신장 tubuloid 배양은 건강한 신장 조직및 신장병 및 생리학을 공부하는 대표적인 모형의 생성을 허용하는 소변에서 설치될 수 있습니다. 이 프로토콜은 조직과 소변에서 건강한 신장 tubuloids의 생성을 허용, 후자는 문화의 세대에 대한 자료를 얻기의 비 침습적이고 환자 친화적 인 방법입니다. Tubuloid 배양은 신장 생리학을 공부하고 감염성, 악성 및 유전 신장 질환과 같은 질병 모델링을 위해 사용될 수 있습니다.
조직에서 인간의 신장 튜룰로이드를 생성하려면 신장 조직 샘플을 고급 DMEM 플러스 플러스 배지의 1 밀리리터에 넣고 10센티미터 페트리 접시에 넣고 메스를 사용하여 조직을 약 1 입방 밀리미터 크기의 조각으로 다진다. 집게와 메스를 사용하여 티슈 조각을 15 밀리리터 튜브로 옮기고 신선한 배지 5밀리리터로 접시를 씻으십시오. 멸균 10 밀리리터 파이펫을 사용하여 배지를 튜브로 옮기십시오.
원심분리에 의한 조직 조각을 퇴적시키고 콜라게나아제 용액의 3~4밀리리터에서 펠릿을 재보설한다. 수평 셰이커에 티슈를 37도, 분당 250회전에서 45~60분간 배양하여 15분마다 격렬한 흔들림을 가합니다. 현탁액이 균일하고 대부분의 조직 조각이 소화되면 튜브를 중간으로 채우고 반전으로 5 ~ 10 번 섞습니다.
서스펜션원심분리. 펠릿이 적색인 경우 실온에서 5분 동안 튜브에 적혈구 용해 버퍼 1밀리리터를 넣습니다. 인큐베이션이 끝나면 신선한 매체로 튜브를 씻으십시오.
조직의 조각이 여전히 볼 수 있는 경우, 신선한 매체의 5 밀리 리터와 펠 릿을 다시 하 고 50 밀리 리터 튜브에 100 미크론 세포 여과기를 통해 현탁액을 필터링. 원심분리를 위한 새로운 15 밀리리터 튜브로 여과된 서스펜션을 전송하고 알려진 부피로 설정된 P1000 파이펫을 사용하여 셀 펠릿의 부피를 측정한다. 조심스럽게 기포를 만들지 않고 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 1 분 동안 세포를 배양.
인큐베이션의 끝에서, 37도 온난한 다중세포 배양판에서 그 결과 현탁액의 지하 막 추출물 및 플레이트 15 마이크로리터 액적의 70~ 75%의 부피에서 펠릿을 재연한다. 모든 물방울이 도금되었을 때, 플레이트를 섭씨 37도에서 15~20분 동안 거꾸로 배양한 다음, 37°C의 적절한 부피를 추가하고 밝은 시야 현미경으로 배양을 검사합니다. 소변에서 인간의 신장 관질을 생성하려면 소변 샘플을 50 밀리리터 튜브 사이에 균등하게 나누고 세척 당 신선한 세척 매체의 10 ~20 밀리리터로 샘플을 두 번 세척하십시오.
두 번째 세척 후 잔류 슈퍼나티에 펠릿을 다시 중단하고 샘플을 15밀리리터 튜브에 풀로 세 번째 원심분리를 합니다. 세포 펠릿 볼륨을 입증한 대로 측정하고 기포를 만들지 않고 펠릿을 조심스럽게 재보설합니다. 얼음에서 1 분 배양 후, 지하 멤브레인 추출물의 70 ~ 75 %의 부피와 37섭씨로 생성된 현탁액의 15 마이크로 리터 방울을 다시 분리한 다음, 입증 된 바와 같이 다중 우물 세포 배양 판을 15 ~ 20 분 동안 거꾸로 배양한 다음 신선한 배지를 추가하고 빛 마이크로 카피를 통해 배양을 볼 수 있습니다.
문화의 어느 모형의 1 2 주 후에, P1000 파이펫을 사용하여 연결된 세포를 수집하기 위하여 우물의 바닥을 긁어내는 팁을 사용하여 각 우물에 있는 tubuloid 물방울을 방해합니다. 고급 DMEM 플러스 플러스 매체의 10 밀리리터를 포함하는 단일 15 밀리리터 튜브에 우물 내용을 당기고 원심 분리에 의해 튜블러드를 수집합니다. 펠릿의 크기에 따라 섭씨 37도에서 5분 동안 10마이크로몰러 Y27632로 보충된 트립신 교체제를 추가합니다.
인큐베이션의 끝에서, 10 마이크로 리터 파이펫 팁과 함께 1, 000 마이크로 리터 파이펫 팁을 사용하여 튜브룰로이드 서스펜션을 20 ~ 30 번 피펫하십시오. 현미경아래에서 튜브 내에 그대로 튜룰로이드가 남아 있는지 확인하십시오. 그대로 튜블러이드의 10% 미만이 존재하고, 새로운 고급 DMEM 플러스 플러스로 튜브를 채우고, 원심분리로 튜블러드를 수집하여 펠릿 부피를 시연된 대로 측정할 수 있도록 한다.
37섭씨에서 70~75%의 지하 멤브레인 추출물과 15마이크로리터 물방울을 37도 따뜻하게 데워진 다중 세포 배양판으로 펠릿을 재차 판한다. 섭씨 37도에서 15~20분 거꾸로 배양한 후, 미리 따뜻해지는 배양 매체를 물방울에 추가하고 가벼운 현미경으로 배양을 검사합니다. 신장 조직 견본에서 생성된 tubuloids는 전형적으로 문화 설치의 7 일 안에 나타나고 도금의 1 2 주 안에 통과될 필요가 있습니다.
소변 배양에서, 소형 tubuloid 구조 및 부착 세포는 도금 후 약 14 21 일 나타나고 첫번째 패세이징은 일반적으로 3 4 주 사이에서 생깁니다. 낭포성 상피 관부의 존재는 각 통로에 따라 증가합니다. 인간 신장 관형 배양의 성공적인 생성은 쌍상자 유전자 8 단백질과 같은 관 신장 상피에서 발현된 마커에 대한 면역히스토케미컬 염색에 의해 평가될 수 있다.
조직 물질의 효소 소화의 정확한 타이밍과 소변 샘플의 빠른 처리는 이러한 프로토콜의 성공적인 결과를 위한 중요한 단계입니다. 신장 tubuloid 배양의 설치의 높은 효율성은 많은 화학요법의 일반적인 부작용인 약물 유도 신장 독성의 환자 특정 시험을 위한 도로를 포장할 수 있습니다.