulles d’air et incubez les cellules pendant une minute sur de la glace.

À la fin de l’incubation, remettez en suspension la pastille dans un volume de 70 à 75 % d’extrait de membrane basale et plaquez 15 gouttelettes de microlitres de la suspension résultante dans une plaque de culture cellulaire multipère chauffée à 37 degrés. Lorsque toutes les gouttelettes ont été plaquées, incuber la plaque à l’envers à 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes, puis ajouter le volume approprié de 37 degrés Celsius de milieu de culture réchauffé et inspecter les cultures sous un microscope à fond clair. Pour générer des tubuloïdes rénaux humains à partir de l’urine, divisez l’échantillon d’urine également entre des tubes de 50 millilitres et lavez les échantillons deux fois avec 10 à 20 millilitres de milieu de lavage frais par lavage.

Après le deuxième lavage, remettre en service les granulés dans leurs surnageants résiduels et regrouper les échantillons dans un seul tube de 15 millilitres pour une troisième centrifugation. Mesurez le volume de granulés de la cellule comme démontré et resuspendez soigneusement la pastille sans créer de bulles d’air. Après une minute d’incubation dans la glace, resussuspendez la pastille dans un volume de 70 à 75% d’extrait de membrane basale et plaquez 15 gouttelettes de microlitres de la suspension résultante dans des plaques de culture cellulaire multi-puits chauffées à 37 degrés Celsius comme démontré, puis incuber les gouttelettes à l’envers pendant 15 à 20 minutes avant d’ajouter un milieu frais et de visualiser les cultures par microscopie optique.

Après une à deux semaines de l’un ou l’autre type de culture, utilisez une pipette P1000 pour perturber les gouttelettes de tubuloïde dans chaque puits en utilisant la pointe pour gratter le fond des puits afin de recueillir les cellules attachées. Tirer le contenu du puits dans un seul tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de DMEM avancé plus plus plus milieu et recueillir les tubuloïdes par centrifugation. En fonction de la taille de la pastille, ajouter un agent de remplacement de la trypsine complété par 10 micromolaires Y27632 pour une incubation de cinq minutes à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, utilisez une pointe de pipette de 1 000 microlitres avec une pointe de pipette de 10 microlitres placée sur la pointe pour pipeter la suspension tubuloïde 20 à 30 fois. Vérifiez au microscope si des tubuloïdes intacts sont toujours présents dans le tube. Moins de 10% des tubuloïdes intacts sont présents, remplissent le tube avec du DMEM avancé frais plus plus plus et recueillent les tubuloïdes par centrifugation pour permettre de mesurer le volume de granulés comme démontré.

Resuspendez la pastille dans un volume de 70 à 75% d’extrait de membrane basale et plaquez des gouttelettes de 15 microlitres dans une plaque de culture cellulaire multi-puits chauffée à 37 degrés Celsius. Après une incubation à l’envers de 15 à 20 minutes à 37 degrés Celsius, ajoutez un milieu de culture préchauffé aux gouttelettes et inspectez la culture par microscopie optique. Les tubuloïdes générés à partir d’échantillons de tissu rénal apparaissent généralement dans les sept jours suivant l’établissement de la culture et doivent être passés dans les une à deux semaines suivant le placage.

Dans les cultures d’urine, des structures tubuloïdes compactes et des cellules adhérentes apparaissent environ 14 à 21 jours après le placage et le premier passage se produit généralement entre trois et quatre semaines. La présence de tubuloïdes épithéliaux kystiques augmente à chaque passage. La génération réussie de cultures de tubuloïdes rénaux humains peut être évaluée par coloration immunohistochimique pour les marqueurs exprimés dans l’épithélium rénal tubulaire, tels que la protéine 8 du gène de boîte appariée.

Un timing correct de la digestion enzymatique du matériel tissulaire et un traitement rapide des échantillons d’urine sont des étapes cruciales pour le succès de ces protocoles. La grande efficacité de l’établissement de cultures de tubuloïdes rénaux peut ouvrir la voie à des tests spécifiques au patient de la néphrotoxicité induite par les médicaments, un effet secondaire courant de nombreux agents chimiothérapeutiques.