3.8K Views
•
08:34 min
•
April 16th, 2021
DOI :
April 16th, 2021
•0:04
Introduction
0:50
Generation of Human Kidney Tubuloids From Tissue
3:45
Generation of Human Kidney Tubuloids From Urine
5:02
Expansion of Tubuloid Cultures
7:01
Results: Successful Generation of Human Kidney Tubuloids From Tissue and Urine
7:55
Conclusion
Transcript
Nyre tubuloid kulturer kan etableres fra sunt nyrevev og fra urin slik at generering av representative modeller for å studere nyresykdom og fysiologi. Denne protokollen tillater generering av sunne nyre tubuloider fra vev og urin, sistnevnte er en ikke-invasiv og pasientvennlig måte å skaffe materiale til generering av kulturer. Tubuloidkulturer kan brukes til å studere nyrefysiologi og for sykdomsmodellering, for eksempel smittsomme, ondartede og arvelige nyresykdommer.
For å generere menneskelige nyre tubuloider fra vev, plasser nyrevevsprøven i en milliliter avansert DMEM pluss pluss medium i en 10 centimeter Petri-tallerken og bruk skalpeller for å hakke vevet i stykker av omtrent en kubikkmillimeter størrelse. Bruk tang og skalpeller for å overføre vevsstykkene til et 15 milliliter rør og vask parabolen med fem milliliter friskt medium. Bruk en steril pipette på 10 milliliter til å overføre mediet til røret.
Sediment vevet biter ved sentrifugering og resuspend pellet i tre til fire milliliter kollagenoppløsning. Inkuber vevet på en horisontal shaker ved 37 grader Celsius og 250 omdreininger per minutt i 45 til 60 minutter med kraftig risting hvert 15. Når suspensjonen er homogen og de fleste vevsstykkene har fordøyd, fyll røret med medium og bland fem til 10 ganger ved inversjon.
Sentrifuger suspensjonen. Hvis pelletsen er rød, tilsett en milliliter rød blodcelle lysisbuffer til røret for en fem minutters inkubasjon ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, vask røret med friskt medium.
Hvis biter av vev fortsatt er synlige, resuspend pellet med fem milliliter friskt medium og filtrere suspensjonen gjennom en 100 mikron celle sil inn i en 50 milliliter rør. Overfør den filtrerte suspensjonen til et nytt 15 milliliterrør for sentrifugering og bruk en P1000 pipette satt til et kjent volum for å måle volumet på cellepelleten. Resuspend pellet forsiktig uten å skape luftbobler og inkubere cellene i ett minutt på is.
På slutten av inkubasjonen, resuspender pellet i et 70 til 75% volum kjellermembranekstrakt og plate 15 mikroliterdråper av den resulterende suspensjonen i en 37 graders oppvarmet multi-brønn cellekulturplate. Når alle dråpene er belagt, inkuber platen opp ned ved 37 grader Celsius i 15 til 20 minutter, legg deretter til riktig volum på 37 grader Celsius oppvarmet kulturmedium, og inspiser kulturene under et brightfield mikroskop. For å generere menneskelige nyre tubuloider fra urin, del urinprøven likt mellom 50 milliliter rør og vask prøvene to ganger med 10 til 20 milliliter fersk vask medium per vask.
Etter den andre vasken, resuspend pellets i sine gjenværende supernatanter og pool prøvene i en enkelt 15 milliliter rør for en tredje sentrifugering. Mål cellepelletvolumet som demonstrert og resuspender pelletsen forsiktig uten å skape luftbobler. Etter ett minutts inkubasjon i is, resuspend pellet i en 70 til 75% volum kjeller membran ekstrakt og plate 15 mikroliter dråper av den resulterende suspensjonen i 37 grader Celsius oppvarmet multi-brønn celle kultur plater som demonstrert, deretter inkubere dråpene opp ned i 15 til 20 minutter før du legger til friskt medium og ser på kulturer ved lys mikroskopi.
Etter en til to uker med begge typer kultur, bruk en P1000 pipette for å forstyrre tubuloiddråpene i hver brønn ved hjelp av spissen for å skrape bunnen av brønnene for å samle de vedlagte cellene. Trekk brønninnholdet i et enkelt 15 milliliterrør som inneholder 10 milliliter avanserte DMEM pluss pluss middels og samle tubuloidene ved sentrifugering. Basert på størrelsen på pellets, legg til trypsin erstatningsmiddel supplert med 10 mikromolar Y27632 for en fem minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius.
På slutten av inkubasjonen, bruk en 1000 mikroliter pipettespiss med en 10 mikroliter pipettespiss plassert over spissen for å pipette tubuloidfjæringen 20 til 30 ganger. Sjekk under mikroskopet for å se om det fortsatt finnes intakte tubuoider i røret. Det er færre enn 10% av intakte tubuloider til stede, fyll røret med fersk avansert DMEM pluss pluss pluss, og samle tubuloider ved sentrifugering for å tillate pelletsvolumet å bli målt som demonstrert.
Resuspend pellet i en 70 til 75% volum kjellermembran ekstrakt og plate 15 mikroliter dråper i en 37 grader Celsius oppvarmet multi-brønn celle kultur plate. Etter en 15 til 20 minutters opp-ned inkubasjon ved 37 grader Celsius, tilsett forvarmet kulturmedium til dråpene og inspiser kulturen ved lysmikroskopi. Tubuloider generert fra nyrevevsprøver vises vanligvis innen syv dager etter kulturetablissement og må passeres innen en til to uker etter plating.
I urinkulturer vises kompakte tubuloidstrukturer og tilhørende celler ca. 14 til 21 dager etter plating og første passaging oppstår vanligvis mellom tre og fire uker. Tilstedeværelsen av cystiske epitel tubuloider øker med hver passasje. Den vellykkede generasjonen av humane nyre tubuloidkulturer kan vurderes ved immunhiistokjemisk farging for markører uttrykt i rørformet nyreepitelet, for eksempel parret boksgen 8 protein.
En riktig tidspunkt for enzymatisk fordøyelse av vevsmateriale og rask behandling av urinprøver er avgjørende trinn for det vellykkede resultatet av disse protokollene. Den høye effektiviteten ved etablering av nyre tubuloidkulturer kan bane vei for pasientspesifikk testing av legemiddelindusert nefrotoksisitet, en vanlig bivirkning av mange kjemoterapeutiske midler.
Menneskelige nyre tubuloid kulturer representerer en verdifull in vitro modell for å studere nyre fysiologi og sykdom. Tubuloider kan etableres fra nyrevev (sunt og sykt) samt urin, sistnevnte representerer en lett oppnåelig og mindre invasiv kilde til forskningsmateriale.
Explore More Videos
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved