Name: isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00
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Wir danken den Mitgliedern der Pathologie und Neurochirurgie an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für ihre Hilfe bei der Beschaffung von de-identifiziertem Hirngewebe und der Durchflusszytometrie CORE von ISMMS für die fachkundige Beratung. Die Studie wurde teilweise von NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (zu N.M.T.) und R61DA048207 (zu S.A.) finanziert.

HINWEIS: Das Programm zum Schutz menschlicher Probanden an der Icahn School of Medicine at Mount Sinai (ISMMS) und sein Institutional Review Board (IRB) gewährleisten die ethische Durchführung der Forschung und die Einhaltung von Bundes-, Landes- und institutionellen Vorschriften. In dieser Studie wurden alle verwendeten Post-mortem-Proben de-identifiziert, mit entsprechender Zustimmung durch das Biorepository erhalten und von der Bezeichnung "Humanforschung" durch das IRB des ISMMS (HS#14-01007) ausgenommen.
<p cl...

<ol>
	<li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain.">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li><li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. 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N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cerebral+cortical+neurogenesis+by+the+Pax6+transcription+factor.">Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).</li><li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurogenesis-controlling+factor,+Pax6,+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes.">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li><li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus.">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li><li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development.">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li><li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAX6:+25th+anniversary+and+more+to+learn.">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li><li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy.">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li><li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue:+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium.">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li><li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+&#945;A.">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin &#945;A.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li></ol>

Das experimentelle Design nach dem skizzierten Protokoll sollte unter Berücksichtigung mehrerer biologischer und technischer Faktoren abgeschlossen werden. Beginnende Gewebeproben sind frisch gefroren, ohne fixiert worden zu sein, und haben vorzugsweise ein kurzes postmortales Entnahmeintervall, um die Kernerholung zu maximieren. Erfahrungsgemäß ermöglicht ein PMI von bis zu 24 h eine adäquate Kernerholung; Ein PMI von 12 h oder weniger ist jedoch vorzuziehen, um die Erholung intakter Kerne zu optimieren. Zusätzlic...

Die molekulare Komplexität menschlicher Astrozyten ist im Primärgewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und Charakterisierung bei hoher Auflösung, sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitsbereich. Die Trennung intakter menschlicher Neuronen und Gliazellen von ihrer Nische hat sich aufgrund des begrenzten Zugangs zu frischen Hirngewebeproben, der stark miteinander verbundenen Natur von Glia- und neuronalen Prozessen und der unvermeidlichen zellulären Aktivierung während der Verarbeitung als schwierig erwiesen, die alle die molekulare Charakterisierung dieser Zelltypen ex vivoeinschränken 1 . Die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS) hat sich als Alternative zur Lebendzellsortierung herauskristallisiert und ermöglicht die Dissoziation und Immuntagsierung von Kernpopulationen aus gefrorenem Gewebe. In den letzten zehn Jahren wurde FANS häufig zur Isolierung und molekularen Charakterisierung menschlicher neuronaler (NeuN +) Kernpopulationen in einer Vielzahl von Gehirnproben und anatomischen Regioneneingesetzt 1,2,3,4.
Ähnliche Methoden zur Isolierung spezifischer Gliakern-Subpopulationen aus dem menschlichen Kortex waren jedoch begrenzt, was zu einem relativen Mangel an Raffinesse beim Verständnis der Astrozytenkomplexität sowohl in normalem als auch in erkranktem Gewebe führte. Zu diesem Zweck wurde ein zuvor veröffentlichtes Protokoll zur Isolierung menschlicher neuronaler Populationen mit FANS4 angepasst und eine Methode zur Anreicherung für Astrozyten (und für oligodendrogliale Vorläufer) unter Verwendung einer Dreifach-Antikörper-Kombination validiert, wobei Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen erfasstwurden 5. Um speziell für Astrozyten in der NeuN-Fraktion anzureichern, wurden Antikörper gegen einen von zwei Transkriptionsfaktoren verwendet, von denen bekannt ist, dass sie über Astrozytenpopulationen hinweg unterschiedlich exprimiert werden, PAX6 oder SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX9) 6,7. PAX6 wird während der frühen fetalen Entwicklung in radialen gliaähnlichen Vorläufern in Keimzonen hoch exprimiert und trägt sowohl zur Neurogenese und Gliogenese 8,9,10,11 als auch zur retinalen neuronalen Spezifikation 12 bei. Beim Erwachsenen ist PAX6 in ruhenden menschlichen Astrozyten6 differentiell überexprimiert und zeigt eine Proteinkoexpression mit glialfibrillärem saurem Protein (GFAP) in humanen Epilepsiegewebeastrozyten13.
Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Isolierung neokortikaler neuronaler und astrozytenangereicherter Kernpopulationen durch FANS. Frisches (nicht fixiertes) schockgefrorenes (d.h. frisch gefrorenes) postmortales Gewebe, das aus dem erwachsenen Kortex entnommen wird, wird zunächst mechanisch und chemisch dissoziiert. Nach der Lyse und Ultrazentrifugation in einem Saccharosegradienten werden die zytoplasmatischen und extrazellulären Komponenten verworfen, während die Kerne erhalten bleiben. Die Kerne werden dann mit fluoreszierend konjugierten Kernantikörpern markiert, die den gewünschten Ziellinien entsprechen, und mit FANS sortiert. Nach diesem Ansatz wird die Anreicherung von Astrozyten in den gesammelten PAX6+NeuN-Populationen demonstriert, validiert sowohl durch ein gezieltes qPCR-Panel als auch durch nachgeschaltete nukleare RNA-Sequenzierung.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS pH 7.2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>70013073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB377A5MI</td>
			<td>mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABN50A4MI</td>
			<td>mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9704-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-Line Counting Chamber</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td>3110V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Anhydrous</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>C614-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers, 40 &#181;M</td>
			<td>SP Scienceware</td>
			<td>136800040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Library Kit</td>
			<td>Illumina, Nextera</td>
			<td>FC-121&#8211;1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>BD FACSAria III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Acetate Tetrahydrate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>M13-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td>
			<td>Novus</td>
			<td>NBP234705J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td>
			<td>Clontech Laboratories</td>
			<td>635005</td>
			<td>Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J22638AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>non-ionic surfactant in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol LS Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10296028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td>reagent for isolation of RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter Optima XE-100</td>
			<td>A94516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td>referred to as distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15576-028</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adult human astrocyte populations from fresh-frozen cortex using fluorescence-activated nuclei sorting

Die Komplexität menschlicher Astrozyten ist im primären menschlichen Gewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und molekulare Charakterisierung. Die fluoreszenzaktivierte Nuclei Sorting (FANS) kann verwendet werden, um menschliche neuronale Kernpopulationen (NeuN +) erfolgreich aus gefrorenem Archivgewebe zu isolieren und zu untersuchen und so Probleme im Zusammenhang mit der Handhabung von frischem Gewebe zu vermeiden. Es fehlen jedoch Bemühungen, Astroglia in ähnlicher Weise vom nicht-neuronalen (NeuN-) Element zu isolieren. Eine kürzlich entwickelte und validierte Immunotagging-Strategie verwendet drei Transkriptionsfaktor-Antikörper, um gleichzeitig angereicherte neuronale (NeuN +), Astrozyten- (gepaart Boxprotein 6 (PAX6) + NeuN-) und Oligodendrozyten-Vorläufer- (OLIG2 + NeuN-) Kernpopulationen aus nicht erkranktem, frischem (nicht fixiertem) postmortalem humanem temporalem Neokortexgewebe zu isolieren.
Diese Technik erwies sich als nützlich für die Charakterisierung von zelltypspezifischen Transkriptomveränderungen im primären pathologischen Epilepsie-Neokortex. Transkriptomische Analysen bestätigten, dass PAX6+NeuN-sortierte Populationen robust für Pan-Astrozytenmarker angereichert sind und Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen einfangen. Dieses Papier beschreibt die FANS-Methodik zur Isolierung von Astrozyten-angereicherten Kernpopulationen aus frisch gefrorenen menschlichen Kortex, einschließlich der Gewebedissoziation in Einzelkernsussuspension (sn); Immuntagging von Kernen mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen NeuN und PAX6; FANS Gating-Strategien und Qualitätskontrollmetriken zur Optimierung der Sensitivität und Spezifität während der Sortierung und zur Bestätigung der Astrozytenanreicherung; und empfohlene Beschaffung für die nachgelagerte Transkriptom- und Chromatin-Zugänglichkeitssequenzierung in Massen- oder SN-Auflösung. Dieses Protokoll gilt für nicht-nekrotische, frisch gefrorene, menschliche kortikale Proben mit verschiedenen Pathologien und empfohlener postmortaler Gewebeentnahme innerhalb von 24 h.

Die Kerne wurden aus frischem (nicht fixiertem) schockgefrorenem temporalem Neokortexgewebe mit einer postmortalen Entnahmezeit von 12 h entnommen. Nach der Dissoziation des Gewebes in die Kernsuspension wurden die Proben mit Antikörpern gegen NeuN, PAX6 und OLIG2 inkubiert und nach dem in Abbildung 1 und Abbildung 2 gezeigten Gating sortiert. Kerne wurden aus NeuN+, PAX6+NeuN- und OLIG2+NeuN- sortierten Populationen gesammelt (Abbildung 1E...

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Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.

Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Dieses Protokoll kann Wissenschaftlern helfen, die daran interessiert sind, die molekulare Funktion menschlicher Astrozyten in ihrer Heimatnische zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Isolierung und Anreicherung eines bestimmten Zelltyps, erwachsener Astrozyten, aus großen menschlichen Hirngewebeproben mittels fluoreszenzaktivierter Kernsortierung ermöglicht. Diese Methodik kann angewendet werden, um andere Zelltypen aus dem menschlichen Neokortex, wie Neuronen und Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, unter Verwendung anderer geeigneter fluoreszierender konjugierter Antikörper zu isolieren.Beginnen Sie mit der Sezierung von etwa 200 bis 400 Milligramm Gewebe aus einer frisch gefrorenen menschlichen erwachsenen Kortexgewebeprobe. Legen Sie das Gewebe in einen sieben Milliliter großen Glasgewebedouncer mit vier Millilitern eiskaltem Lysepuffer auf Eis und mahlen Sie das Gewebe etwa 50 Mal. Überführen Sie das Homogenat in ein 12-Milliliter-Ultrazentrifugen-Polypropylenröhrchen.Verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um 6,5 Milliliter eiskalten Saccharosepuffer in den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens zu geben, ohne die Grenzfläche zwischen Saccharose und Gewebehomogenat zu stören. Um die Kerne zu sammeln, zentrifugieren Sie das Lysat eine Stunde lang bei 101, 814 mal G und saugen Sie den Überstand und die Ablagerungen vorsichtig ab, ohne das Pellet zu stören. Geben Sie 0,1% BSA in PBS in das Ultrazentrifugenröhrchen für eine 10-minütige Inkubation auf Eis, bevor Sie das Kernpellet wieder suspendieren.Verwenden Sie dann Trypanblau, um die intakten Kerne unter einem Lichtmikroskop sichtbar zu machen und sicherzustellen, dass die Konzentration über 10 bis zu den fünften Kernen pro Milliliter liegt Für die fluoreszenzaktivierte Sortierung der isolierten Kerne fügen Sie etwa 20 Mikroliter der resuspendierten Probe zu einer Antikörperlösung hinzu, die Alexa Fluor 555 konjugierten Maus-Anti-NeuN-Antikörper enthält. Fügen Sie etwa 20 Mikroliter der resuspendierten Probe zu einer Antikörperlösung hinzu, die einen APC-konjugierten Maus-Anti-PAX6-Antikörper enthält. Nach einer einstündigen Inkubation bei vier Grad Celsius mit Schütteln, geschützt vor Licht, fügen Sie DAPI im Verhältnis 1:1000 zu allen Proben und Kontrollen hinzu.Um Kerne der entsprechenden Größe einzuschließen und rote Blutkörperchen und Ablagerungen auszuschließen, verwenden Sie ein Kontrollröhrchen, um die Zellen durch ihre vorderen und seitlichen Streubereiche zu verriegeln. Um die Singulettkernpopulation auszuwählen, gleiten Sie nach Vorwärtsstreubereich gegen Vorwärtsstreubreite oder -höhe und Seitenstreubereich für seitliche Streubreite oder -höhe aus. Gate von DAPI, um nur die intakten Nuclei-Singlets einzuschließen und alle Trümmer und Dubletten auszuschließen.Nach dem Gating gemäß zusätzlichen Fluoreszenzkontrollen führen Sie die reine DAPI-Kontrollprobe aus. Führen Sie die NeuN Alexa fluor 555-only-Steuerung aus, um den Grenzwert für die NeuN-positive Färbung im Alexa fluor 555-Kanal zu bestimmen. Führen Sie die PAX6-Nur-APC-Steuerung aus, um den Grenzwert für die PAX6-positive Färbung im APC-Kanal zu bestimmen.Nachdem alle Kontrollen ausgeführt wurden, schließen Sie die NeuN-positiven Zellen an, um die Neuronen zu sammeln, und schließen Sie die PAX6-positiven Zellen mit der NeuN-negativen Population an, um die Astrozyten zu sammeln. Gate und sammeln Sie alle zusätzlichen Glialpopulationen von Interesse aus der NeuN-negativen PAX6-negativen Population. Für die Bulk-Single-Nucleus-RNA-Sequenzierung fügen Sie nach dem Sammeln von 50.000 bis 500.000 Kernen in 0,04%BSA-ergänztem PBS zwei Milliliter Saccharoselösung, 50 Mikroliter einmolares Calciumchlorid und 30 Mikroliter einmolares Magnesiumacetat in die Probe ein.Bringen Sie das endgültige Volumen der Aufhängung mit PBS auf bis zu 10 Milliliter. Mischen Sie den Röhrcheninhalt durch Inversion und inkubieren Sie die Reaktion auf Eis für 15 Minuten. Pelletieren Sie die Kerne durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Kerne in einem Milliliter RNA-extrahierendem Reagenz.Dann wirbeln Sie das Rohr um, frieren Sie die Probe auf Trockeneis ein und lagern Sie die Kerne bei minus 80 Grad Celsius. Für die Bulk-Einzelkern-Transposase-akzeptable Chromatin-Sequenzierung sammeln Sie 50.000 bis 75.000 Kerne in 0,04%BSA-supplementiertes PBS in einem Mikrozentrifugenröhrchen, das mit 5%BSA beschichtet ist, und frieren die Kerne bis zu ihrer nachgelagerten Analyse ein. Neuronale, Astrozyten- und Oligodendrozyten-Vorläuferkernpopulationen können aus einer frisch gefrorenen postmortalen humanen temporalen Neokortexprobe sortiert werden, wie gezeigt.Einzelkern-RNA-Sequenzierungsstudien priorisierten PAX6 als einen der wichtigsten differentiell exprimierten nukleären Transkriptionsfaktoren sowohl in protoplasmatischen als auch in faserigen adulten Astrozyten-Subpopulationen. Nach der Sortierung können zelltypspezifische Transkriptomveränderungen im primären pathologischen Epilepsie-Neokortex charakterisiert werden. In dieser Analyse bestätigten transkriptomische Analysen, dass die PAX6-positiven NeuN-negativen Populationen für Panastrozytenmarker robust angereichert und für neuronale Marker erschöpft waren.Die Immunfluoreszenzfärbung kann verwendet werden, um die Co-Lokalisation von PAX6 mit glialem fibrillärem saurem Protein in menschlichen kortikalen Astrozyten zu bestätigen. Kürzere Post-mortem-Intervalle sind mit einer größeren intakten Kernerholung aus frischen Gewebeproben verbunden. Eine hohe Ausbeute an intakten Kernen kann aus gefrorenem Gewebe bis zu 24 Stunden postmortal gewonnen werden, aber nach 30 Stunden können nur sehr wenige intakte Kerne wiederhergestellt werden.Das Wichtigste, woran man sich erinnern sollte, ist, die PAX6-positive Population aus der NeuN-negativen Population zu bekommen, denn es gibt Neuronen, die auch PAX6 exprimieren, und wir wollen diese ausschließen. Diese Technik ermöglichte auch die Untersuchung von Astrozyten in epilepsiechirurgischen Hirnproben, was die molekulare Dysregulation menschlicher Astrozyten im Kontext einer bestimmten pathologischen Nische weiter aufklärte.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

An Optimized Procedure for Fluorescence-activated Cell Sorting FACS Isolation of Autonomic Neural Progenitors from Visceral Organs of Fetal Mice

Eine optimierte Methode für Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) Isolierung von Autonomic neuralen Vorläuferzellen aus inneren Organen des Fötus Mäuse

During development neural crest (NC)-derived neuronal progenitors migrate away from the neural tube to form autonomic ganglia in visceral organs like the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionelle Bildgebung Auditory Cortex bei erwachsenen Katzen mit Hochfeld-fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Isolation von unterschiedlichen Zellpopulationen aus sich entwickelnden Kleinhirn durch Mikrodissektion

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting FACS and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) und Genexpressionsanalyse von Fos-exprimierenden Neurone von Frische und Gefrorene Rattenhirngewebe

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Optimization of Laser-Capture Microdissection for the Isolation of Enteric Ganglia from Fresh-Frozen Human Tissue

Optimierung der Capture-Laser Mikrodissektion für die Isolierung der enterischen Ganglien aus menschlichem Gewebe Tiefkühlfrische

The purpose of this method is to obtain high-integrity RNA samples from enteric ganglia collected from unfixed, freshly-resected human intestinal tissue ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Isolierung von Erwachsenen Rückenmark Kerne für massiv parallele Single-Kern-RNA-Sequenzierung

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue FACS-RTT to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungs-Radioliganden-behandeltes Gewebe (FACS-RTT) zur Bestimmung des zellulären Ursprungs des radioaktiven Signals

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...