3.8K Views
•
08:34 min
•
April 16th, 2021
DOI :
April 16th, 2021
•0:04
Introduction
0:50
Generation of Human Kidney Tubuloids From Tissue
3:45
Generation of Human Kidney Tubuloids From Urine
5:02
Expansion of Tubuloid Cultures
7:01
Results: Successful Generation of Human Kidney Tubuloids From Tissue and Urine
7:55
Conclusion
Transcript
Culturas tubuloides renais podem ser estabelecidas a partir de tecido renal saudável e da urina permitindo a geração de modelos representativos para estudar doenças renais e fisiologia. Este protocolo permite a geração de tubuloides renais saudáveis a partir de tecido e urina, sendo este último uma forma não invasiva e amigável ao paciente de obter material para geração de culturas. Culturas tubuloides podem ser usadas para estudar fisiologia renal e modelagem de doenças, como doenças renais infecciosas, malignas e hereditárias.
Para gerar tubuloides renais humanos a partir do tecido, coloque a amostra de tecido renal em um mililitro de DMEM avançado mais mais meio em uma placa de Petri de 10 centímetros e use bisturis para picar o tecido em pedaços de aproximadamente um milímetro cúbico. Use fórceps e bisturis para transferir os pedaços de tecido para um tubo de 15 mililitros e lave o prato com cinco mililitros de meio fresco. Use uma pipeta estéril de 10 mililitros para transferir o meio para o tubo.
Sedimentar os pedaços de tecido por centrifugação e resuspensar a pelota em três a quatro mililitros de solução de colagenase. Incubar os tecidos em um agitador horizontal a 37 graus Celsius e 250 revoluções por minuto durante 45 a 60 minutos com agitação vigorosa a cada 15 minutos. Quando a suspensão for homogênea e a maioria dos pedaços de tecido tiverem digerido, encha o tubo com meio e misture de cinco a dez vezes por inversão.
Centrifugar a suspensão. Se a pelota estiver vermelha, adicione um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos ao tubo para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave o tubo com meio fresco.
Se os pedaços de tecido ainda estiverem visíveis, resuspenja a pelota com cinco mililitros de meio fresco e filtre a suspensão através de um coador de células de 100 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Transfira a suspensão filtrada para um novo tubo de 15 mililitros para centrifugação e use um conjunto de pipeta P1000 para um volume conhecido para medir o volume da pelota celular. Ressuspense cuidadosamente a pelota sem criar bolhas de ar e incubar as células por um minuto no gelo.
Ao final da incubação, resuspenque a pelota em um volume de 70 a 75% de extrato de membrana do porão e placa 15 gotículas de microliter da suspensão resultante em uma placa de cultura celular multi-bem aquecida de 37 graus. Quando todas as gotículas tiverem sido emplacados, incubar a placa de cabeça para baixo a 37 graus Celsius por 15 a 20 minutos, em seguida, adicione o volume apropriado de 37 graus Celsius meio de cultura aquecida, e inspecione as culturas sob um microscópio de campo brilhante. Para gerar tubuloides renais humanos a partir da urina, divida a amostra de urina igualmente entre 50 tubos mililitros e lave as amostras duas vezes com 10 a 20 mililitros de meio de lavagem fresco por lavagem.
Após a segunda lavagem, resuspenja as pelotas em seus sobrenacantes residuais e acumule as amostras em um único tubo de 15 mililitros para uma terceira centrifugação. Meça o volume de pelotas celulares como demonstrado e resuspenja cuidadosamente a pelota sem criar bolhas de ar. Após um minuto de incubação no gelo, resuspenque a pelota em um volume de 70 a 75% de extrato de membrana do porão e placa 15 gotículas microliter da suspensão resultante em 37 graus Celsius aqueceu placas de cultura celular multi-bem como demonstrado, em seguida, incubar as gotículas de cabeça para baixo por 15 a 20 minutos antes de adicionar meio fresco e ver as culturas por microscopia leve.
Após uma a duas semanas de qualquer tipo de cultura, use uma pipeta P1000 para interromper as gotículas tubuloides em cada poço usando a ponta para raspar os fundos dos poços para coletar as células anexadas. Puxe o conteúdo do poço em um único tubo de 15 mililitros contendo 10 mililitros de DMEM avançado mais mais meio e colete os tubuloides por centrifugação. Com base no tamanho da pelota, adicione o agente de substituição de trippsina complementado com 10 micromolar Y27632 para uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter com uma ponta de pipeta de 10 microliter colocada sobre a ponta para pipeta da suspensão tubuloide 20 a 30 vezes. Verifique sob o microscópio para ver se algum tubuloide intacto ainda está presente dentro do tubo. Menos de 10% dos tubuloides intactos estão presentes, encha o tubo com DMEM avançado fresco mais mais plus, e colete os tubuloides por centrífuga para permitir que o volume de pelotas seja medido como demonstrado.
Resuspenque a pelota em um volume de 70 a 75% de extrato de membrana do porão e placa 15 gotículas de microliter em uma placa de cultura celular multi-bem aquecida de 37 graus Celsius. Depois de uma incubação de 15 a 20 minutos de cabeça para baixo a 37 graus Celsius, adicione meio de cultura pré-aquecido às gotículas e inspecione a cultura por microscopia leve. Os tubuloides gerados a partir de amostras de tecido renal normalmente aparecem dentro de sete dias do estabelecimento cultural e precisam ser passagemdos dentro de uma a duas semanas de revestimento.
Nas culturas de urina, estruturas tubuloides compactas e células aderentes aparecem aproximadamente 14 a 21 dias após o revestimento e a primeira passagem geralmente ocorre entre três e quatro semanas. A presença de tubuloides epiteliais císticos aumenta a cada passagem. A geração bem sucedida de culturas tubuloides renais humanos pode ser avaliada por coloração imunohistoquímica para marcadores expressos no epitélio renal tubular, como a proteína gene 8 da caixa emparelhada.
Um tempo correto de digestão enzimática do material tecidual e processamento rápido de amostras de urina são etapas cruciais para o resultado bem-sucedido desses protocolos. A alta eficiência do estabelecimento de culturas tubuloides renais pode abrir caminho para testes específicos do paciente de nefrotoxicidade induzida por drogas, um efeito colateral comum de muitos quimioterápicos.
As culturas tubuloides renais humanos representam um modelo in vitro valioso para estudar fisiologia renal e doenças. Os tubuloides podem ser estabelecidos a partir do tecido renal (saudável e doente), bem como da urina, este último representando uma fonte facilmente obtida e menos invasiva de material de pesquisa.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved