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April 16th, 2021
DOI :
April 16th, 2021
•0:04
Introduction
0:50
Generation of Human Kidney Tubuloids From Tissue
3:45
Generation of Human Kidney Tubuloids From Urine
5:02
Expansion of Tubuloid Cultures
7:01
Results: Successful Generation of Human Kidney Tubuloids From Tissue and Urine
7:55
Conclusion
Transcript
गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को स्वस्थ गुर्दे के ऊतकों से और मूत्र से स्थापित किया जा सकता है जो प्रतिनिधि मॉडल की पीढ़ी के लिए गुर्दे की बीमारी और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल ऊतक और मूत्र से स्वस्थ गुर्दे ट्यूबुलॉइड की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, बाद संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए सामग्री प्राप्त करने का एक गैर-विकासशील और रोगी के अनुकूल तरीका है। ट्यूबुलाइड संस्कृतियों का उपयोग गुर्दे के शरीर विज्ञान का अध्ययन करने और संक्रामक, घातक और वंशानुगत गुर्दे की बीमारियों जैसे रोग मॉडलिंग के लिए किया जा सकता है।
ऊतक से मानव गुर्दे ट्यूबुलोइड उत्पन्न करने के लिए, गुर्दे के ऊतकों के नमूने को 10 सेंटीमीटर पेट्री डिश में उन्नत डीएमईएम प्लस प्लस प्लस प्लस माध्यम के एक मिलीलीटर में रखें और ऊतक को लगभग एक घन मिलीमीटर आकार के टुकड़ों में कीमा बनाने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। ऊतक के टुकड़ों को 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करने और ताजा माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ पकवान धोने के लिए संदंश और स्केलपेल का उपयोग करें। माध्यम को ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बाँझ 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें।
तलछट अपकेंद्रित्र द्वारा ऊतक के टुकड़ों को तलछट और कोलेजन समाधान के तीन से चार मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। एक क्षैतिज शेखर पर ऊतकों को ३७ डिग्री सेल्सियस और २५० क्रांतियों प्रति मिनट ४५ से ६० मिनट के लिए जोरदार मिलाते हुए हर 15 मिनट के साथ इनक्यूबेट करें । जब निलंबन समरूप हो और अधिकांश ऊतक टुकड़े पचा जाएं, तो ट्यूब को मध्यम से भरें और उलटा करके पांच से 10 बार मिलाएं।
निलंबन को सेंट्रलाइज करें। यदि गोली लाल है, तो कमरे के तापमान पर पांच मिनट के इनक्यूबेशन के लिए ट्यूब में लाल रक्त कोशिका लाइसिस बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के अंत में, ट्यूब को ताजा माध्यम से धोएं।
यदि ऊतक के टुकड़े अभी भी दिखाई दे रहे हैं, ताजा माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से खर्च करें और एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एक १०० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से निलंबन फिल्टर । अपकेंद्रित्र के लिए फ़िल्टर किए गए निलंबन को एक नए 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें और सेल पेलेट की मात्रा को मापने के लिए एक ज्ञात मात्रा में P1000 पिपेट सेट का उपयोग करें। हवा के बुलबुले बनाने और बर्फ पर एक मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट के बिना सावधानी से गोली को फिर से खर्च करें।
इनक्यूबेशन के अंत में, बेसमेंट झिल्ली निकालने और प्लेट की 70 से 75% मात्रा में गोली को फिर से खर्च करें 37 डिग्री गर्म बहु-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट में परिणामी निलंबन की 15 माइक्रोलीटर बूंदों। जब सभी बूंदों को चढ़ाया गया है, तो प्लेट को 15 से 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उल्टा करें, फिर 37 डिग्री सेल्सियस गर्म संस्कृति माध्यम की उचित मात्रा जोड़ें, और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृतियों का निरीक्षण करें। मूत्र से मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड उत्पन्न करने के लिए, मूत्र के नमूने को समान रूप से 50 मिलीलीटर ट्यूबों के बीच विभाजित करें और नमूनों को दो बार 10 से 20 मिलीलीटर ताजा धोने के माध्यम से धोएं।
दूसरी धुलाई के बाद, छर्रों को उनके अवशिष्ट अधिनाटियों में फिर से खर्च करें और एक तिहाई अपकेंद्रित्र के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में नमूनों को पूल करें। सेल गोली की मात्रा को मापने के रूप में प्रदर्शन किया और ध्यान से हवा बुलबुले बनाने के बिना गोली resuspend। बर्फ में एक मिनट इनक्यूबेशन के बाद, तहखाने झिल्ली निकालने और प्लेट की एक 70 से 75% मात्रा में गोली को फिर से खर्च करें 37 डिग्री सेल्सियस गर्म बहु-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में जिसके परिणामस्वरूप निलंबन की 15 माइक्रोलीटर बूंदों का प्रदर्शन किया गया है, फिर ताजा माध्यम जोड़ने और प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृतियों को देखने से पहले 15 से 20 मिनट के लिए बूंदों को उल्टा करें।
किसी भी प्रकार की संस्कृति के एक से दो सप्ताह के बाद, संलग्न कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए कुओं के नीचे को कुरेदने के लिए टिप का उपयोग करके प्रत्येक अच्छी तरह से ट्यूबुलाइड बूंदों को बाधित करने के लिए एक P1000 पिपेट का उपयोग करें। उन्नत डीएमईएम प्लस प्लस प्लस मीडियम के 10 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अच्छी सामग्री खींचें और अपकेंद्रित्र द्वारा ट्यूबुलाइड एकत्र करें। गोली के आकार के आधार पर, 37 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के इनक्यूबेशन के लिए 10 माइक्रोमोलर Y27632 के साथ पूरक ट्रिप्सिन रिप्लेसमेंट एजेंट जोड़ें।
इनक्यूबेशन के अंत में, ट्यूबुलाइड निलंबन को 20 से 30 बार पाइपेट करने के लिए टिप पर रखे गए 10 माइक्रोलिटर पिपेट टिप के साथ 1, 000 माइक्रोलिटर पिपेट टिप का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करें कि क्या ट्यूब के भीतर अभी भी कोई बरकरार ट्यूबुलाइड मौजूद हैं। यह 10% से कम बरकरार ट्यूबुलाइड मौजूद हैं, ट्यूब को ताजा उन्नत डीएमईएम प्लस प्लस प्लस से भरें, और पैलेट की मात्रा को प्रदर्शित करने की अनुमति देने के लिए अपकेंद्रित्र द्वारा ट्यूबुलाइड एकत्र करें।
बेसमेंट झिल्ली निकालने और प्लेट की 70 से 75% मात्रा में गोली को 37 डिग्री सेल्सियस गर्म बहु-वेल सेल कल्चर प्लेट में 15 माइक्रोलीटर बूंदों को फिर से खर्च करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन 15 से 20 मिनट के उल्टा होने के बाद, बूंदों में पूर्व-गर्म संस्कृति माध्यम जोड़ें और हल्के माइक्रोस्कोपी द्वारा संस्कृति का निरीक्षण करें। गुर्दे के ऊतकों के नमूनों से उत्पन्न ट्यूबुलॉइड आमतौर पर संस्कृति स्थापना के सात दिनों के भीतर दिखाई देते हैं और चढ़ाना के एक से दो सप्ताह के भीतर पारित होने की आवश्यकता होती है।
मूत्र संस्कृतियों में, कॉम्पैक्ट ट्यूबुलाइड संरचनाएं और अनुयायी कोशिकाएं चढ़ाना और पहली पासेजिंग के लगभग 14 से 21 दिनों के बाद दिखाई देती हैं आम तौर पर तीन और चार सप्ताह के बीच होती हैं। प्रत्येक मार्ग के साथ सिस्टिक एपिथेलियल ट्यूबुलॉइड की उपस्थिति बढ़ जाती है। मानव गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की सफल पीढ़ी का मूल्यांकन ट्यूबलर किडनी एपिथेलियम में व्यक्त मार्कर के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला द्वारा किया जा सकता है, जैसे कि युग्मित बॉक्स जीन 8 प्रोटीन।
ऊतक सामग्री के एंजाइमेटिक पाचन का सही समय और मूत्र के नमूनों की तेजी से प्रसंस्करण इन प्रोटोकॉल के सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की स्थापना की उच्च दक्षता दवा-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिकिटी के रोगी-विशिष्ट परीक्षण के लिए मार्ग प्रशस्त कर सकती है, जो कई कीमोथैरेपी का एक आम दुष्प्रभाव है।
मानव गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों गुर्दे शरीर विज्ञान और रोग का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान इन विट्रो मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। ट्यूबुलॉइड को गुर्दे के ऊतकों (स्वस्थ और रोगग्रस्त) के साथ-साथ मूत्र से स्थापित किया जा सकता है, बाद में अनुसंधान सामग्री के आसानी से प्राप्य और कम आक्रामक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं।
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